2013年转基因作物种植进入第18年，种植面积增加至1.72亿hm2，成为现代农业史上采用最为迅速的作物技术^[1]。转基因作物的大面积种植给人们带来了可观的经济效益，但其种植对生态系统潜在的影响也受到了关注^[2]。土壤微生物是土壤生态系统中物质能量循环的主要驱动力，能够表征土壤质量变化，决定着土壤的健康和稳定^[3]。转基因作物种植是否会对土壤生态系统产生影响，尤其是对土壤生态系统的重要组成部分——土壤微生物产生影响，成为人们关注的热点^[4]。氨氧化微生物是土壤硝化作用的限速步骤氨氧化作用的主要执行者，对环境变化具有选择特异性，可以作为潜在的土壤质量生物学指标，常被用于研究土壤微生物对环境变化的响应^{[5, 6, 7]}。最初研究认为氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）是执行氨氧化作用的主要微生物^[8],而随着氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）在海水和土壤中被发现^{[9, 10]}，AOA在硝化过程中所发挥的重要作用被人们所认识。因此，充分认识AOB和AOA共同对环境变化的响应将为研究环境变化对生态系统的影响提供重要依据。

中国作为棉花种植大国，转基因抗虫棉花成为主要种植品种，种植面积达到了420万hm2，成为种植面积最广的转基因作物^[1]。随着转基因抗虫棉花的大面积商品化生产，其环境风险日益受到人们的重视。目前对转基因抗虫棉花环境风险的研究已在多方面开展，如对农田非靶标害虫及天敌等昆虫的影响^[11]，对土壤微生物结构和功能多样性的影响^{[12, 13]}，对土壤真菌多样性的影响^{[14, 15]}，基因水平转移（Horizontal gene transfer）^[16]，外源蛋白残留情况及动态变化^{[17, 18, 19]}，外源重组DNA土壤分布情况^[20]以及基因流（Gene flow）^[21]等。但转基因抗虫棉花长期种植对土壤功能微生物的影响，特别是氨氧化微生物的影响研究不足。本研究采用T-RFLP和实时荧光定量PCR方法分析双价转基因抗虫棉花种植后土壤AOB和AOA群落结构和丰度的变化，并结合统计学分析，探讨其对土壤AOB和AOA群落结构和丰度的影响，为综合评价转基因抗虫棉花的环境风险性提供科学依据。

试验样地位于中国农业科学院武清转基因生物农田生态环境影响野外科学观测试验站，土壤类型为潮土。试验始于2011年，选择双价转基因抗虫棉花SGK321（转Cry1Ac和CpTI基因）及其亲本非转基因棉花石远321（对照）作为研究对象，每个棉花品种小区面积为25 m×30 m，各设置3次重复，随机区组设计，小区之间设置宽度为10 m的玉米保护行。氮肥总量为200 kg·hm^-2，钾肥总量为100 kg·hm^-2，磷肥总量为60 kg·hm^-2，其中氮肥基施60%、追施40%，磷肥和钾肥全部做基肥施入。采用常规管理，不施用农药。试验前此样地种植作物为玉米和小麦。

于棉花种植第3年的苗期（2013年6月7日）、蕾期（2013年7月22日）、花铃期（2013年8月21日）和吐絮期（2013年9月22日）采集土壤样品，分别标记为SY-1、SGK-1、SY-2、SGK-2、SY-3、SGK-3、SY-4和SGK-4（SY为石远321，SGK为SGK321）。在每个处理小区采用W形采样方法，随机选取10个点位，去除表层土后，用直径为2.5 cm的衬片式土壤采样器紧贴棉花主茎采集0~20 cm土壤，每个处理小区的所有土壤采集后装入1个灭菌自封袋中，混匀后放入低温样品储藏箱中带回实验室。一份土壤样品放入-70 ℃冰箱中，用于分子生物学分析；另一份土壤样品过2 mm筛后用于土壤理化性质测定。

全氮、全磷、速效磷、有机质、pH、土壤含水量测定方法见《土壤农化分析》^[22]。硝态氮和铵态氮采用连续流动注射分析仪（AA3-HR，SEAL，Germany）测定。土壤硝化势（Potential nitrification activity，PNA）的测定参见Ai等^[23]的方法。土壤理化性质和土壤硝化势的测定结果见表 1和表 2。

表 1 不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照土壤理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of soils grown with insect-resistant bivalent transgenic cotton and control cotton at different growth stages

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表 2 不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照土壤硝化势（mg·kg^-1·h^-1） Table 2 Potential nitrification activity（PNA） of soils grown with insect-resistant bivalent transgenic cotton and control cotton at different growth stages（mg·kg^-1·h^-1）

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4个生长时期共24份土壤样品各称取0.5 g用于土壤DNA提取，提取方法和步骤按照土壤DNA提取试剂盒（UltraCleanR DNA Isolation Kit，Mo Bio Laboratories，Solana Beach，CA，USA）的说明进行，最后用50 μL ddH₂O洗脱获得DNA样品。所获得的土壤DNA样品采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。 1.4 PCR扩增及T-RFLP分析

AOB和AOA分别采用引物amoA-1F/amoA-2R^[24]和Arch-amoAF/Arch-amoAR^[25]进行PCR扩增，其中上游引物amoA-1F和Arch-amoAF的5′端采用6-FAM进行标记，每个DNA样品3次重复。PCR反应体系（25 μL）包括：10×Buffer 2.5 μL，0.8 μmol·L^-1 dNTPs（TaKaRa），0.4 μmol·L^-1每种引物，0.1 mg·mL-1 BSA（TaKaRa），0.025 U·μL^-1 Taq Hot Start聚合酶（TaKaRa），1 μL DNA样品作为模板，加灭菌水补至25 μL。AOB PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 7 min。AOA PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega，USA）纯化，将3次重复的PCR纯化产物混合均匀。

纯化得到的AOB PCR产物采用限制性内切酶MspI（TaKaRa）进行酶切，纯化得到的AOA PCR产物采用限制性内切酶HhaⅠ（TaKaRa）进行酶切（条件为37 ℃ 3 h）。酶切产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行T-RFLP分析。T-RFLP数据分析时将大小相差为±1 bp的T-RFs合并为一个T-RF^[26]，T-RF的相对丰度（Relative abundance，Ra）按照Lukow等^[27]的方法计算，其3次重复值均大于1%的T-RFs用于T-RFLP分析，而大于10%的T-RFs为优势T-RF^[28]。 1.5 qPCR分析

细菌、古菌、AOB和AOA的丰度采用qPCR方法进行测定，每个DNA样品3次重复。qPCR反应体系（25 μL）包括：1×SYBR Premix Ex Taq^TM Buffer（Takara），200 nmol·L^-1每种引物，1×ROX reference dye Ⅱ（Takara），10 ng·μL^-1 T4 gene 32 protein（Roche，Laval，Quebec，Canada），1 μL 20倍稀释的土壤DNA（经验证此稀释倍比条件下PCR抑制效应可以忽略不计），ddH₂O补充至25 μL。qPCR引物信息见表 3。qPCR反应条件为：95 ℃ 1 min；35个循环包括95 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表 3），72 ℃延伸30 s。所有qPCR反应均于72 ℃延伸时收集荧光信号，并绘制熔解曲线（60~95 ℃，每扫描一次温度增加0.5 ℃），同时采用1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定PCR产物的特异性。所有qPCR反应均设置空白对照。

表 3 qPCR引物和反应条件 Table 3 Primers and reaction conditions for qPCR

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以提取的土壤DNA为模板进行PCR扩增获得上述目的基因片段。PCR产物纯化后，与pGEMT-easy Vector（Promega，USA）连接，并转化E. coli JM109感受态细胞，挑取白色阳性单菌落。将鉴定正确的阳性克隆于37 ℃培养后提取质粒DNA。以10倍梯度稀释质粒溶液制备成标准溶液进行qPCR，每个浓度重复3次，获得标准曲线。本研究中，4种目的基因标准曲线均具有良好的线性度，R2均大于0.99，扩增效率在87.1%~103.3%之间。　 1.6 数据分析　

qPCR反应数据采用MxPro-Mx 3005P v 4.00（Stratagene，USA）软件收集，并计算获得qPCR反应标准曲线。采用SPSS 16.0软件进行方差分析（One-Way ANOVA）以及相关性分析，处理间的差异性采用Duncan法，显著水平设定为P<0.05。AOB和AOA群落多样性用Shannon指数（H）和Evenness指数（EH）评价，计算公式如下：

H=-ΣPilnPi

EH= H/lnS 式中：H为Shannon指数；EH为Evenness指数；S为样品中T-RFs数目；Pi为第i条带峰面积占该样品总峰面积的比率。

采用Canoco 4.5软件包对T-RFLP结果与土壤理化性质间进行典范对应分析（Canonical Correspondence Analysis，CCA）。 2 结果与分析 2.1 土壤AOB和AOA群落结构和多样性变化

AOB PCR产物经酶切后主要得到57、89、155、226、235、247、249、256、489 bp这9种T-RFs（Ra>1%），其中57、235、256、489 bp片段所代表的T-RFs在土壤中占优势（图 1）。苗期时，双价转基因抗虫棉花土壤中235、489 bp片段百分含量显著低于对照（P<0.05），而247 bp片段百分含量高于对照，差异达到极显著（P<0.01）；蕾期时，双价转基因抗虫棉花土壤中256 bp片段百分含量显著高于对照（P<0.05）；花铃期时，双价转基因抗虫棉花土壤中57 bp片段百分含量显著低于对照（P<0.05），而256、489 bp片段百分含量显著高于对照（P<0.05）；吐絮期时，仅489 bp片段百分含量显著低于对照（P<0.05）。这说明，不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照间不同T-RFs所代表的AOB在各自的土壤中所占比例发生改变，但AOB的群落结构未发生明显改变。AOA PCR产物经酶切后主要得到8种T-RFs，大小分别为56、168、259、356、550、566、605、608 bp（图 1），其中168、259、550 bp片段所代表的T-RFs在土壤中占优势，且为双价转基因抗虫棉花和对照土壤中所共有。仅在双价转基因抗虫棉花土壤中发现56 bp片段所代表的AOA，说明此T-RFs为双价转基因抗虫棉花土壤所特有，但其所占比例很低，最高仅为1.33%。苗期和花铃期时，双价转基因抗虫棉花和亲本土壤中各T-RFs均无显著差异；蕾期时，双价转基因抗虫棉花土壤中356 bp片段百分含量显著低于对照（P<0.05）；吐絮期时，双价转基因抗虫棉花土壤中550 bp片段百分含量显著高于对照（P<0.05），而259、356 bp片段百分含量显著低于对照（P<0.05）。与AOB相同，双价转基因抗虫棉花和对照间代表不同AOA的T-RFs所占比例发生变化，但其群落结构未发生明显变化。

图 1 土壤AOB和AOA amoA基因的T-RFs百分比 Figure 1 T-RFs relative abundance of AOB and AOA amoA gene

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生物多样性指数是描述生物类型数和均匀度的一个度量指标，在一定程度上可反映生物群落中物种的丰富程度及其各类型间的分布比例^[34]。由表 4可以看出，不同生长时期对照土壤AOB的Shannon和Evenness多样性指数表现为先增高后降低的趋势，而双价转基因抗虫棉花土壤AOB的Shannon指数表现为先增高后降低再增高的趋势，而Evenness多样性表现为先降低后增高的趋势，与对照的变化趋势有所不同。显著性分析发现，双价转基因抗虫棉花和对照之间土壤AOB的Shannon和Evenness多样性指数无显著差异，而且不同生长时期间Shannon和Evenness多样性指数均未发生显著变化，说明土壤AOB的多样性并没有因为双价转基因抗虫棉花的种植而发生显著改变，而且未受到生长时期的影响。不同生长时期对照土壤AOA的Shannon和Evenness多样性指数表现为先降低后升高再降低的变化趋势，双价转基因抗虫棉花土壤AOA的Shannon指数表现为先升高后降低的趋势，而Evenness多样性表现为逐渐下降的趋势，与对照的变化趋势不同。显著性分析发现，双价转基因抗虫棉花和对照之间土壤AOA的Shannon多样性指数差异不显著，与AOB相同，而Evenness多样性指数有所不同，对照表现出较大的波动性，最大值（0.559）出现在苗期，最低值（0.482）出现在蕾期，而双价转基因抗虫棉花不同生长时期之间差异不显著，除苗期双价转基因抗虫棉花显著低于对照外（P<0.05），其他生长时期与对照均无显著差异。

表 4 土壤AOB和AOA的Shannon指数和Evenness指数 Table 4 Shannon index and Evenness index of soil AOB and AOA

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将土壤pH、硝态氮（NO-3-N）、铵态氮（NH⁺₄-N）、全氮（TN）、全磷（TP）、速效磷（AP）、有机质（OM）和含水量（SM）对土壤AOB和AOA群落结构的影响采用CANOCO软件进行CCA分析。结果（图 2）发现，双价转基因抗虫棉花和对照AOB群落结构均表现为与生长时期的相关性，从整体上可分为两种不同的聚类形式，即苗期和蕾期以及花铃期和吐絮期AOB群落可分别聚为一类。双价转基因抗虫棉花和对照土壤AOA群落则无明显的聚类形式，与AOB群落结构分析结果不同。双价转基因抗虫棉花和对照之间AOB群落结构均未发生分离，AOB群落结构变化与棉花生长期具有相关性，而不受双价转基因抗虫棉花种植的影响，与AOB相同，AOA群落结构也均未发生分离。经蒙特卡洛检验（Monte Carlo permutation test）发现，各理化因子中铵态氮和总磷含量的变化是AOB群落结构变化的主要影响因素（NH⁺₄-N=0.002 0；TP=0.008 0，P<0.05），而土壤有机质含量（OM=0.002 0，P<0.05）对AOA群结构变化有显著影响。

图 2 CCA分析土壤理化性质对AOB和AOA群落结构的影响 Figure 2 Canonical correspondence analysis（CCA） of effects of soil physico-chemical properties on AOB and AOA structure

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土壤AOB和AOA丰度的定量PCR结果见图 3。对照土壤AOB丰度随生长期呈现出先增加后减少再增加的趋势，而双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度表现为先增加后降低的趋势。对照土壤AOB丰度的最高值出现在吐絮期，为每克土壤1.21×108个拷贝数，最低值出现在铃期，为每克土壤7.88×107个拷贝数，而双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度最高值出现在花铃期，为每克土壤1.01×108个拷贝数，最低值出现在苗期，为每克土壤7.36×107个拷贝数。在苗期、蕾期和吐絮期，双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度均低于对照，而在花铃期高于对照，除吐絮期双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度极显著低于对照外（P<0.01），在其他三个生长时期均无显著差异。对照土壤AOA丰度与AOB变化趋势相同，为先增加后减少再增加，而双价转基因抗虫棉花土壤AOA丰度既与对照不同，也与AOB不同，表现为先增加后逐渐降低。对照土壤AOA丰度的最高值出现在蕾期，为每克土壤4.03×108个拷贝数，最低值出现在铃期，为每克土壤3.52×108个拷贝数，而双价转基因抗虫棉花土壤AOA丰度的最高值出现在蕾期，为每克土壤3.62×108个拷贝数，最低值出现在吐絮期，为每克土壤2.80×108个拷贝数。在整个生长时期，双价转基因抗虫棉花土壤AOA丰度均低于对照，其中在吐絮时期差异达到显著水平（P<0.05）。

图中不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05） Different lowercase letters indicate significant differences（P<0.05） between different treatments 图 3 土壤AOB和AOA丰度变化 Figure 3 Changes of soil AOB and AOA abundance

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表 5 土壤AOB与细菌、AOA与古菌以及AOB与AOA丰度比值变化 Table 5 Ratios of soil AOB/bacteria，AOA/archaea and AOB/AOA

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表 6 土壤硝化势（PNA）与AOB丰度、AOA丰度和AOB/AOA丰度比的相关系数 Table 6 Correlation coefficients between PNA and abundance of AOB and AOA genes and AOB/AOA ratio

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转基因作物的种植对土壤生态系统，尤其是对土壤微生物是否造成影响，一直受到科学界的关注^[4]。N素循环是陆地生态系统中物质能量循环的重要组成，氨氧化微生物（AOB和AOA）作为在N素生物地球化学循环中发挥重要作用的微生物类群，其群落结构变化能够反映陆地生态系统对环境变化的响应，已广泛用于微生物生态学研究^[35]。本研究将T-RFLP和qPCR方法相结合，分析了双价转基因抗虫棉花种植对土壤AOB和AOA群落结构和丰度的影响。

T-RFLP数据分析发现，AOB酶切片段中57、235、256、489 bp片段所代表的AOB为优势菌，这些片段比例的变化反映了不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照土壤中AOB群落结构的整体变化趋势。不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照土壤中不同T-RFs所占比例变化虽然各不相同，但优势AOB组成结构未发生明显改变，说明双价转基因抗虫棉花种植未对土壤AOB的群落结构产生显著影响，AOB群落结构的变化不仅与棉花品种有关，也受到生长期等其他环境因素的影响。AOA的T-RFLP分析结果与AOB相似，168、259、550 bp片段所代表的AOA为优势菌，存在于每个样品中，这些片段在不同生长时期和不同棉花品种土壤中所占比例变化也各不相同，AOA的群落结构则未发生明显改变，同样受到棉花品种和其他环境因素的影响。

对土壤AOB多样性指数分析发现，不同生长时期双价转基因抗虫棉花和对照之间Shannon和Evenness指数差异均不显著，而且不同生长时期之间也未表现出显著差异，说明双价转基因棉花种植对AOB多样性无显著影响，同时其多样性未受到生长时期的显著影响。与AOB相同，在不同生长时期土壤AOA的Shannon指数未发生显著变化，且在整个生长时期内均无显著差异，而Evenness指数表现有所不同，苗期Evenness指数双价转基因抗虫棉花显著低于对照，其他时期则无显著差异，同时苗期Evenness指数高于其他生长时期，其中与对照差异更是达到显著水平（P<0.05），分析认为这与苗期施肥有关。对土壤理化性质分析发现，苗期硝态氮的含量极显著高于其他时期，有研究认为AOA适宜在低能供应环境中生存^[36]，而在这种高能条件下，土壤中硝态氮含量的增加导致土壤pH值发生改变，AOA对此变化产生瞬时的响应，同时双价转基因抗虫棉花与对照可能产生不同的响应，导致其根系分泌物不同，这些变化虽然没有对Shannon指数产生显著影响，但Evenness指数所反映的均一性受到明显的影响，最终导致苗期Evenness指数显著低于对照。AOB由于较适应这种偏碱性的环境^[34]，其多样性指数均无显著变化。将AOB和AOA与环境因子进行典范对应分析（CCA），发现铵态氮和总磷含量的变化是AOB群落结构变化的主要影响因素，而AOA与有机质变化显著相关，说明在相同环境条件下AOB和AOA对不同环境因子的依赖性不同。

对AOB丰度分析发现，除花铃期双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度高于对照外，其余生长时期均低于对照，与董莲华等^[37]的研究结果一致。双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度除在吐絮期时极显著低于对照外（P<0.01），在其他三个生长时期均无显著差异。而对AOA进行qPCR分析发现，4个生长时期双价转基因抗虫棉花均低于对照，其中在吐絮期时差异达到显著水平（P<0.05），与AOB相同。AOB与细菌丰度的比值、AOB与AOA丰度的比值在整个生长时期均无显著差异，而AOA与古菌丰度的比值表现出差异性，而对比双价转基因抗虫棉花和对照，这3项指标均无显著差异。本研究中虽然AOA的数量要显著高于AOB，但AOB与AOA丰度的比值明显高于其他研究的结果^{[8, 38, 39]}，也说明偏碱性土壤更适宜AOB的生长。双价转基因抗虫棉花和对照土壤硝化势均呈现先升高后降低的趋势，除苗期双价转基因抗虫棉花高于对照外，其他时期均低于对照，且在蕾期和铃期差异达到显著水平，说明双价转基因棉花可能对土壤硝化势具有一定的抑制作用。这种抑制作用的产生可能是由双价转基因抗虫棉花根系分泌物与对照不同造成的^{[37, 40]}，这种抑制作用同时也反映在AOB和AOA的数量上。对硝化势进行相关分析发现，硝化势与AOB、AOA丰度均呈正相关变化趋势，而与AOB和AOA的比值呈负相关变化趋势，虽然均未达到显著水平，但仍可表明硝化势的变化可能与AOB和AOA数量变化具有协同效应，需要进一步研究说明棉花种植条件下土壤环境中AOB和AOA对氨氧化过程的贡献。

本研究从群落结构和丰度变化的角度，探讨了双价转基因抗虫棉花种植对土壤AOB和AOA的影响，但是由于T-RFLP方法的局限性，未能获得不同生长时期AOB和AOA的归属信息，不能从分类学角度系统分析双价转基因抗虫棉花种植对土壤AOB和AOA的影响。因此，今后在进行长期监测的同时，要结合多种先进的分子生物学方法，如高通量测序、SIP等^{[41, 42]}，在DNA和RNA水平上不仅针对细菌、古菌等微生物整体开展研究，更要针对具有生态学意义的功能微生物开展研究，更加全面地评价转基因抗虫棉花种植对土壤微生物的影响。 4 结论

双价转基因抗虫棉花对土壤AOB和AOA群落结构无显著影响。土壤铵态氮和总磷含量变化是土壤AOB群落结构变化的主要影响因素，而AOA群落结构变化与土壤有机质变化显著相关。除花铃期双价转基因抗虫棉花土壤AOB丰度高于对照外，其他3个生长时期均低于对照；而在4个生长时期，土壤AOA丰度均低于对照。在吐絮期时，双价转基因抗虫棉花与对照土壤AOB和AOA丰度差异显著。双价转基因抗虫棉花降低了土壤AOB和AOA的数量，并反映为对土壤硝化势的抑制，双价转基因抗虫棉花对土壤微生物的某些类群可能存在潜在影响。