苯醚甲环唑（Difenoconazole）属三唑类内吸性杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，广谱、高效、持效期长，具有良好的内吸性，同时具有很强的预防治疗保护作用^[1]。嘧菌酯（Azoxystrobin）是一类新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有高效、广谱、保护、治疗、铲除、渗透、内吸活性等特点，可用于茎叶、种子处理，也可以进行土壤处理^[2]。目前，苯醚甲环唑和嘧菌酯均被广泛应用于谷物、水稻、蔬菜和果树等多种病害的防治，且对作物具有很高的安全性^[3,4,5]。

农药在施用过程中由于喷洒和流失会进入附近的土壤和水体环境中^[6]，从而进一步污染土壤和水体，并引起土壤和水体中非靶标生物的中毒或死亡^[7]。目前，随着苯醚甲环唑和嘧菌酯的广泛应用，尤其是在水稻田中的大面积应用，使得水生生态系统面临这两种杀菌剂的污染程度也越来越严重^[8]。已有研究表明，苯醚甲环唑^[9]和嘧菌酯^[10]极易进入水体中，并累积浓度较高，且这种形式在亚洲国家的水稻田中更为严峻^[3,11]。生态毒性效应研究结果也表明，0.50 a.i.mg·L^-1的苯醚甲环唑使斑马鱼的体色显著加黑、心率降低^[12,13]；0.19 a.i.mg·L^-1的嘧菌酯严重抑制大型溞的生长^[10,14]，两种杀菌剂对水生生物的毒性均较高。

急性毒性试验是评价农药对非靶标生物毒性强弱的重要手段，也可以为长期毒性试验、致突变试验、生殖毒性试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息^[15]。在我国农药登记资料规定中，急性毒性试验数据也是申请农药登记的基本环境试验资料，同时也是开展农药环境风险评估的重要端点数据^[16]。目前，在农药环境风险评估中，斑马鱼是开展农药对鱼类急性毒性试验的重要生物材料，也是表征农药对水环境中非靶标生物影响的模式生物^[17]。

相同原药制成不同剂型后，由于所用助剂的差异，农药药效以及在植株上的分布、消解动态、环境行为和毒理等均不相同^[18]。目前，市场上苯醚甲环唑和嘧菌酯的单剂剂型主要有水分散粒剂、悬浮剂和悬浮种衣剂等。尽管这两种杀菌剂对斑马鱼的急性毒性研究已有报道，但这些研究结果主要以原药或某一剂型为主，不同剂型对于水生生物的毒性报道比较鲜见。本文采用半静态法研究了原药及三种代表性的苯醚甲环唑和嘧菌酯单剂制剂产品对斑马鱼的急性毒性效应，评价其对斑马鱼的生态风险，为这两种杀菌剂的科学合理使用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试农药

95%苯醚甲环唑原药、60%苯醚甲环唑水分散粒剂、400 g·L^-1苯醚甲环唑悬浮剂、3%苯醚甲环唑悬浮种衣剂，93%嘧菌酯原药、50%嘧菌酯水分散粒剂、25%嘧菌酯悬浮剂、10%嘧菌酯悬浮种衣剂，均由山东农业大学农药环境毒理研究中心提供。 1.1.2 供试生物

斑马鱼（Brachydonio rerio），购于山东省泰安市其鑫水族馆，体长（1.96±0.20）cm。在试验室条件下驯养7 d以上，每天光照12～16 h，及时清除粪便及食物残渣，死亡率保持在5%以下。驯养期间每天喂食1~2次市售成品饵料，试验前24 h停止喂食，试验期间不喂食。挑选体长均匀一致、健康活泼的个体用于试验。 1.2 试验方法 1.2.1 参比试验

以斑马鱼为生物试材，进行分析纯的重铬酸钾参比试验，参比物质重铬酸钾对斑马鱼24 h的LC₅₀值应处于200~400 a.i.mg·L^-1。 1.2.2 急性毒性试验

参照OECD试验准则^[19]和国家环保部颁布的《化学农药环境安全评价试验准则》^[20]，采用半静态法测定各农药制剂和原药对斑马鱼的急性毒性。根据预试验结果，按一定比例间距（级差应控制在2.2倍以内）设置7个试验浓度组，见表 1。先用蒸馏水将制剂稀释后得到母液（原药先用丙酮溶解配制成母液），依次用移液枪量取适量母液，置于装有2 L水的鱼缸内，搅拌均匀，最后定容至4 L（原药用含有0.1%的吐温80水溶液稀释），搅拌均匀即得所设定浓度。以不加药为空白对照，原药还要加设一个含有丙酮的0.1%吐温80水溶液作为溶剂对照（最高设定浓度中含的丙酮量）。每个处理3次重复，每重复10尾鱼，每隔24 h更换一次药液，试验期间不给食。试验开始后6 h内随时观察并记录试验用鱼的中毒症状及死亡数，其后分别于24、48、72、96 h观察并记录试验用鱼的中毒症状及死亡数，及时清除死鱼。用玻璃棒轻触鱼尾部无可见运动即可判定为死亡。

表 1 不同剂型苯醚甲环唑和嘧菌酯及其原药试验浓度 Table 1 Tested concentrations of technical material and different formulations of difenoconazole and azoxystrobin

表选项

试验用水为存放并去氯处理24 h以上的自来水，pH值为7~8，水中溶氧量为（8.0±0.5）mg·L^-1，水质硬度为2.4×10² mg·L^-1（以CaCO₃计），水温为（23±1）℃。 1.3 数据处理

试验结果用DPS V13.5统计软件处理，计算供试药剂对斑马鱼24、48、72、96 h的半致死浓度（LC₅₀）值和95%置信限。

根据各药剂对斑马鱼96 h的LC₅₀值，参考国家环保部《化学农药环境安全评价试验准则》^[20]对各药剂的毒性级别进行划分：低毒，LC₅₀>10 a.i.mg·L^-1；中毒，1.0 a.i.mg·L^-1<LC₅₀≤10 a.i.mg·L^-1；高毒，0.1 a.i.mg·L^-1<LC₅₀≤1.0 a.i.mg·L^-1； 剧毒，LC₅₀≤0.1 a.i.mg·L^-1。 2 结果与分析 2.1 参比试验

为验证试验方法的有效性，以斑马鱼为生物试材进行分析纯的重铬酸钾试验，测定结果表明24 h的LC₅₀值为313 a.i.mg·L^-1，95%置信限为234~335 a.i.mg·L^-1。试验结果在《化学农药环境安全评价试验准则》要求范围内，表明试验试材和体系符合要求，试验结果可靠。 2.2 不同剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的急性毒性效应

半静态测定结果显示，染毒后24 h内，不同剂量的苯醚甲环唑均可引起斑马鱼中毒和死亡现象。剂量越高，中毒症状出现越早，症状越明显，中毒斑马鱼出现反应迟缓、游速减慢、鳃部发红、侧游等症状。剂量越高、染毒时间越长，斑马鱼的死亡数也越多，死亡斑马鱼出现鱼体发白、身体弯曲、腹部肿大、鱼鳍张开、腮部淤血等症状，并沉于水底。

三种剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的急性毒性试验结果见表 2。试验结果表明，随着处理时间的延长，药后24、48、72、96 h的LC₅₀值逐渐减小，毒性越来越大。相同处理时间下，三种剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的LC₅₀值也不同。95%苯醚甲环唑原药对斑马鱼96 h的LC₅₀值最小，为1.05（0.93~1.13）a.i.mg·L^-1，毒性最大；其次为3%苯醚甲环唑悬浮种衣剂和400 g·L^-1苯醚甲环唑悬浮剂，对斑马鱼96 h的LC₅₀值分别为1.34（1.26~1.39）、1.44（1.37~1.52）a.i.mg·L^-1；60%苯醚甲环唑水分散粒剂对斑马鱼96 h的LC₅₀值最大，为2.72（2.68~2.76）a.i.mg·L^-1，毒性最小，其96 h LC₅₀值是95%苯醚甲环唑原药96 h LC₅₀值的2.59倍。

尽管三种剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的LC₅₀值不同，根据《化学农药环境安全评价试验准则》，95%苯醚甲环唑原药、3%苯醚甲环唑悬浮种衣剂、400 g·L^-1苯醚甲环唑悬浮剂和60%苯醚甲环唑水分散粒剂对斑马鱼的急性毒性级别均为中毒（表 2）。

表 2 不同剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的急性毒性试验结果 Table 2 Acute toxicity of TC and different formulations of difenoconazole to zebrafish

表选项

半静态测定结果显示，不同剂量的嘧菌酯均可引起斑马鱼中毒和死亡现象。剂量越高，中毒症状出现越早，症状越明显，中毒斑马鱼出现鱼鳃发红、浮出水面和游速加快等症状。剂量越高，染毒时间越长，斑马鱼的死亡数也越多，死亡斑马鱼出现鱼体发白、身体弯曲、鱼鳍张开、鳃部淤血等症状，并漂浮在水面。

三种剂型嘧菌酯及原药对斑马鱼的急性毒性试验结果见表 3。结果表明，随着处理时间的延长，药后24、48、72、96 h的LC₅₀值逐渐减小，毒性越来越大。相同处理时间下，三种剂型及原药对斑马鱼的LC₅₀值也不同。93%嘧菌酯原药对斑马鱼96 h的LC₅₀值最小，为0.67（0.64~0.72）a.i.mg·L^-1，毒性最大；其次为10%嘧菌酯悬浮种衣剂和25%嘧菌酯悬浮剂，对斑马鱼96 h的LC₅₀值分别为0.88（0.85~0.92）、1.03（0.98~1.07）a.i.mg·L^-1；50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼96 h的LC₅₀值最大，为1.60（1.10~1.81）a.i.mg·L^-1，毒性最小，其96 h LC₅₀值是93%嘧菌酯原药96 h LC₅₀值的2.39倍。

表 3 不同剂型嘧菌酯及原药对斑马鱼的急性毒性试验结果 Table 3 Acute toxicity of TC and different formulations of azoxystrobin to zebrafish

表选项

根据《化学农药环境安全评价试验准则》，93%嘧菌酯原药和10%嘧菌酯悬浮种衣剂对斑马鱼的急性毒性级别为高毒；25%嘧菌酯悬浮剂和50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼的急性毒性级别为中毒（表 3）。 3 讨论

虽然农药对斑马鱼的环境风险取决于毒性效应和环境暴露量两方面的因素，但在目前国内缺乏较为完善的农药环境暴露风险评估模型的情况下，农药对斑马鱼的急性毒性试验数据在一定程度上为农药的风险管理和科学合理用药提供了重要的参考依据^[16]。Mu等^[13]采用半静态法研究了96%苯醚甲环唑原药对斑马鱼不同生理阶段的急性毒性，对幼鱼、成鱼和胚胎的96 h LC₅₀值分别为1.17、1.45、2.34 a.i.mg·L^-1。郭晶等^[21]采用静态法测定95%苯醚甲环唑原药对斑马鱼成鱼的96 h LC₅₀值为2.43 a.i.mg·L^-1。本研究发现，95%苯醚甲环唑原药对斑马鱼成鱼的96 h LC₅₀值为1.05 a.i.mg·L^-1。尽管不同研究之间结果略有差异，但在毒性分级上没有差异，均为中毒。李鹏鹏^[22]采用静态法测定50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼成鱼的96 h LC₅₀值为1.746 a.i.mg·L^-1。本研究发现50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼成鱼的96 h LC₅₀值为1.60 a.i.mg·L^-1。尽管研究方法不同，但两者研究结果吻合程度较高。

不同制剂之间由于有效成分含量、剂型不同，对斑马鱼的急性毒性存在明显差异。本研究同时比较了苯醚甲环唑和嘧菌酯两种杀菌剂的原药及其不同剂型对斑马鱼的急性毒性，结果表明，不同剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的96 h LC₅₀值介于1.05～2.72 a.i.mg·L^-1之间，最高是最低的2.59倍；不同剂型嘧菌酯及原药对斑马鱼的96 h LC₅₀值介于0.67～1.60 a.i.mg·L^-1之间，最高是最低的2.39倍；制剂的毒性低于原药毒性；不同剂型的毒性从高到低依次为悬浮种衣剂、悬浮剂、水分散粒剂。才冰等^[16]研究也发现，苯醚甲环唑制剂对斑马鱼急性毒性的96 h LC₅₀值介于0.656～3.52 a.i.mg·L^-1之间，最高是最低的5.4倍。并认为水分散粒剂的毒性相对较低，有效成分含量低的制剂相对比含量高的制剂毒性高。

本研究结果表明，根据《化学农药环境安全评价试验准则》，苯醚甲环唑和嘧菌酯原药及其不同制剂对斑马鱼的毒性为中毒或高毒，对水生生物的毒性较大。同时，即使是相同含量、相同剂型、同一有效成分的不同制剂，由于不同生产厂家加工工艺的不同，也会出现毒性级别的差异^[16]。因此，在大田中使用这两种杀菌剂时，应合理选择剂型和产品，并严格控制剂量，尽可能减少这些药剂进入水域对鱼类和其他水体生物造成影响。 4 结论

（1）苯醚甲环唑和嘧菌酯不同剂型及其原药对斑马鱼的急性毒性不同，毒性从高到低依次为：原药、悬浮种衣剂、悬浮剂、水分散粒剂。

（2）不同剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的急性毒性级别均为中毒；25%嘧菌酯悬浮剂和50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼的急性毒性级别为中毒，而93%嘧菌酯原药和10%嘧菌酯悬浮种衣剂对斑马鱼的急性毒性级别为高毒。说明苯醚甲环唑和嘧菌酯对水生生物毒性较大，在田间应选择合适产品并正确使用。