作为草甸草原的代表类型之一，贝加尔针茅（Stipa baicalensis）草原是欧亚大陆草原区亚洲中部亚区 的地带性植物群落^[1]。在我国主要分布在松辽平原、蒙 古高原东部的森林草原地带^[2]。作为呼伦贝尔地区的 主要草地类型，其不仅是当地畜牧业生产的重要物质 基础，而且是我国北方生态屏障的重要组成部分。由 于自20 世纪80 年代以来高强度的利用和不完善的 保护机制，贝加尔针茅草原已出现不同程度的退化， 草原的恢复重建迫在眉睫。

在生态恢复实践中，随着对地下部分重要性认识 的深入，土壤微生物在生态系统中的作用备受关注^[3,4]。 土壤微生物参与了有机质分解、腐殖质形成、养分转 化与循环等过程，它们在保持土壤生产力方面发挥着 至关重要的作用^[5]。土壤微生物是由众多微生物种群 组成的群落系统，其群落结构和多样性能够敏感地 反映生态功能和环境变化，是生态环境恢复的最先 锋者^[6,7]。养分添加一直以来是一项影响深刻的农业 措施之一，养分添加改变土壤的营养成分、理化性质， 影响着土壤微生态系统，从而对草原的生态系统功能 产生影响。因此研究不同养分添加方式对土壤微生物 多样性的影响，揭示土壤微生物对养分添加的响应关 系，为草地的合理利用、生物多样性保护和退化草地 恢复提供理论依据。

Biolog-Eco 微孔板分析法是一种基于碳源利用 的简便快速的分析方法，Biolog-Eco 微平板共有31 种碳源，通过微孔中四唑紫染料（MTT）显色反应来反 映微生物代谢作用^[8]，其单孔颜色变化率（AWCD）描 述了土壤微生物群落利用碳源的能力和代谢活性的 大小^[9]。它已经成为研究微生物群落功能多样性的常 规方法之一。孔滨等运用Biolog-Eco 分析方法研究 了黑土中微生物群落代谢特征对N、P、K 肥的响应， 发现施用N、P、K 肥均提高了黑土中细菌群落的碳 源代谢活性^[10]；齐莎等研究了内蒙古典型草原在连续 5 年氮磷肥施用下土壤微生物的变化，发现高氮 （N₂₈₀）和高磷（P₇₅）处理一方面显著降低了土壤微生 物利用碳源的能力以及微生物功能多样性，另一 方面也改变了土壤微生物利用碳功能群结构^[11]； Sarathchandra 等研究了草地土壤微生物对N、P 肥添 加的响应，表明氮养分添加提高了土壤微生物功能 多样性，而磷肥无显著影响^[12]。

国内外关于养分添加对土壤微生物功能影响的 研究也已经有了较多报道，但是并没有一个相对统一 的结论，况且由于土壤类型、地理环境等因素的不同， 提出的结论也会有所不同，而且针对贝加尔针茅草原 不同养分添加下土壤微生物群落功能方面的研究较 少。本试验通过运用Biolog-Eco技术，对贝加尔针茅 草原样地在不同养分添加方式下土壤微生物群落功 能多样性变化进行分析，以期探寻草地生态系统养分 添加的最优策略，为贝加尔针茅草原的生态恢复和保 护提供一定的理论依据和技术支撑。 1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验地为农业部环境保护科研监测所生态农业 研究室长期试验用地，具体概况在本研究室已发表 的文献著作中有详细描述，具体见参考文献^[2]。 1.2 试验设计与样品采集

试验设对照（CK）和7 种不同氮磷钾养分添加方 式（N、P、K 单养分添加方式，PK、NK、NP、NPK 不同组 合添加方式）8 个处理，将试验地划分成6 个区组，每 区组内有8个小区，按照随机数字表随机法确定每个 小区的处理。小区面积8 m×8 m=64 m²，区组、小区间 分别设5 m和2 m隔离带。肥料于2010 年开始每年 6 月15日、7 月15日两次施入，每次施肥50%处理水 平。氮磷钾肥分别为硝酸铵NH₄NO₃、重过磷酸钙 Ca（H₂PO₄）₂·H₂O、硫酸钾K₂SO₄，N、P、K施肥时均匀手 撒，施肥量均为10 g·m^-2；Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、B、 Mo 施肥量分别为6、3、17、2.5、1、1、0.1、0.1 g·m^-2，微 肥配成溶剂喷施，每个小区需水约13 L（全年增加的 水量相当于新增降水1.6 mm），对照样地和不施加微 肥的样地要喷施同样水量。微肥与K 肥同时添加，N 肥和P肥处理中不添加。

土壤样品在2013 年8 月进行采集，按照“随 机”、“等量”和“多点混合”的原则，在各个处理小区 内按照“S”型取样法选取6 个点，去除表面植被，取 0~20 cm 土壤混匀过筛，去除根系和土壤入侵物，采 用“四分法”选取1 kg 土壤装入无菌封口袋，冰盒冷 藏迅速运至实验室并将其分成两份。一份于冰箱中 -20 ℃低温保存，用于土壤微生物功能多样性分析； 另一份于室内自然风干后研磨过筛，用作土壤理化 性状分析。 1.3 土壤理化性状测定

土壤有机质测定采用重铬酸钾容量法，土壤全 氮、硝态氮、铵态氮均采用总有机碳/总氮分析仪测 定，全磷、速效磷分别采用硫酸-高氯酸消煮法、碳酸 氢钠法测定^[13]。 1.4 Biolog测定

测定主要基于Garland 和Mills^[14]的方法，略有改 动。称取10 g鲜土于高压灭菌的三角瓶中，之后再向 瓶中加入90 mL 0.85%无菌NaCl溶液，封口膜封口后 放入振荡器，以250 r·min^-1转速振荡30 min。取出后 静置10 min，吸取上清液5 mL 于新三角瓶（高压灭 菌）中，加45 mL 无菌NaCl 溶液稀释至10^-2，重复稀 释至10^-3。取150 μL 10^-3倍稀释液于Biolog-ECO微平 板孔中。之后将其置于28 ℃恒温箱中黑暗培养，每隔 24 h在Biolog 微孔板读数仪（BIOLOGInc.，USA）上读 取数值并记录，持续进行7 d。 1.5 数据分析

采用Garland 和Mills^[14]的方法计算单孔平均颜 色变化率：AWCD=∑（C₅₉₀-C₇₅₀）/31

Shannon-Wiener 物种丰富度指数：H=-∑Pi×lnPi

Shannon-Wiener 均匀度指数：E=H/Hmax=H/lnS

Simpson优势度指数：D=1-∑Pi²

式中：C₅₉₀为单孔在590 nm 下光密度值；C₇₅₀为单孔 在750 nm 下光密度值；31 为Biolog-Eco 微平板上供 试碳源的种类数；Pi为第i孔的相对吸光值与整个平 板相对吸光值总和的比值；S为颜色变化孔数。

试验结果的主成分分析和相关分析采用SPSS 16.0软件进行。 2 结果与分析 2.1 不同养分添加方式下土壤理化性质变化

不同养分添加方式下土壤理化性质变化如表 1。 结果显示，K、P、NK、NP、NPK 处理的土壤pH 较CK 无显著差异，而PK、N 处理显著低于CK。有机质含量 P处理最高，NP、NPK 处理最低，其余处理与CK 比较 差异不显著。硝态氮NK处理最高，N、NP处理与CK 无显著差异，其余处理显著低于CK，且P、PK 处理最 低。铵态氮N处理最高，P、NK、NPK 较CK 无显著差 异，且PK 处理最低。全磷P处理最高，NP、PK、NPK 处理次之，其余处理间差异不显著。速效磷NP、P、 NPK 处理最高，PK 次之，其余处理与CK 相比差异不 显著。

表 1 不同养分添加方式下土壤化学性质变化 Table 1 Soil chemical properties in different nutrient addition treatments

表选项

培养开始后，每隔24 h测定各处理AWCD 值，绘 制其随时间变化的动态图如图 1。培养24 h 之前 AWCD 值几乎为零，而24 h 后随着培养时间的延长， AWCD 值快速升高，说明24 h后碳源被迅速利用。不 同养分添加方式的AWCD 值增长速率各不相同，说 明各处理间微生物对碳源的利用能力有较大差异，微 生物代谢活性方面有很大差异。

图 1 土壤微生物群落AWCD随时间的动态变化 Figure 1 AWCD dynamics over incubation time

图选项

不同养分添加方式下土壤微生物群落利用单一 碳源能力的顺序从高到低依次为NP跃P跃NPK跃NK跃 N跃CK跃K跃PK。含有P的处理NP、P、NPK 和含有N 的 处理NK、N 的AWCD 值与CK 相比有较大提高，而 处理K、PK 的AWCD 值较CK 偏低。这说明含有P的 处理NP、P、NPK 和含有N的处理NK、N 与CK 相比， 微生物群落代谢较快，活性较强；处理K、PK 的代谢 相对较慢，活性相对较弱。 2.3 不同养分添加方式下土壤微生物群落功能多样 性指数

贝加尔针茅草原在不同养分添加方式下，土壤微 生物群落物种丰富度指数H、均匀度指数E和优势度 指数D 如表 2 所示。结果表明，微生物群落功能多 样性指数对不同养分添加方式的响应不同，群落功能 多样性发生了变化。含有P 的处理NP、P、NPK 和含 有N 的处理NK、N 的丰富度指数H均显著高于CK、 K、PK 处理，而均匀度指数E和优势度指数D含P 处 理（PK除外）和含N处理与CK 比较差异不显著。

表 2 不同养分添加方式下土壤微生物群落多样性指数 Table 2 Diversity indices of soil microbial communities in different nutrient addition treatments

表选项

利用培养96 h时的AWCD 值进行主成分分析。 初始载荷因子是反映碳源利用与主成分相关性强弱 的相关系数，载荷因子越高表示该类碳源对主成分 的贡献越大。Biolog-Eco 板上31 种碳源在前2 个主 成分上的载荷值见表 3（以PC1 载荷值降序排列）。 结果显示：对第一主成分（PC1）贡献较大的碳源种类 有7 个，主要包括3 种糖类、2 种氨基酸类和2 种其 他类；对第二主成分（PC2）贡献较大的碳源有3 个， 主要包括1 种糖类和2 种其他类。这说明在不同氮 磷钾养分组合添加条件下贝加尔针茅草原土壤微生 物的主要碳源是糖类、代谢中间产物及次生代谢物。

表 3 31 种碳源的主成分载荷值 Table 3 Loading values of principal components of 31 sole carbon sources

表选项

主成分累计方差贡献率一般要求达到85%^[15]，据 此共提取了11个主成分，累计贡献率达85.558%。其 中第1主成分（PC1）的方差贡献率为21.183%；第2主 成分（PC2）为11.596%；第3 至11 主成分贡献率分别 为9.128%、8.379%、7.203%、5.741%、5.467%、5.189%、 4.499%、3.806%、3.367%。选取前2 个主成分进行分 析，分别以PC1、PC2 为x 轴、y 轴，以各处理在2 个主 成分上的得分值为坐标绘制主成分分析图（图 2）。

图 2 不同养分添加方式土壤微生物碳源利用主成分分析 Figure 2 Principal components analysis of carbon utilization in different nutrient addition treatments

图选项

结果表明，不同养分添加方式的PC 值在PC 轴 上出现了明显的分布差异，整体可以分为3 大类： NP、P 处理，N、NPK 处理，CK、K、PK、NK 处理。NP、P 处理除有一点离散外，另外5 点分布在PC1 轴的正 方向上、PC2 轴的负方向上；N、NPK 处理除有一点离 散外，基本在PC1轴的负方向上、PC2 轴的正方向上； CK、K、PK、NK 处理除有两点离散外，其余分布在 PC1 轴的负方向上、PC2 轴的负方向上。不同养分添 加处理的分布差异表明，CK、K、PK、NK 养分添加处 理对PC1、PC2 相关碳源的利用量很少，利用能力偏 低；而NP与P添加处理之间相似，N 与NPK 添加处 理之间相似，且NP、P养分添加处理主要利用PC1 相 关碳源，N 与NPK 主要利用PC2相关碳源。 3 讨论

AWCD值高低反映了微生物群落代谢活性高低。 本研究结果表明，不同养分添加方式下土壤微生物 AWCD 值不同，对碳源的利用能力和代谢活性不 同。含磷添加处理（PK除外）NP、P、NPK 最高，含氮添 加处理NK、N 次之，CK、K、PK 处理最低。首先含氮添 加处理AWCD 值高于CK、K、PK 处理，分析其原因可 能为：一方面氮养分的添加可以改变土壤养分的有 效性以及调节土壤养分的储存和转化，改善土壤 C/N^[16,17]；另一方面还能为微生物提供大量的氮源，促 进微生物繁殖和土壤氮素的循环^[18]，而且氮养分添加 增加了土壤氮素供应，极大地增加了地上生物量，从 而使根系分泌物显著增加，进一步促进根系微生物的 生长繁殖。此外，含氮养分添加从多方面提高了微生 物碳源利用能力和代谢活性。其次含氮添加处理 AWCD 值低于含磷添加处理（PK 除外）NP、P、NPK， 分析其原因：由理化性质变化可知，含磷养分添加处 理提高了土壤速效磷含量，而有报道速效磷含量与蔗 糖酶活性为显著正相关，蔗糖酶可以把高分子量糖分 解成小分子，其活性反映了土壤有机碳分解转化的规 律^[19]，因此含磷养分的添加间接促进了土壤微生物对 有机碳源的分解利用。至于PK 处理AWCD值并不像 其他含磷添加处理显著提高以及NPK 处理低于NP 处理，可能与K 元素会影响氮磷养分的吸收效应有 关^[20]，因此NP 处理对土壤微生物代谢活性的提高效 果最好。

对土壤微生物多样性指数的分析表明，不同养分 添加方式下群落的丰富度指数（H）不同，含磷添加处 理（PK 除外）NP、P、NPK 和含氮添加处理NK、N 的丰 富度指数H 均显著高于CK、K、PK，且两类处理间差 异不显著。Sarathchandra等研究发现N养分添加处理 的丰富度指数（H）高于CK 处理^[12]，辜运富等研究认 为与对照相比，N、NP、NPK 养分添加处理均提高了土 壤微生物的数量^[21]，Aerts 等研究指出适当施磷土壤 中群落的生物多样性较高^[22]，分析认为原因可能在于 含氮或含磷养分的添加都会刺激某些细菌的生长^[23]， 对微生物的丰富度产生影响。毕江涛等研究认为植物 种类可显著影响土壤微生物的种群丰富度以及种群 之间的个体分配情况^[6]，夏北成等也指出植被使土壤 中的微生物种类更丰富，群落多样性更高^[24]，据此分 析，含磷添加处理（PK 除外）和含氮添加处理的丰富 度指数（H）均显著高于CK、K、PK 的原因也可能为含 氮或含磷养分的添加提高了植被植物多样性而间接 影响了土壤微生物多样性^[25]。因此，NP养分的组合添 加对微生物的丰富度指数提高的促进作用更大。不同 养分添加之间均匀度指数（E）、优势度指数（D）差异不 显著，可能是由于养分添加致使土壤中一些数量原本 较多的微生物类群减少而一些新的类群产生，进而保 持均匀度与优势度指数稳定。

主成分分析结果表明，贝加尔针茅草原在不同养 分添加方式下对第一和第二主成分相关碳源利用模 式和利用能力不同，CK、K、PK、NK 养分添加处理对 第一、二主成分相关碳源的利用量都很少，利用能力 偏低，而NP、P养分添加处理利用第一主成分相关碳 源的能力较高，N 与NPK 处理利用第二主成分相关 碳源的能力较高。第一、二主成分碳源都包括糖类和 代谢中间产物及次生代谢物。表明NP、P 和N、NPK 养分添加处理改变了土壤微生物的群落组成结构，致 使偏好糖类、代谢中间产物及次生代谢物为碳源的土 壤微生物群落的生长发育得到有效促进。刘伟等对毛 竹根际土壤DNA 的PCR-DGGE 分析也表明，不同养 分添加处理毛竹根际微生物的类群组成有差异^[26]。郑 华平等的研究表明不同养分添加改变了土壤营养成 分、植物多样性^[27]，据此分析，以上主成分分析结果的 原因可能为养分添加致使植物多样性改变，一方面植 物多样性影响了土壤中的碳分配以及土壤微生物功 能多样性^[28]，另一方面植物多样性提高产生大量根系 分泌物导致土壤微生物群落结构功能的改变^[29]。 4 结论

不同养分添加方式对贝加尔针茅草原土壤微生 物功能多样性影响不同，N、P、NP、NPK 养分添加方式 对土壤微生物代谢活性和物种丰富度指数有显著提 高，且有效提高了微生物群落碳源利用能力，有利于 土壤微生物群落功能多样性的提高。本研究为贝加尔 针茅草原合理的养分添加方式的探寻提供了一定的 理论基础。