抑食肼，又名虫死净，化学名称：N-苯甲酰基-N′-特丁基苯甲酰肼，代号RH-5849，1987年由美国罗门哈斯公司首次合成^[1]。该药是一种新型的昆虫生长调节剂，其作用机制主要是通过降低或抑制幼虫和成虫取食能力，加速昆虫蜕皮，减少产卵阻碍繁殖达到杀虫目的，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫具良好的防治效果^[2]，目前主要在水稻和叶菜上使用。另外，抑食肼对害虫有胃毒作用，并且具有内吸收性强、持效期长的特点，施药后2~3 d就能见效，对人、禽、畜、鱼毒性低，而且与其他农药无交互抗性，是一种可以取代高毒有机磷农药的低毒、无公害、无残留的优良杀虫剂，因而具有广阔的开发应用前景^[3]。然而，由于该药是一种具有蜕皮激素性能的昆虫生长调节剂，而且广泛在水稻田中喷雾使用，所以在达到杀虫目的的同时还可能对水体中的甲壳类生物带来一定的不利影响。

大型溞（Daphnia magna）是世界范围内广泛分布的甲壳纲枝角类无脊椎动物^[4]，它以浮游植物为食，同时又是鱼类和大型无脊椎动物的饵料，是水生态系统中物质循环和能量流动的重要环节^{[5, 6]}。由于其分布广、繁殖快、生活周期短、易于培养和驯化，对环境中的毒物敏感且实验方法简便，在国内外被广泛用作试验生物进行有毒污染物的水质基准研究，也是制定排放标准和监督废水/污水排放的最常用试验生物。药剂对大型溞急性毒性试验主要考察毒物的致死效应，慢性毒性试验则可以深入评价毒物的毒性强度^[4]。因此，通过研究抑食肼对大型溞的毒性效应，可以预测该药剂对水生生物的毒性。

目前，国内关于以抑食肼为代表的苯甲酰肼类的毒性研究多局限于对靶标昆虫的毒理机制与抗药性研究，对小鼠的致突变性、急性和亚慢性毒性研究，以及对蚯蚓的急性毒性和生理生化效应研究^{[7, 8]}，而国外的相关研究主要集中在该类农药对甲壳纲生物蜕皮行为的影响，这些研究都较少涉及到受试生物的繁殖和生长指标的变化研究^{[9, 10, 11]}，且鲜见对水生无脊椎动物的毒性效应研究。在此背景下，本研究主要考察21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的急性毒性和21 d慢性毒性效应，观察大型溞各个繁殖和生长指标变化，建立毒物剂量-反应关系，并寻找其中的敏感生物学指标，为评价抑食肼对水环境的污染效应和保护水生生态系统安全提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验生物

本研究采用的受试大型溞（Daphnia magna）为本实验室连续培养三代以上的单克隆品系。依照OECD 211 实验方法，大型溞长期稳定地培养于M4 培养液中^{[12, 13, 14]}。M4 培养液每周更换2~3次，培养温度为（20±1）℃，光暗比为16 h∶8 h，光强度为18 μE·m^-2·s^-1，培养密度为每只溞50 mL 培养液。定期投放斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）作为饵料^{[15, 16]}。每天饲喂密度约为90 000个·mL^-1（每只溞100~200 μg），21 d内每只母溞繁殖幼溞数量多于60只，可达到实险方法的要求。

试验前，挑选20~30只个体大、怀卵多、活动能力强的母溞于1 L的烧杯内，精养喂以新鲜栅藻3周。这些母溞产生的2~5代幼溞可用于试验。挑选出生6~24 h健康活泼幼溞用于毒性试验，其重铬酸钾敏感度测定结果符合ISO标准^[17]。 1.2 供试药剂

供试物21%抑食肼可湿性粉剂取自国内某企业，外观为白至黄色粉末，有效成分为抑食肼，化学名称为N-苯甲酰基-N′-特丁基苯甲酰肼。助剂成分：萘磺酸甲醛（5.0%）、对甲氧基脂肪酰胺基苯磺酸钠（1.7%）、壬基酚聚氧乙烯醚（0.8%）、二氧化硅（2.5%）、高岭土（69%）。该药主要登记在水稻田喷雾使用，防治对象为稻纵卷叶螟，用量为有效成分10~20 g·667 m^-2。 1.3 急性毒性试验

按照OECD 202的标准方法^[18] 进行急性毒性暴露试验。在预实验的基础上得出21%抑食肼可湿性粉剂对溞类100%活动受抑制的最低浓度和全不抑制的最高浓度，以确定正式试验的浓度范围。根据预实验的结果，急性毒性试验设置0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg·L^-1 6个浓度处理，同时设置1个空白对照组和一个最大二甲基亚砜浓度对照组（0.1%）。用40%的二甲基亚砜（DMSO）配制21%抑食肼可湿性粉剂的母液，然后将其溶于M4培养液配制出6个不同的浓度。试验时，在100 mL烧杯中装入50 mL不同浓度的抑食肼可湿性粉剂药液，每只烧杯放入5只幼溞，幼溞溞龄为6~24 h，每个浓度设置4个平行。在急性毒性暴露过程中不投饵、不更换试液，于24 h、48 h观察记录活动受抑制的幼溞数。 1.4 慢性毒性试验

参考OECD 211方法^[13] 进行21 d慢性毒性试验，根据急性毒性实验，获得供试药剂对大型溞48 h的半数抑制浓度EC₅₀；试验浓度设置以急性48 h-EC₅₀和预试验（48 h抑制中浓度）结果为基础，设置6个浓度水平，同时设置1个空白对照组和一个最大二甲基亚砜浓度对照组（0.1%）。每个浓度设置10个平行，选用100 mL的烧杯，放入50 mL暴露溶液，放入1只6~24 h幼溞，于光暗比为16 h∶8 h、（20±1）℃的培养箱内连续培养21 d。试验期间采用半静态实验系统^{[19, 20]}，每隔1 d 更换1次实验溶液，保证试验期间药剂浓度为起始浓度的80%以上^[21]，每天用新鲜的栅藻（90 000 cells·mL^-1）喂养大型溞。在试验过程中，每24 h观察一次，记录大型溞的生存、蜕壳、怀卵、繁殖情况，并移除幼溞，21 d培养结束时，在体视镜下对存活的大型溞拍照，记录溞体形态变化及其体长（从头盔至壳刺部的长度）。试验结束后，计算大型溞的平均首次蜕壳时间、平均蜕壳次数、首次产幼溞时间、平均产幼溞数量和产幼溞胎数等。 1.5 数据处理

48 h急性毒性试验数据用SPSS 16.0统计软件处理，得到48 h-EC₅₀值。慢性毒性试验数据用SPSS 16.0和Origin 8.5统计软件对各慢性毒性终点值变化进行显著性分析，得到最敏感指标出现显著性变化的暴露浓度，并计算各个繁殖毒性终点指标的NOEC值，以便未来对该农药进行风险评价积累基础毒性数据。 2 结果与分析 2.1 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的急性毒性

试验过程中试液溶解氧保持在8.0 mg·L^-1以上，pH在7.5左右。空白对照组和最大溶剂对照组的大型溞全部生长正常，无一受抑制。大型溞接触21%抑食肼可湿性粉剂后，各浓度组受试溞活动受到不同程度抑制，抑制溞个体胀大，体色发白，沉于水底。参比物质试验结果表明，重铬酸钾对大型溞的24 h-EC₅₀为0.88 mg·L^-1，符合试验要求。

根据急性毒性的试验结果，调用SPSS 16.0统计软件中的Probit方法求得急性毒性EC₅₀（表 1）。21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的48 h-EC₅₀为0.94 mg·L^-1。按照国家环境保护局《化学农药环境安全评价试验准则》^[22]农药对大型溞的毒性分级标准，该药对溞类属于高毒农药。

表 1 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的急性毒性 Table 1 Acute toxicity of 21% RH5849 wettable powders to D. magna

表选项

由图 1可见，21%抑食肼可湿性粉剂处理能提早大型溞的初次蜕壳时间，当其浓度大于0.4 mg·L^-1时，初次蜕壳时间极显著提前（P<0.01）。开始出现显著性差异的处理组是0.8 mg·L^-1（P<0.01）。

* 表示不同处理间差异显著 （ P<0.05 ） ，** 表示不同处理间差异极 显著 （P<0.01 ） ； Max 和 Min 分别代表试验数据最大值和最小值； 1 SE 和-1 SE 代表标准误差； 50%代表试验数据的中位数 （下同） * and ** indicate significant differences between treatments at P<0.05 and P<0.01，respectively； Max and Min mean the maximum and minimum values of experimental data； 1 SE and -1 SE indicate the standard error； 50% indicates median of experimental data （ similarly here in after ） 图 1 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞初次蜕壳时间的影响 Figure 1 Effects of 21% RH5849 wettable powders on time of the first molting of D. magna after 21d exposure

图选项

由图 2可见，21%抑食肼可湿性粉剂暴露显著降低大型溞的蜕壳次数，当其浓度大于0.045 mg·L^-1时，蜕壳次数显著下降（P<0.05）。但是实验结束时，暴露浓度组0.4、0.8、1.2 mg·L^-1的大型溞完全死亡（全部死亡的时间分别为第18、9、7 d），因此该三个浓度组的蜕壳次数显著下降与大型溞过早死亡有关。出现显著性差异的暴露组是0.135 mg·L^-1（P<0.05）。

图 2 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞蜕壳次数的影响 Figure 2 Effects of 21% RH5849 wettable powders on number of molting of D. magna after 21 d exposure

图选项

如图 3所示，21%抑食肼可湿性粉剂暴露能延迟大型溞的首次产幼溞时间，当浓度为0.4 mg·L^-1时，首次产幼溞时间显著延迟（P<0.05）。

图 3 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞首次产幼溞时间的影响 Figure 3 Effects of 21% RH5849 wettable powders on time of the first reproduction of D. magna after 21 d exposure

图选项

如图 4所示，总体上21%抑食肼可湿性粉剂暴露能降低平均每只大型溞的产幼溞数量，当浓度为0.135 mg·L^-1时，平均每只大型溞的产幼溞数量显著下降（P<0.05）。该项数据只统计存活至试验结束时的大型溞所产幼溞的数量。

图 4 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞产幼溞总数的影响 Figure 4 Effects of 21% RH5849 wettable powders on number of total offspring per female of D. magna after 21 d exposure

图选项

如图 5所示，当抑食肼活性成分浓度大于0.045 mg·L^-1时，平均每只母溞产后代胎数开始出现显著下降（P<0.05）。

图 5 21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞产幼溞胎数的影响 Figure 5 Effects of 21% RH5849 wettable powders on number of brood per female of D. magna after 21 d exposure

图选项

如图 6所示，当抑食肼活性成分浓度为0.015 mg·L^-1时，试验结束后大型溞母溞个体的平均体长显著下降，显著性差异分别出现在0.015 mg·L^-1和0.135 mg·L^-1暴露浓度组。 　　

图 6 21%抑食肼可湿性粉剂对暴露 21d 后大型溞体长的影响 Figure 6 Effects of 21% RH5849 wettable powders on body length of D. magna after 21 d exposure

图选项

经测试，试验过程中试液溶解氧保持在8.0 mg·L^-1以上，pH在7.5左右。空白对照组和最大溶剂对照组的大型溞全部生长正常，无一死亡。21 d后统计大型溞活动受抑制情况，得出21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞21 d-EC₅₀值为0.095 mg·L^-1，相当于48 h-EC₅₀的1/10。 3 讨论

抑食肼是1988年美国罗姆-哈斯公司开发的第一种非甾醇二酰基肼类杀虫剂，RH-5849 对许多鳞翅目、一些双翅目、鞘翅目害虫有特效^[23]。非甾醇蜕皮激素类杀虫剂无论从宏观的中毒症状，还是在细胞、分子水平都表现出与蜕皮激素相同的症状和作用方式。但蜕皮激素诱导的是正常的蜕皮过程，而二酰基肼类化合物却导致早熟、致死的蜕皮^[24]。研究表明，抑食肼有很强的蜕皮致死作用^[25]。本试验过程中，高浓度组（0.4、0.8、1.2 mg·L^-1）中均出现了蜕皮不成功致死的现象，主要表现为大型溞在蜕皮过程中旧头壳下出现一个未鞣化的新头壳，但无法蜕去，保持这种濒死状态1~2 d，最后死于饥饿和壳未完全脱落。除此之外，抑食肼还表现出很强的杀卵活性^[26]。Trisyono等^[27]的研究表明，欧洲玉米螟（O. nubilalis）和巨座玉米螟（Diatraea grandiosella）的卵块在含有100 mg·L^-1的RH-2485 或RH-5992 的药剂中浸蘸过后，95%以上的卵死亡；而1 mg·L^-1 的浓度处理，虽然一些卵能够孵化，但存活率很低。本试验中也出现类似现象，在21 d慢性暴露试验的第16 d和17 d时，0.015 mg·L^-1和0.045 mg·L^-1两个浓度组均出现产下的幼溞死亡的现象。非甾醇蜕皮激素类杀虫剂的神经中毒作用一般认为是阻碍了神经和肌肉上钾通道的传导^[28]，而其具有的杀卵活性说明二酰基肼类化合物可能还存在其他的作用机制。

21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的48 h-EC₅₀为0.94 mg·L^-1，为高毒，其值远超过纯品抑食肼的急性毒性，表明农药剂型加工过程中添加的助剂可能会增加制剂的毒性。21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞的存活以及后代成活、卵的孵化有一定的影响，并且随着药剂浓度的升高，对各项指标的影响愈加显著。较高浓度的抑食肼药剂严重影响了母代大型溞的产卵情况，包括产卵量、产卵的时间和产幼溞的胎数；而且作为一种新型昆虫生长调节剂，该药剂对大型溞的显著作用体现在对其蜕壳数和蜕壳时间的影响。由于药剂的影响，大型溞初次蜕壳时间提前，蜕壳次数减少，即龄期减少，所以龄期之间的间隔延长，导致大型溞生长缓慢，21 d内产卵总数大幅度减少。

研究表明，21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞具有慢性毒性，而且后代畸形的高发生率值得人们关注。到目前为止，21%抑食肼可湿性粉剂的这些效应对环境风险评价的相关性还不清楚。OECD 准则的标准繁殖测试没有考虑后代的质量和胚胎发育，具有一定的局限性。实验过程中发现，在产卵过程中，各处理组都有幼溞死亡或畸形的现象发生，而且推测抑食肼在大型溞母体中富集并转移给子代个体中。因此，自然界中，大型溞如果暴露在本实验浓度下，种群的数量将会下降。同时大型溞发生畸形和流产的机理尚需进一步研究。同样正在广泛使用的其他蜕皮激素类杀虫剂所引起的环境风险亦应引起人们足够的重视。 4 结论

21%抑食肼可湿性粉剂对大型溞活动抑制EC₅₀（21 d）为0.095 mg·L^-1；21%抑食肼可湿性粉剂暴露能促进大型溞提前蜕壳，降低其蜕壳次数；延迟大型溞的首次产幼溞时间，降低平均每只大型溞的产幼溞胎数和数量；此外，21%抑食肼可湿性粉剂暴露还能显著影响大型溞的个体尺寸，且该指标对农药暴露的敏感性最高，21%抑食肼可湿性粉剂在0.015 mg·L^-1时，即显著降低大型溞的体长。因此，综合考虑各项繁殖毒性终点指标，该农药对大型溞的NOEC值为0.045 mg·L^-1。

鉴于21%抑食肼可湿性粉剂在较低浓度下便能显著影响大型溞的各项生长和繁殖慢性毒性终点，建议对该农药登记大田使用前进行田间试验和环境生物影响风险评估，尤其要注意其对水生甲壳类生物的影响。