热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs），是在环境胁迫条件下能够诱导其合成或含量增加的一类蛋白质，广泛分布于植物、动物和微生物体内。1962年，Ritossa发现短暂的热激能诱导巴氏果蝇（Drosophila busckii）唾腺的多线染色体发生膨突（Puffs），膨突的生成与该区基因转录有关，后经证实在受热激的果蝇组织中产生了一类蛋白，称之为热激蛋白（HSPs）。之后又陆续从原核生物及鸟类和哺乳动物组织或培养细胞中发现了多种热休克蛋白^[1]。HSPs是一个大的分子伴侣家族，能够帮助初期多肽或者变性蛋白正确折叠并阻止蛋白不可逆降解或错误折叠^[2]。

生物体内有多种HSPs，根据其分子量大小、氨基酸序列同源性和生理功能可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子HSPs（sHSPs）等亚类^[3]。sHSPs家族分子量在9~43 kDa之间^[4]，该家族成员均含有一个约100个氨基酸的C-端保守区域^[5]，不同生物中该区域α-晶体蛋白有很高的同源性，因此也被称为α-晶体蛋白区域。对sHSPs的研究表明，其参与多种生理学过程，如细胞压力对抗^[6]、对组织和器官的影响及生殖发育^[7]等。据文献报道，sHSPs可被多种环境压力所诱导，如缺氧、局部缺血、重金属离子、杀虫剂和有机溶剂等^[8]。近年来，已在果蝇（Drosophila melanogaster）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、家蚕（Bombyx mori）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）等昆虫中开展了一些sHSPs研究工作，然而对中华稻蝗尚未见系统研究^[9]。

中华稻蝗（Oxya chinensis）属直翅目（Orthoptera）斑腿蝗科（Catantopidae）稻蝗属（Oxya Serville），主要以水稻、小麦等禾本科植物为食，是主要的农业害虫^[10]。当其生存环境受到重金属污染时，重金属离子可通过食物链进入蝗虫体内，产生一系列毒害作用，重金属离子在虫体内的富集和表达也作为农业环境污染的生物标志物^[11]。本课题组多年来致力于重金属镉（Cadimum，Cd）对中华稻蝗的毒性效应及虫体代谢解毒作用研究^{[12, 13, 14, 15]}，前期已对热休克蛋白HSP90、HSP70和HSP60家族进行了分析，结果表明Cd急性处理可诱导其表达，经Cd处理后，中华稻蝗7个小分子热休克蛋白基因（OcsHSPs）的表达水平不同，通过分析7个OcsHSPs基因在不同组织部位的表达模式，发现OcHSP19.1、OcHSP20.7和OcHSP21.1基因在中华稻蝗精巢和卵巢特异性高表达，OcHSP19.8基因在精巢显著高表达，OcHSP20.4基因在卵巢特异性高表达。究其原因可能是不同OcsHSPs的功能有所差异（数据未显示）。Li等^[16]报道，家蚕小分子热休克蛋白基因BmHSP20.1、BmHSP20.4和BmHSP27.4在精巢和卵巢显著高表达，BmHSP19.5、BmHSP19.9、BmHSP20.2和BmHSP20.8在精巢特异性高表达，家蚕sHSPs基因在生殖腺高表达显示其可能在精母细胞和卵母细胞的发育中起重要作用。为了进一步研究Cd对OcsHSPs基因表达的影响，本文分析了OcHSP19.1、OcHSP19.8、OcHSP20.4、OcHSP20.7和OcHSP21.1 这5个在中华稻蝗精巢或卵巢特异性高表达的OcsHSPs基因经Cd急性诱导的表达模式，研究结果将为深入揭示小分子热休克蛋白的功能提供基础资料。 1 材料与方法 1.1 中华稻蝗

实验用中华稻蝗蝗卵于2013年4月采自山西省太原市晋源区（112°5′ E，37°7′ N），放入人工气候箱（27 ℃，14 h黑暗/10 h光照，60%湿度）内孵化，2周后虫卵孵化，室温下饲喂至5龄若虫后用于实验，实验期间每日以新鲜小麦苗饲喂。 1.2 主要仪器与化学试剂

高速冷冻离心机（3K-15，德国Sigma公司）；凝胶成像系统（Gel DOC XR^TM System，美国Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）；PCR仪（美国Bio-Rad 公司）；实时荧光定量PCR仪（ABI 7300，美国应用生物系统公司）。

氯化Cd（CdCl₂·2.5H2O分析纯，天津化工三厂）；RNAiso^TM Plus（日本Takara公司）；M-MLV反转录酶（美国Promega公司）；SYBR Green Mix（东洋纺上海公司）；本实验所用引物全部在英潍捷基公司合成，其他试剂均购自Promega公司和Takara公司。 1.3 Cd急性染毒

参照中华稻蝗48 h LC₅₀值（0.64 μg·μL^-1），设定0.16、0.32、0.48 μg·μL^-1 3个CdCl₂溶液浓度，以三蒸水为对照。将4 μL各浓度CdCl₂溶液注射到活力、大小均匀一致的5龄中华稻蝗若虫2-3腹节处，每浓度注射雌雄虫各280头，分别在染毒后2、6、12、24 h和36 h随机取样，每个时间段取12个精巢或卵巢，设置3个生物学重复，每个生物学重复取4个精巢或卵巢，在液氮中冷冻后立即存放于-80 ℃冰箱中待用。 1.4 总RNA提取及第一链cDNA合成

用RNAiso^TM Plus试剂提取总RNA，具体操作步骤参照试剂说明书。所用样本为中华稻蝗5龄若虫的精巢或卵巢。用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计检测总RNA纯度并对其进行定量，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。用M-MLV Reverse Transcriptase 试剂合成第一链cDNA，具体步骤参照试剂说明书。 1.5 荧光定量PCR检测及数据分析

中华稻蝗sHSPs基因的mRNA定量表达分析采用SYBR Green法在Real time 7300 PCR仪上检测，以20×稀释的cDNA为模板，以β-actin为内参基因，引物序列见表 1。反应参数：94 ℃预变性15 s，94 ℃变性15 s，60 ℃退火加延伸31 s，40个循环。 数据采用2^-ΔΔCt法进行处理，结果以平均值±标准误（Means±SE）表示，并用SPSS 16.0软件进行ANOVA分析和多重比较（Tukey法）。

表 1 Real-time PCR 所用引物 Table 1 List of primers used in Real-time PCR

表选项

图 1为不同浓度Cd急性处理中华稻蝗不同时间后OcHSP19.1基因表达水平的变化。

不同大写字母表示相同时间不同Cd 浓度处理间差异显著，不同小写字母表示同一浓度下不同处理时间的差异显著（P<0.05）。下同 Capital letters indicate significant difference between different Cd concentrations. Small letters indicate significant difference between图 1 Cd 急性染毒对中华稻蝗OcHSP19.1 基因在精巢和卵巢表达的影响 Figure 1 Effects of acute Cd exposure on expression levels of OcHSP19.1 gene in testis and ovary of O. chinensis

图选项

在精巢内，经0.16 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，OcHSP19.1基因在不同处理时间的表达水平与对照组相比均有所升高；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其在2 h表达水平最高，之后降低，且与对照组相比无明显变化；经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其表达水平从2 h到12 h降低，从12 h到36 h显著升高，在36 h表达水平最高，是对照组的6.3倍。OcHSP19.1基因在2 h和6 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，在12 h、24 h和36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈先升高后降低再升高的趋势。

在卵巢内，经0.16 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，OcHSP19.1基因在不同处理时间的表达水平与对照组相比无明显变化；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其表达水平从2 h到12 h升高，从12 h到24 h降低，之后显著升高，在36 h表达量最高，是对照组的4.8倍；经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其表达水平在2 h最高，之后降低，且与对照组相比无明显变化。OcHSP19.1基因在2、6、12 h和24 h的表达水平与对照组相比无明显变化，在36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。 2.2 中华稻蝗精巢和卵巢内OcHSP20.7基因的表达

图 2为不同浓度Cd急性处理中华稻蝗不同时间后OcHSP20.7基因表达水平的变化。

图 2 Cd 急性染毒对中华稻蝗OcHSP20.7 基因在精巢和卵巢表达的影响 Figure 2 Effects of acute Cd exposure on expression levels of OcHSP20.7 gene in testis and ovary of O. chinensis

图选项

在精巢内，经0.16 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP20.7基因在不同处理时间的表达水平与对照组相比都有所升高；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，其表达水平在2 h到6 h高于对照组，之后其表达水平下降且与对照组相比无明显变化；经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，其表达水平从2 h到12 h降低，从12 h到36 h升高，在2 h表达水平最高，是对照组的5.3倍。OcHSP20.7基因在2 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现逐渐升高的趋势，在6 h和12 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。

在卵巢内，经0.16 μg·μL^-1和0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP20.7基因的表达水平随时间的延长而降低，在2 h时其表达水平高于对照组，之后与对照组相比无明显变化；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，其表达水平从2 h到12 h升高，从12 h到36 h降低，在12 h表达量最高，是对照组的8.1倍。OcHSP20.7基因在2 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低再升高的趋势，在6 h和12 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。 2.3 中华稻蝗精巢和卵巢内OcHSP21.1基因的表达

图 3为不同浓度Cd急性处理中华稻蝗不同时间OcHSP21.1基因表达水平的变化。

图 3 Cd 急性染毒对中华稻蝗OcHSP21.1 基因在精巢和卵巢表达的影响 Figure 3 Effects of acute Cd exposure on expression levels of OcHSP21.1 gene in testis and ovary of O. chinensis

图选项

在精巢内，经0.16 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP21.1基因在6 h和36 h的表达水平低于对照组，其他处理时间均高于对照组；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，不同处理时间其表达水平与对照组相比均有所降低；经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，在2 h和36 h其表达水平高于对照组，在6 h的表达水平低于对照组，其他时间与对照组相比无明显变化。OcHSP21.1基因在2、12、24 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低再升高的趋势，在6 h其表达水平随着Cd浓度的增大而降低，在36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先降低后升高的趋势。

在卵巢内，经0.16 μg·μL^-1和0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP21.1基因在不同处理时间的表达水平与对照组相比无明显变化；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，其表达水平从2 h到24 h无明显变化，且低于对照组，在36 h显著升高，表达量是对照组的4.6倍。OcHSP21.1基因在2 h和6 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先降低后升高的趋势，在12 h和24 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低再升高的趋势，在36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。 2.4 中华稻蝗精巢和卵巢内OcHSP19.8与OcHSP20.4基因的表达 2.4.1 OcHSP19.8基因在精巢内的表达

图 4为不同浓度Cd急性处理中华稻蝗不同时间OcHSP19.8与OcHSP20.4基因表达水平的变化。

图 4 Cd 急性染毒对中华稻蝗OcHSP19.8 基因在精巢和OcHSP20.4 基因在卵巢表达的影响 Figure 4 Effects of acute Cd exposure on expression levels of OcHSP19.8 gene in testis and OcHSP20.4 gene in ovary of O. chinensis

图选项

在精巢内，经0.16 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP19.8基因在不同处理时间的表达水平变化不明显，且均高于对照组；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其表达水平在2 h明显高于对照组，之后降低，且与对照组相比无明显变化；经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺ 处理，其表达水平从2 h到12 h与对照组相比无明显变化，从24 h到36 h显著升高，在36 h表达量最高，是对照组的5.4倍。OcHSP19.8基因在2 h和6 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，在12 h、24 h和36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低再升高的趋势。 2.4.2 OcHSP20.4基因在卵巢内的表达

由图 4可见，经0.16、0.32、0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP20.4基因在12 h和24 h的表达水平低于对照组，经0.32 μg·μL^-1Cd²⁺处理，其在36 h的表达水平高于对照组，其他处理时间与对照组相比均无明显变化。OcHSP20.4基因在12 h其表达水平随着Cd浓度的增大逐渐降低，在24 h的表达水平随着Cd浓度的增大呈现先降低后升高的趋势，在36 h其表达水平随着Cd浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。 2.5 多因素方差分析 2.5.1 中华稻蝗精巢内OcHSPs基因的多因素方差分析

经Cd急性染毒中华稻蝗精巢内OcsHSPs基因的多因素方差分析结果见表 2。Cd浓度对中华稻蝗精巢内OcsHSPs基因的表达具有显著的影响（P<0.05），处理时间对中华稻蝗精巢内OcsHSPs基因的表达有极显著的影响（P<0.001）。基因×浓度之间有明显的交互作用（P<0.05），浓度×时间之间有极显著的交互作用（P<0.001），基因×时间、基因×浓度×时间之间无明显交互作用（P>0.05）。

表 2 经Cd 急性染毒中华稻蝗精巢内OcHSPs基因的多因素方差分析结果 Table 2 ANOVA results of OcHSPs gene expression in testis of O. chinensis after acute Cd exposure

表选项

经Cd急性染毒中华稻蝗卵巢内OcHSPs基因的多因素方差分析结果见表 3。Cd浓度和处理时间对中华稻蝗卵巢OcHSPs基因的表达有极显著的影响（P<0.001）。基因×浓度、浓度×时间之间有极显著的交互作用（P<0.001），基因×浓度×时间之间有明显的交互作用（P<0.05），基因×时间无明显交互作用（P>0.05）。

表 3 经Cd 急性染毒中华稻蝗卵巢内OcHSPs基因的多因素方差分析结果 Table 3 ANOVA results of OcHSPs gene expression in ovary of O. chinensis after acute Cd exposure

表选项

目前已有环境污染引起生物体内小分子热休克 蛋白（sHSPs）基因表达改变的研究，如Roberts等^[17] 研究发现sHSPs的表达可以作为鱼类和甲壳类动物健康检测指标从而监测水质的污染情况，An等^[18]研究报道HSP70和HSP30在黑鲫（Carassius carassius）肝脏和肾脏高表达，且与水质变化一致，表明肾脏中HSP30和肝脏中HSP70的表达可作为环境中水质变化的生物标记物。Cd是环境中重要的污染元素之一，进入环境中的Cd很难被生物体降解，从而导致生物体中Cd的过量累积，影响生物体正常的生命活动^{[19, 20, 21, 22]}。中华稻蝗是水稻种植区重要的农业害虫，农田环境Cd污染可影响其生殖发育等代谢过程，包括体内起重要作用的蛋白质的合成和转运等。

本文研究结果显示，经Cd急性处理后中华稻蝗5个OcsHSPs基因在精巢和卵巢具有不同的表达模式。在精巢内，经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP19.1和OcHSP19.8基因在不同处理时间的表达水平均高于对照组，且随着时间的延长出现先降低后升高的趋势，在36 h出现了显著高表达，可能是由于Cd进入中华稻蝗体内，在精巢内积累和发挥作用需要一定的时间，并且Cd浓度越高其积累量越多^[23]。本文研究结果与You等^[24]对紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）sHSP22基因经不同浓度Cd诱导的表达结果类似，即随着Cd浓度增大和时间的延长，sHSP22基因表达量显著增大。

在卵巢内，OcHSP19.1和OcHSP21.1基因经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，随着时间的延长，表达量升高，而经0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理时，表达量有所下降。其原因可能是高浓度Cd²⁺ 降低了卵巢的代谢能力，从而破坏了OcsHSPs的蛋白结构或阻碍了蛋白的合成转运。本文研究结果与Tang等^[25]对家蝇（Musca domestica）两个金属硫蛋白基因经Cd诱导后的表达水平类似，即在一定的浓度范围内，随着Cd浓度的增大，基因表达水平升高，而当Cd浓度增大到一定量时，基因表达水平降低，这可能是由于高浓度Cd毒性增大而引起卵巢代谢能力下降。

经0.16 μg·μL^-1和0.48 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP20.7基因在卵巢内于2 h出现了显著高表达，之后明显降低，可能是由于OcHSP20.7是一种应激蛋白，当Cd进入中华稻蝗体内后OcHSP20.7迅速合成以抵抗Cd毒性，应激过后昆虫体内其他解毒系统发挥作用，故OcHSP20.7基因表达水平降低；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理，OcHSP20.7基因的表达水平随着时间的延长出现先升高后降低的趋势，可能是Cd初始诱导时，未引起应激反应，经一定时间后出现对Cd的反应。而随着时间的延长，中华稻蝗体内其他代谢解毒基因开始起作用，故其表达水平又逐渐降低。这一结果与You等^[24] 对紫贻贝OcHSP24.1基因经不同浓度Cd诱导后的表达结果类似，即随着Cd浓度增大和时间的延长，OcHSP24.1基因的表达水平先升高后降低，可能是由于Cd初始诱导时，紫贻贝迅速合成sHSPs以保护细胞免受毒害，应激过后昆虫体内其他解毒系统开始起作用，故OcHSP24.1基因表达水平下降。

Cd处理后中华稻蝗OcHSP21.1基因在精巢和OcHSP20.4基因在卵巢的表达水平与对照组相比无显著差异，可能是由于中华稻蝗体内积累的Cd抑制了sHSPs或者其辅助因子的合成，也可能是长期生存于Cd环境中而产生了适应性。这一研究结果与Warcha1owska-Śliwaa等^[26] 对细角蚱（Tetrix tenuicornis）的研究结果类似，重金属对HSP70没有诱导作用，可能是长期暴露于重金属环境而产生了适应性。

不同基因对Cd的反应不同，原因可能是这5个基因功能存在差异。由多因素方差分析结果可知，中华稻蝗5个OcsHSPs基因OcHSP19.1、OcHSP19.8、 OcHSP20.4、OcHSP20.7和OcHSP21.1在抵抗Cd急性毒性时存在交互作用。如经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理2 h，在精巢内OcHSP19.1、OcHSP19.8和OcHSP20.7基因的表达水平与对照组相比升高以抵抗Cd毒性，而OcHSP21.1基因的表达水平与对照组相比降低；经0.32 μg·μL^-1 Cd²⁺处理6 h和12 h，在卵巢内OcHSP20.7基因的表达水平与对照组相比升高以抵抗Cd毒性，OcHSP20.4基因的表达水平与对照组相比无明显变化，而OcHSP21.1基因的表达水平与对照组相比降低。在精巢和卵巢内，Cd浓度与处理时间之间都存在极明显的交互作用，这两个因素共同作用使得OcsHSPs基因表达发生变化，且各基因表达模式不同^[27]。

中华稻蝗对Cd急性染毒的反应表现为OcsHSPs基因表达水平的变化，其调控作用可能发生在转录水平。Shi等^[28]研究发现Cd处理水生摇蚊后，hsc70，hsp90和hsp40基因协调表达以保护机体不受Cd侵害，且受多种转录因子的相互作用共同调控。本研究今后将进一步从转录调控水平开展工作，以深入揭示中华稻蝗小分子热休克蛋白的生物学功能。 4 结论

Cd急性诱导中华稻蝗5个OcsHSPs基因在精巢和卵巢具有不同的表达模式。中华稻蝗5个OcsHSPs基因经Cd急性诱导时存在交互作用；在精巢和卵巢内，Cd浓度与处理时间之间都存在极明显的交互作用，这两个因素共同作用使得OcsHSPs基因表达发生变化，且各基因表达模式不同。