硫丹是一种环戊二烯类广谱性有机氯杀虫剂，工业硫丹是由α-硫丹、β-硫丹两种异构体组成的混合物，含量比一般为7∶3，其在丙酮中的溶解度为33％。分子结构式如下：　　

硫丹具有触杀和胃毒作用，曾广泛用于棉花、果树、蔬菜和茶叶等作物虫害的防治。世界卫生组织（WHO）估测1984年全世界的硫丹生产量为10 000 t。我国从 1994 年开始生产和使用硫丹，多年的施用使得我国大部分地区土壤和水体中都有不同程度的硫丹残留和积累^{[1, 2, 3, 4]}。在环境中，硫丹具有较高的持久性和迁移潜力，在土壤中的半衰期一般为3~6个月。由于硫丹具有生物毒性，高浓度硫丹残留会对微生物和土壤酶活性有较强的毒害作用，抑制了土壤微生物和酶对硫丹的降解，其降解速率会随初始浓度的增加而减慢^[5]。

土壤生态系统的活力是农业可持续发展的首要前提，土壤质量被认为是评价环境质量、食品安全和经济活力的综合指标。因此，土壤常被作为土地可持续管理的潜在评价指标。土壤酶是土壤新陈代谢的重要因素，它与活着的微生物细胞一起推动物质转化。土壤生物化学反应几乎都是由土壤酶驱动的，在C、N、S、P等元素的生物循环中都有土壤酶的作用。土壤微生物在生态系统物质循环和能量转化中占有特别重要的地位，几乎所有的土壤过程都直接或间接地与土壤微生物有关^{[6, 7]}，因此，微生物在土壤中的分布与活动，能反映土壤各因素对微生物的生态分布、生物特性以及对其功能的影响和作用，揭示土壤生态系统的现状和趋向。土壤微生物群落对于土壤特性的变化非常敏感，故土壤微生物群落变化可以作为评价土壤生态系统可持续性的生物学指标^[8]。

硫丹在土壤中的残留势必影响土壤酶活性，目前研究涉及的土壤酶有脱氢酶、荧光素二乙酸脂水解酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、固氮酶、芳基硫酸酯酶和β-d-葡糖苷酶等^{[9, 10]}，但硫丹对棕壤中微生物群落及酶活性的影响鲜见报道。本实验以低浓度（0~10 mg·kg^-1）硫丹染毒土壤，分别测定棕壤中脲酶、脱氢酶和β-葡糖苷酶的变化，并且通过从土壤中抽提微生物总DNA，扩增细菌16S rDNA 特异性片段，应用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE），分析土壤细菌特异基因多态性，旨在揭示低浓度硫丹对棕壤中细菌群落结构的影响，并且为进一步探究硫丹对土壤生态系统的影响提供依据。

以采自山东农业大学试验田（36°10′N，117° 9′E）的棕壤为供试土壤，五点法取样，采集时除去土壤表面的杂草、枯叶和1 cm左右的表层土，采集深度为0~15 cm，过2 mm筛。土壤的基本理化性质见表 1。

表 1 供试土壤的理化性质 Table 1 Physical and chemical characteristics of soil studied

表选项

据调查，本实验中供试棕壤没有有机氯类农药使用历史，本实验前，采用气相色谱法^[11]测定了供试棕壤中硫丹含量，结果为未检出。

实验用硫丹原药购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度为 96%；丙酮、氯化2，3，5-三苯基四唑（TTC）、硝基酚等试剂均为分析纯。

熊佰炼等^[17]研究表明，α-硫丹、β-硫丹在土壤中的半衰期分别为32~99 d和69~116 d，随硫丹初始浓度不同而发生改变。Kong等^[11]研究表明，当硫丹初始浓度为54.54 mg·kg^-1时，α-硫丹、β-硫丹的半衰期分别为53.3 d和70.7 d。本实验参考以上研究结果，设定实验硫丹浓度分别为0.1、1、10 mg·kg^-1，并设溶剂（丙酮）对照，实验设定3次重复。培养时间分别为7、14、21、28 d。土壤含水量控制为田间最大持水量的60%，每隔3 d调节一次土壤含水量。

本实验用靛酚蓝比色法^[12]，通过测定反应产生的氨量，计算土壤脲酶的活性。以每克干土培养24 h后NH⁺₄-N的微克数（μg NH⁺₄-N·g^-1 soil·h^-1）表征。

脱氢酶的活性用Tabatabai介绍的TTC分光光度法测定^[13]：称取20.0 g土壤置于50 mL三角瓶中，加2.0 mL 1%氯化2，3，5-三苯基四唑（TTC）溶液，再加水至土壤最大持水量的90%，充分混匀后塞上塞子，放入37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，加25 mL甲醇，振荡5 min，先用塞有脱脂棉的玻璃漏斗过滤，再用甲醇多次洗涤滤斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液，甲醇定容至100 mL，摇匀后在485 nm下比色测定其吸光值。酶活性单位为μg TTC·g^-1·h^-1。

本实验用硝基酚-β-D-葡糖苷作底物，采用硝基酚比色法^[14]，测定土壤中β-葡糖苷酶活性。

采用POVERSOIL土壤DNA 提取试剂盒（上海生工），称取 0.5 g于-20 ℃保存的染毒土样，按操作步骤提取土壤微生物总 DNA。采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对粗提DNA进行纯化。将提取纯化得到的DNA样品与1 μL 6×Loading Buffer 混合，加入1.2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，λ-Hind digested Marker加入一端点样孔中，对提取的 DNA 进行电泳检测，在Bio-Rad的GelDoc XR 凝胶成像系统中观察纯化效果。

扩增采用可检测环境中数量较低微生物的巢式PCR（Nested PCR）扩增策略。第一次PCR引物为27 F和1492 R，第二次PCR引物为细菌16S rDNA V3区的338 F-GC和518 R^[18]。扩增体系为50 μL，其中：10×PCR Buffer 5 μL；Mg²⁺ 5 μL；dNTPs（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 2 μL；Primers（27 F，1492 R；10 μmol·L^-1） 2 μL×2；模板DNA 1 μL；Taq 酶（5 U·μL^-1） 1 μL；ddH₂O 32 μL。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃ 退火 1 min ，72 ℃ 延伸1.5 min，25个循环； 72 ℃，10 min，最后于4 ℃恒定保存。

取PCR 产物35 μL 进行 DGGE 分析，变性剂梯度范围为 30%~60%，自配的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%（100% 的变性剂为7 mol·L^-1 尿素和 40% 的去离子甲酰胺）。 在1×TAE 缓冲液中，70 V、60 ℃缓冲液中电泳 14 h。 电泳后采用银染法进行染色，染色完成后，小心转移凝胶至凝胶成像系统，采用BIO-RAD公司的GelDoc XR 凝胶成像系统，在紫外光下成像，拍照，分析指纹图谱。

对DGGE图谱上的优势条带进行割胶回收。对于选定的每个条带，只选择中间部分进行切割，回收的条带转移到1.5 mL离心管中，用枪头挤碎，加入60 μL灭菌的ddH₂O，4 ℃过夜处理，释放DNA。次日12 000 r·min^-1 离心 5 min，收集上清液。取1 μL上清液为模板，以不含GC夹的引物（338 F和518 R）按照1.4.2中的PCR反应体系和程序再次进行PCR扩增。

将上述 PCR产物连接到pMD18-T Vector 载体（Takara，大连）上，转化到 E. coli DH 5 α感受态细胞中，然后用移液器吸取一定体积已转化的感受态细胞，加到LB固体琼脂培养基（Amp+）上，用无菌的涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开，挑取单菌落，37 ℃、180 r·min-1摇床培养10~12 h，取1μL的 LB液体培养基为模板，按照1.4.2中的细菌扩增的反应体系和程序进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验连接效果。连接效果检测呈阳性的菌液，包装后送生工生物工程有限公司（上海）进行测序。

根据测序结果，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行同源性比对分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），获得与本实验所得序列相似性最高的序列，确定硫丹污染导致数量和种类发生变化的细菌种类，使用 MEGA 软件中的 Kimura 双参数修正模型进行系统发育树的构建。

用 Microsoft Excel 2003进行基本的数据处理和作图，用 SPSS 17.0进行统计分析与显著性检测。

硫丹对土壤脲酶活性的影响如图 1所示。土壤脲酶的活性变化不显著，在整个实验处理周期中，处理组与对照组相比，脲酶活性没有出现显著性差异（P<0.05），说明本实验浓度下硫丹对棕壤中脲酶活性没有显著影响。

不同字母表示同一暴露时间内不同浓度硫丹处理组脲酶活性的显著性差异 （P<0.05 ） 。下同图 1 硫丹对土壤中脲酶活性的影响 Figure 1 Effect of endosulfan on urease activity in soil

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硫丹对土壤脱氢酶活性的影响如图 2所示。在整个实验处理周期中，与对照组相比，硫丹处理组棕壤中脱氢酶的活性明显下降，呈现显著性差异（P<0.05）。且这种抑制作用随着硫丹染毒浓度的升高、培养时间的延长越发显著，说明土壤脱氢酶的活性受硫丹影响较大。 硫丹对土壤中β-葡糖苷酶活性的影响如图 3所示。在整个实验处理周期中，与对照组相比，硫丹处理组土壤β-葡糖苷酶的活性增加，出现显著性差异（P<0.05）。在处理后7、14、21 d时随着硫丹浓度的增加，β-葡糖苷酶的活性增加；在28 d，1、10 mg·kg^-1硫丹处理组之间没有显著差异。总体来说，土壤β-葡糖苷酶的活性受硫丹影响较大。

总体来说，低浓度硫丹对棕壤脲酶活性没有显著影响，低浓度硫丹处理对棕壤脱氢酶活性和β-葡糖苷酶活性则呈现出一种完全相反的作用。低浓度的硫丹可以抑制土壤脱氢酶的活性，刺激棕壤β-葡糖苷酶的活性，抑制和刺激作用均随着硫丹浓度增大和培养时间的延长而增大。

图 2 硫丹对土壤中脱氢酶活性的影响 Figure 2 Effect of endosulfan on dehydrogenase activity in soil

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图 3 硫丹对土壤中 β-葡糖苷酶活性的影响 Figure 3 Effect of endosulfan on activity of 茁-glucoside enzyme in soil

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低浓度硫丹对棕壤细菌群落结构影响的DGGE指纹图谱如图 4所示。不同的泳道代表不同的处理天数及不同硫丹处理浓度下的样品，泳道中条带数目的多少反映样品中细菌群落的多样性。从图 4可以看出：7 d时，硫丹处理组与对照相比仅条带B5亮度变暗；14 d时，1 mg·kg^-1硫丹处理组中条带B3和B7与对照组相比亮度增加；21 d和28 d时，从条带亮度来看，硫丹处理组与对照相比，没有显著差异。 0~10 mg·kg^-1的低浓度硫丹处理对棕壤中细菌群落结构没有产生强烈的干扰作用。

CK 为 0 mg·kg-1处理组； S0.1 为 0.1 mg·kg-1处理组； S1 为 1 mg·kg-1处理组； S10 为 10 mg·kg-1处理组，标记条带用于切胶、 回收、 测序 CK,S0.1,S1 and S10 represent soil contaminated by endosulfan at 0,0.1,1,and 10 mg·kg-1,respectively. The labeled bands were excised from the gel,preamplifier,and subjected to sequence analysis 图 4 硫丹处理土壤中细菌 DGGE 电泳 DNA 指纹图谱 Figure 4 DGGE profiles of bacteria in soil samples amended with endosulfan for different incubation time

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根据实验棕壤中细菌群落的DGGE图谱，选择B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7共七个亮度清晰明显的条带进行切胶回收，并运用BLAST程序与GenBank数据库进行比对分析，确定相似菌种。BLAST相似菌株分析结果如表 2所示，16S rDNA分析测序结果构建的系统发育树如图 5所示。结果表明，条带B1、B5和B6属于厚壁菌门，且相似性在96%以上；条带B2、B3和B4属于变形菌门，且相似性在94%以上；条带B7属于放线菌门，且相似性为93%。

表 2 切胶回收细菌 DGGE 条带的测序结果 Table 2 Comparison of genomic sequences in excised DGGE bands by sequencing and BLAST

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Bootstrap 值为 1000 次重复 Bootstrap test was based on 1000 replicates 图 5 细菌 DGGE 条带及其相似序列的 16S rDNA-V3 序列的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA-V3 fragments retrieved from DGGE bands and their close relatives in the GenBank

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在适宜的温度、含水量和 pH 值条件下，土壤酶具有促进土壤养分溶解、提高各种生物化学过程反应速率、加快微生物代谢过程等显著作用。Nasreen 等^{[15, 16]}的研究表明，硫丹施用量为10~75 mg·kg^-1时对黑粘土中脲酶起激活作用；熊佰炼等^[17]的研究表明硫丹施用量为10~100 mg·kg^-1时可抑制紫色土中脲酶活性。本研究中发现硫丹处理浓度为0.1~10 mg·kg^-1对棕壤中脲酶活性无显著影响，说明硫丹对土壤脲酶活性的影响与土壤类型有关。这与Giri 等^[18]研究的在草甘膦或百草枯的作用下，不同类型土壤中脲酶活性出现被抑制和激活两种截然不同的结果相一致。在本研究中土壤脱氢酶活性随着硫丹染毒浓度的增加而降低，说明硫丹的生物毒性较强，不易被降解转化，而且在一定程度上用土壤酶活性表征土壤污染程度比用生物表征更敏感。硫丹影响土壤酶活性可长达数月，作用结果表现为持续抑制、持续激活、激活与抑制作用随时间变化等 3 种形式^[19]。本研究中硫丹的施入对棕壤中参与碳循环的β-葡糖苷酶的活性有激活作用，且随着浓度升高，激活作用增强。这与沈芳芳等^[20]的研究结果一致，其原因是土壤β-葡糖苷酶作为参与土壤中碳水化合物水解的一类重要的酶，与土壤有机质的转化关系密切^[21]，低浓度硫丹可以作为碳源促进土壤中有机质的转化。

目前，DGGE指纹图谱技术已经被广泛用于分析不同基质中的细菌、真菌等微生物的群落结构变化。基于细菌16S rDNA具有的保守特点^{[22, 23]}，本文选择两种土壤细菌的通用型引物338 F and 518 R^[24]，研究硫丹染毒后土壤中细菌群落结构多样性的变化。本研究中细菌的DGGE指纹图谱显示，在培养时间内硫丹对土壤细菌菌落组成结构没有显著的影响，系统发育树结果表明，土壤中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes），另有少量为放线菌门（Actinobacteria）对硫丹污染相对敏感。总体来说，硫丹对土壤细菌群落结构有一定的影响，但是影响不明显。

（1）低浓度硫丹处理条件下，与对照相比，棕壤中脲酶活性在四个取样时间中均没有表现出显著差异；随硫丹污染浓度增大，在各个取样时间中，土壤脱氢酶活性被显著抑制，β-葡糖苷酶活性被显著激活。

（2）DGGE图谱的分析结果表明，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和少量放线菌门（Actinobacteria）中部分细菌对硫丹污染相对敏感，总体来说硫丹对土壤细菌群落结构的影响不明显。