长期以来，我国在矿产资源的开发，农用化肥、有机肥的施用，种、养殖业中畜禽粪便的排放以及工业化、城镇化进程中累积形成的重金属污染问题已逐步显现^[1]。因而，Cd在生态环境中的迁移已成为人类健康风险研究以及环境污染治理的重点和热点问题之一^{[2, 3]}。水稻作为我国的第一大粮食作物，其籽粒中的Cd含量直接影响到我国的粮食安全。

研究表明，Cd在水稻体内的积累和分配受到多个过程的影响，包括根系对Cd的活化和吸收、地上部茎叶之间的分配以及Cd在植株体内的区室化作用等^{[4, 5]}。郑陶等^[6]研究表明，当土壤Cd浓度达50 mg·kg^-1时，由于水稻Cd高积累材料根系向地上部的转移能力显著高于普通材料，造成两者地上部Cd含量差异较大。Uraguchi等^[4]通过比较两种籽粒Cd积累型水稻品种指出，木质部对Cd的运输能力是决定水稻地上部以及籽粒中Cd积累的主要过程。同时也有研究表明，水稻品种间籽粒Cd含量的差异主要与Cd在地上部的分配比率以及Cd从地上部向籽粒的迁移率显著相关^{[7, 8]}。基于Cd在组织水平上的研究，在细胞水平上植株主要通过区室化作用降低其体内Cd的移动性。国内外已有研究表明，在一些超富集植物中Cd主要分布于细胞壁，其次为可溶部分，细胞器含量最低^{[9, 10, 11]}。但在小麦、大麦和水稻等作物中，Cd的分布普遍表现为可溶部分＞细胞壁＞细胞器，且Cd高积累品种可溶部分所占的比例显著高于Cd低积累型品种^{[12, 13, 14]}，表明Cd的亚细胞分布对植株体内Cd的有效性有直接的影响。目前，已有不少研究^{[4, 5, 7]}对Cd在水稻各器官的积累和转运特征进行探讨，但基于Cd的亚细胞分布，并从微观层次探讨水稻对Cd的耐性机制还鲜见报道。本文通过分析水稻在不同生育期对Cd的吸收、分配及转运特征，结合分析其Cd的亚细胞分布特点，以探讨限制水稻Cd安全亲本材料对Cd的吸收转运可能存在的机制。 1 材料与方法 1.1 供试材料

供试材料为前期通过土培试验及大田试验筛选获得的水稻Cd安全亲本材料D62B和普通材料Luhui17。两类水稻亲本材料均为籼稻，生育期基本一致[（150±5）d]，其中D62B为保持系，Luhui17为恢复系，均由四川农业大学农学院提供。

供试土壤为冲积性水稻土，采自四川省成都市温江区，其基本化学性质为：pH6.50、有机质17.60 g·kg^-1、全氮1.12 g·kg^-1、碱解氮227.00 mg·kg^-1、速效磷9.64 mg·kg^-1、速效钾49.28 mg·kg^-1、土壤Cd全量0.31 mg·kg^-1。 1.2 试验设计与处理

土培试验于2013年5月至10月在四川农业大学有防雨设施的网室中进行。分别设置3个Cd处理水平： 1 mg·kg^-1（Cd1）、4 mg·kg^-1（Cd4）和16 mg·kg^-1（Cd16），每个处理重复9次，两个水稻亲本材料共54盆。供试土壤经风干磨碎过10目筛，在10 L的塑料桶中每盆装土10 kg（干土重），于秧苗移栽前30 d添加Cd处理。将相应量的 CdCl₂·2.5H₂O（分析纯试剂）配成溶液，与土壤混合均匀。所有盆钵按照完全随机排列并加水高出土面2~3 mm后陈化30 d，平衡后测定Cd1、Cd4和Cd16条件下土壤Cd有效量分别为0.31、1.62、5.44 mg·kg^-1。在移栽前一天进行施肥，其中氮（N）、磷（P₂O₅）、钾肥（K₂O）用量分别为200、100、105 mg·kg^-1土，分别选用尿素、磷酸二氢钾、氯化钾（均为分析纯）。

水稻种子经30%的H₂O₂消毒30 min后用清水冲洗干净，然后用0.1%的次氯酸钠溶液浸泡10 h，再冲洗干净。将种子转入35~38 ℃恒温培养箱中催芽，播种于已消毒的石英砂育苗盘中进行培养。在水稻出苗后，用1/4浓度的营养液进行浇灌培养，营养液选择国际水稻所常规配方。培养至三叶期选取长势一致的秧苗进行移栽，并按照常规管理，做好防病防虫工作并做好长势记录。

分别于分蘖期、抽穗期以及成熟期采样，每次采样3次重复。将植株样品分为两组，用自来水冲洗干净，根部在20 mmol·L^-1 Na₂-EDTA溶液中浸泡15 min以去除表面的Cd，再用蒸馏水润洗，最后用吸水纸擦干^[15]。第一组分为地上部和地下部，经液氮固定后储存于-75 ℃超低温冰箱中，以供亚细胞的测定；第二组分为地上部和地下部，105 ℃下杀青0.5 h后，75 ℃烘干后称重，最后用不锈钢粉碎机粉碎装样备用。 1.3 测定项目与方法 1.3.1 水稻亚细胞组分的分离

亚细胞的分离参照Wang等^[16]的方法，并略作改动。分别称取根系及地上部1.0 g鲜样，加入20 mL提取液，其组成为0.25 mol·L^-1蔗糖+50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH7.5）+1.0 mmol·L^-1二硫赤藓糖醇（C₄H₁₀O₂S₂），在研钵中冰浴研磨成匀浆。匀浆液在高速冷冻离心机（Model ALLEGRA-64R，Beckman Coulter. lnc. USA）4 ℃下以4000 r·min^-1离心15 min，沉淀部分为细胞壁部分。将上清液在16 000 r·min^-1离心30 min，底层碎片为细胞器部分。最后得到上清液为可溶部分（主要包括细胞质、有机物、无机离子和液泡内的大分子）。 1.3.2 Cd含量的测定

细胞壁和细胞器部分在70 ℃下烘干至恒重，采用HNO₃-HClO₄消化。植株Cd含量采用HNO₃-HClO₄消化，土壤有效态Cd含量采用DTPA提取，用火焰原子吸收分光光度计（AAnalyst 800，Perkin Elmer，USA）测定Cd含量，其中谷壳及糙米Cd含量采用石墨炉分析。以国家标准物质GBW10044 GSB—22为内标控制分析质量。 1.4 数据处理与分析

转移系数=地上部Cd含量/根系Cd含量；籽粒转移系数=籽粒Cd含量/茎叶Cd含量；吸收速率=（单位时间植株Cd积累量/根系干重）×100%；转运速率=（单位时间地上部Cd积累量/根系干重）×100%^{[6, 7]}。

数据采用DPS 11.0进行统计分析，LSD法进行多重比较；图表制作采用Origin 8.0和Excel 2007。 2 结果与分析 2.1 Cd对水稻亲本材料生物量的影响

由表 1可知，随着Cd处理浓度的提高，D62B及Luhui17生物量均有降低的趋势，且在Cd16处理下生物量最低。在Cd16处理下，Cd安全亲本材料D62B生物量在分蘖期、抽穗期和成熟期与Cd1处理相比，分别降低了52.05%、43.06%和32.34%，普通材料Luhui17则分别降低了59.08%、58.41%和34.52%。由降低幅度可知，D62B在整个生育期受到的胁迫程度要小于Luhui17，表现出D62B对Cd胁迫具有更强的耐性。

表 1 Cd 处理对水稻亲本材料生物量的影响（g·株^-1） Table 1 Effects of Cd treatments on biomass of rice plants（g·plant^-1）

表选项

结果表明（表 2），两类水稻亲本材料地上部和地下部Cd含量在分蘖期、抽穗期和成熟期均随Cd处理浓度的提高显著增加。D62B地上部Cd含量在Cd1、Cd4和Cd16处理下均显著低于Luhui17，且随Cd处理浓度的增加两水稻亲本材料间差异明显增加。当Cd处理浓度为16 mg·kg^-1时，D62B在各生育期地上部Cd含量分别为Luhui17的60.91%、67.98%和64.61%，差异达到最大。对地下部而言，D62B和Luhui17在三个生育期均未表现出显著差异。转移系数可用来体现植物从根系向地上部运输Cd的能力。由表 2可知，随着生育期的推进，两类水稻亲本材料向地上部转运Cd的能力均明显降低，且在分蘖期、抽穗期和成熟期D62B的转移系数均显著低于Luhui17。这说明D62B根系对Cd的固定能力强于Luhui17，继而体现出D62B地上部Cd含量显著低于Luhui17。

表 2 Cd 处理下水稻亲本材料 Cd 含量及转移系数的变化 Table 2 Cadmium concentrations and translocation coefficients of rice plants under different Cd treatments

表选项

由表 3可知，随Cd处理浓度的提高，D62B和Luhui17在成熟期其谷壳及糙米Cd含量均显著增加。其中在Cd1处理条件下，两水稻亲本材料的糙米Cd含量均小于0.2 mg·kg^-1。随着Cd处理浓度的提高，Luhui17的糙米Cd含量在Cd4处理条件下高达0.86 mg·kg^-1，为D62B的7.16倍，已严重超过食品安全国家标准 GB 2762—2012（Cd＜0.2 mg·kg^-1）。就籽粒转移系数而言，D62B在Cd4和Cd16处理下籽粒转移系数未表现出差异，Luhui17则随着Cd处理浓度的提高呈现先上升后下降的趋势，且D62B的籽粒转移系数在各个Cd处理浓度下均显著低于普通材料Luhui17，其中在Cd4和Cd16处理下，D62B分别比Luhui17低76.47%和66.67%。可见，安全亲本材料D62B不仅根系对Cd的固定能力强于Luhui17，其茎叶向籽粒运输Cd的能力也明显低于Luhui17，因而D62B具有籽粒Cd低积累的特点。

表 3 Cd 处理下成熟期水稻亲本材料籽粒各部分 Cd 含量及籽粒转移系数的变化 Table 3 Cadmium concentrations in grain and translocation coefficients of rice at mature stage under Cd treatments

表选项

由图 1分析可知，随Cd处理浓度的提高两水稻亲本材料对Cd的吸收速率显著增加，在Cd16处理下达到最大。当Cd处理浓度为16 mg·kg^-1时，D62B对Cd的吸收速率在分蘖期、抽穗期和成熟期分别为Cd1处理的2.85、4.90、9.00倍，Luhui17在三个生育期则分别为Cd1处理的2.39、5.49、8.54倍。但是，在相同Cd处理浓度下，两水稻亲本材料间对Cd的吸收速率差异并不显著。这表明两水稻亲本材料对Cd的吸收积累能力差异并不显著，造成其地上部Cd含量差异的原因可能是Cd在水稻体内的转运机制不同。

同种水稻亲本材料的不同小写字母表示不同处理间 差异显著 （P≤0.05 ），* 表示材料间差异显著 （P≤00.05 ）。下同图 1 Cd 处理下水稻亲本材料 Cd 吸收速率的变化 Figure 1 Rates of Cd uptake by rice plants under different Cd treatments

图选项

由图 2可知，随Cd处理浓度的提高，D62B和Luhui17对Cd的转运速率均显著增加。随着生育期的推进，两类水稻亲本材料对Cd的转运速率均显著降低。通过比较D62B和Luhui17的转运速率可知，在不同Cd处理浓度下，D62B对Cd的转运速率均小于Luhui17，且在高Cd处理浓度下差异达到显著。当Cd处理浓度为16 mg·kg^-1时，分蘖期D62B对Cd的转运速率为1.93 μg Cd·g^-1 RDW·d^-1，显著低于Luhui17（2.60 μg Cd·g^-1 RDW·d^-1）。抽穗期和成熟期D62B的转运速率分别为Luhui17的64.33%和65.15%。可见，高Cd处理浓度下，D62B能够通过自身根系对Cd的固定，降低Cd向地上部运输的可能，导致其转运速率显著低于普通材料，继而造成地上部Cd含量差异显著。

图 2 Cd 处理下水稻亲本材料 Cd 转运速率的变化 Figure 2 Cadmium translocation rates of rice plants under different Cd treatments

图选项

由表 4可知，水稻Cd安全亲本材料D62B地上部各亚细胞组分中的Cd含量表现为细胞壁>可溶部分>细胞器，且随着Cd处理浓度的增加各组分的差异明显加大。在Cd16处理下，D62B细胞壁Cd含量分别为可溶部分和细胞器的1.32倍和3.64倍。普通材料Luhui17则表现为可溶部分>细胞壁>细胞器，在Cd16处理下可溶部分Cd含量分别为细胞壁和细胞器的1.64倍和4.10倍。这表明两类水稻亲本材料地上部对Cd的解毒机制可能存在差异。比较两类材料地上部各亚细胞组分的Cd含量差异可知，D62B地上部可溶部分的Cd含量均显著低于Luhui17，在Cd1、Cd4和Cd16处理下分别为Luhui17的67.39%、54.17%和49.58%；细胞壁则在Cd1和Cd4处理下显著低于Luhui17，在Cd16处理下差异不显著，表明在高Cd处理浓度下细胞壁对Cd的固定作用在限制D62B地上部Cd的转运中起着重要作用。

表 4 Cd 在水稻亲本材料各部位亚细胞组分中的分布（mg·kg^-1FW） Table 4 Subcellular distribution of Cd in shoots and roots of rice plants（mg·kg ^-1FW）

表选项

对地下部而言，两类水稻亲本材料中Cd的亚细胞分布均表现为可溶部分>细胞壁>细胞器。且D62B在不同Cd处理浓度下可溶部分均显著低于Luhui17，相差达1.13～1.46倍。D62B细胞壁的Cd含量在Cd1和Cd4处理下显著低于Luhui17，但在Cd16处理下显著高于Luhui17，表明D62B在高Cd处理浓度下细胞壁对Cd的固定能力显著高于Luhui17，限制了Cd向地上部的移动。

结合图 3可知，随Cd处理浓度的提高，D62B地上部各亚细胞组分的分配比例变化不明显，Luhui17随Cd处理浓度的提高其可溶部分的分配比例显著增加，细胞壁的分配比例明显降低。比较两类水稻亲本材料可知，在Cd1处理下其亚细胞的分配比例差异不显著，但随着Cd处理浓度的提高，Luhui17可溶部分的分配比例显著高于D62B，在Cd16处理下差异最大。此时，Luhui17可溶部分的分配比例为D62B的1.44倍，细胞壁的分配比例仅为D62B的67.12%，表明D62B地上部对Cd的固定能力明显高于Luhui17，继而降低了Cd在地上部的有效性。对于地下部而言，两水稻亲本材料在Cd1和Cd4处理下其亚细胞组分的分配比例并无显著差异，但在Cd16处理下Luhui17细胞壁Cd的分配比例明显降低，表明D62B根系在高Cd处理浓度下对Cd的限制作用强于Luhui17。

图 3 Cd 在水稻亲本材料地上部和根系中分布的相对百分比 Figure 3 Proportion of subcellular distribution of Cd in shoots and roots of rice plants

图选项

在高Cd处理浓度下，植株常常会表现出根系生长受阻、水分和养分的吸收受抑制、光合强度和呼吸强度下降、碳水化合物代谢失调及其他一系列生理代谢紊乱，最终表现出生物量和产量的下降^{[17, 18]}。Obata等^[19]研究表明，当Cd毒害达到一定程度，植株就会表现出生长迟缓、植株矮小、褪绿等中毒症状，严重影响其产量。Liu等^[20]则指出，当土壤中Cd含量大于5 mg·kg^-1时，小麦的生长和结实状况已受到影响，当Cd含量达到50 mg·kg^-1时，其产量显著降低。本研究结果表明，在分蘖期当Cd处理浓度为1 mg·kg^-1时两类水稻亲本材料的生长并未受到影响，但当Cd处理浓度达到4 mg·kg^-1时，两水稻亲本材料的生长均已受到明显的抑制作用，生物量显著下降。已有研究表明，Cd对水稻的伤害程度会随着生育进程而减弱，继而对水稻生育后期干物质量合成的毒害作用相对较轻^[21]。本研究结果表明，分蘖期和抽穗期D62B和Luhui17的生物量降低幅度较大，成熟期的降低幅度较小。在Cd16处理下，成熟期两水稻亲本材料虽单株籽粒产量显著降低，但D62B的籽粒产量降低幅度依然低于Luhui17，表明D62B后期籽粒的形成受到的抑制作用低于普通材料，即表现出D62B对Cd具有一定的“适应”能力。 3.2 不同Cd处理下水稻亲本材料对Cd的吸收转运特征

研究表明，对于同一水稻品种，其各部位的Cd含量会随土壤Cd浓度的提高而增加，且根、茎、叶、籽粒间存在显著的相关性^[22]。对不同品种而言，尽管Cd在体内的分布依旧表现为根>茎叶>籽粒，但各器官间Cd含量的相关性很差，表明不同水稻品种对Cd的积累、分布存在显著差异^[23]。本研究结果表明，随Cd处理浓度的提高，两类水稻亲本材料Cd含量均显著增加，其根系Cd含量差异不大，但Cd安全亲本材料D62B茎叶以及籽粒Cd含量均显著低于普通材料Luhui17。Cd自根部向地上部迁移的能力是决定植株耐性的重要机制之一^[24]。即根系能够通过限制Cd向地上部的运输，降低Cd对地上部的毒害作用，从而提高作物的耐性。本研究结果表明，D62B根系向地上部的转移系数显著低于Luhui17，说明D62B根系对Cd的固持能力明显强于Luhui17，即表现出D62B根系对Cd具有一定的“忍耐”能力。

Kukier等^[25]研究发现，水稻体内Cd的吸收和转运是一个主动过程。李鹏等^[5]研究表明，水稻对Cd的吸收速率表现为幼穗分化前期>中期>抽穗后期。本研究结果表明，两类水稻亲本材料对Cd的吸收速率在分蘖期最强，抽穗期显著降低，到成熟期则趋于平稳。这主要是由于水稻分蘖期是营养生长的旺盛期，在该期间其形态建成较快，对养分的需求也最为强烈，因而在吸收营养元素时Cd会通过主动运输和被动扩散（浓度梯度）被水稻吸收。在不同生育期两水稻亲本材料对Cd的吸收速率均未表现出显著差异，表明两水稻亲本材料对Cd的日积累能力差异不显著。就转运速率而言，在高Cd处理浓度下D62B的转运速率均显著低于普通材料Luhui17，造成D62B地上部对Cd的积累能力较低。正是由于这种较低的转运能力，致使D62B在中低度污染土壤上的糙米Cd含量低于食品安全国家标准限值，表现出籽粒Cd低积累的特点。 3.3 Cd在水稻亲本材料中的亚细胞分布特征

本研究表明，在分蘖期水稻对Cd的吸收积累能力最强，因此水稻对Cd的解毒机制也更加明显。Cd在细胞壁的沉淀作用以及细胞内的区隔化分布是植物体内部解毒的两个重要途径^[26]。细胞壁是重金属进入细胞内的第一道屏障，Cd进入植株体后首先会被细胞壁固定，活性降低^[27]。对Cd超富集植物东南景天的研究表明，Cd主要分布在细胞壁当中（61.13%~63.14%），且矿山生态型所占的比例显著高于非矿山生态型^[28]。Ramos等^[26]对莴苣的研究也有相似的结果。但在小麦、大麦及水稻等作物中，细胞中的Cd主要分布于可溶部分，其次为细胞壁，仅有少量Cd分布于细胞器中^{[12, 13, 14]}。这可能是由于植物对Cd的解毒策略不同。本研究中，在两类水稻亲本材料地下部的Cd主要分布于可溶部分，D62B地上部主要分布于细胞壁，普通材料Luhui17则同样以可溶部分为主，表明D62B地上部细胞壁对Cd的固定能力要高于Luhui17，限制了Cd向细胞内的转移，继而减小了Cd对水稻植株的毒害作用，表现为D62B具有更强的耐性。 4 结论

（1）Cd安全亲本材料D62B在不同生育期对Cd的吸收积累能力与普通材料无显著差异，但Cd在植株体内的转运能力则显著低于普通材料，表现出Cd在其地上部的分配较低，成熟期糙米Cd含量显著低于普通材料Luhui17。

（2）当Cd处理浓度为1 mg·kg^-1和4 mg·kg^-1时，Cd安全亲本材料D62B的糙米Cd含量低于食品安全国家标准（Cd<0.2 mg·kg^-1）。当Cd处理浓度高于1 mg·kg^-1时，Luhui17已存在Cd暴露风险问题。因此，D62B作为Cd安全亲本材料可用于培育Cd安全水稻品种。

（3）D62B叶片Cd的亚细胞分布为细胞壁>可溶部分>细胞器，Luhui17为可溶部分>细胞壁>细胞器。根系中则均为可溶部分>细胞壁>细胞器。D62B对Cd的固持能力较强，降低了Cd在体内的有效性，减小了Cd在生育后期向籽粒转移Cd的可能。