镉被广泛应用于工业生产中，对生态环境造成了严重污染。由于镉的半衰期长，可以通过食物链进行传递^[1]，富集于动物和人体内，诱导生物有机体活性氧、使自由基含量增加、破坏抗氧化系统并造成严重的氧化损伤。这些损伤已经被证实是引起细胞毒性和癌变的重要机制之一^[2]。谷胱甘肽系统是机体抗氧化体系的重要组成部分，主要由还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）、谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione transferase，GST）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）构成，这些物质对镉引起的氧化损伤有防御作用。当生物有机体受到活性氧、自由基等过氧化物损伤时，GSH在GPx、GST的催化下，加快对过氧化物的清除，减轻组织细胞的氧化损伤^{[3, 4]}。同时，GSSG又可以在GR的作用下还原为GSH，确保机体GSH与GSSG的动态平衡，维持机体抗氧化防御能力，减少脂类过氧化物、H₂O₂等的毒性影响。国内外对贝类的研究主要集中于海洋生物类：许超群等^[5]测定了四溴联苯醚（BDE-47）对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）组织解毒代谢酶活力与DNA损伤的影响；孟晓林等^[6]检测了镉对虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis） GPx活性的影响；Sokolova等^[7]研究了镉对太平洋牡蛎（Crassostrea virginica Gmelin）线粒体基因表达的调控；Blasco等^[8]研究了重金属在海洋贝类体内的不同蓄积途径。关于淡水贝类的研究则甚少。

背角无齿蚌（Anodonta woodiana woodiana）是淡水中分布较广的物种，直接受到淡水水体及底泥中污染物的影响，能够反映水域或底泥中重金属的污染状况，是一种理想的环境监测指示生物。据文献报道幼龄淡水贝类对无机化合物最敏感^[9]，本课题组在前期研究中也发现，镉对背角无齿蚌鳃等组织的SOD、GPx和CAT活性产生了显著影响并引起脂质过氧化^[10]。本文在此基础上就镉对背角无齿蚌鳃和肝脏GSH、GSSG的含量和GST、GR活性的影响进行研究，旨在了解并掌握淡水水体中重金属镉对水生动物的污染状况，进一步探讨镉对谷胱甘肽及相关酶活性的毒性效应及相关机制。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 背角无齿蚌

背角无齿蚌（以下简称“河蚌”），于2013年4月购自太原市五龙口水产批发市场，置水族箱并加入曝气48 h后的自来水（pH6.8，溶氧6 mg·L^-1以上），室温15 ℃，室内暂养两周以上用于实验。 1.1.2 实验试剂

氯化镉（CdCl₂·2.5H₂O）、氯化钠（NaCl）均为分析纯；GSH、GSSG、GST、GR及蛋白含量的检测试剂盒均购自南京建成生物公司，试剂盒名称及批号分别为：还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（微板法），A006-2；总谷胱甘肽（T-GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）测定试剂盒（微板法），A061-1；谷胱甘肽-S转移酶（GSH-ST）试剂盒（比色法），A004；谷胱甘肽还原酶（GR）测定试剂盒（紫外比色法），A062。总蛋白（TP）测定试剂盒（带标准：考马斯亮蓝法），A045-2。 1.2 实验方法 1.2.1 实验设计

根据镉（Cd²⁺）对河蚌96 h LC50（134. 9 mg·L^-1）的急性毒性实验，设计了5个Cd²⁺浓度（4.22、8.43、16.86、33.72、67.45 mg·L^-1）处理组和1个空白对照组，每个浓度设3个平行组。将108只大小相近、体重相当的活体河蚌（平均质量49.5 g，平均体长7.46 cm，平均体高3.2 cm）分别置于18个水族箱中（50 cm×30 cm×20 cm），每箱6只，对照组加4 L曝气48 h的自来水，处理组加4 L不同浓度镉溶液，pH6.8，溶氧6 mg·L^-1以上，室温15 ℃。实验期间不喂食，不换水，分别处理24、48、72、96 h。 1.2.2 样品制备

在染毒24、48、72、96 h后，用双蒸水洗净蚌体表面残留的镉溶液，迅速剖取鳃、肝脏组织，分别称取约0.1 g组织分装于2 mL EP管中，称重，记录，并置于液氮中速冻，之后置于-80 ℃超低温冰箱备用。 1.2.3 谷胱甘肽含量及相关酶活力测定

GSH、GSSG含量和GST、GR活力的测定均依据试剂盒的说明操作；GSH/GSSG比值为本实验测定的GSH、GSSG含量之比。 1.2.4 蛋白含量测定

蛋白含量的测定采用Bradford方法，用考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定，标准蛋白以试剂盒提供的蛋白为参照。 1.3 数据处理

实验结果利用SPSS（中文17.0）软件分析处理，检验实验数据的正态分布性，并用平均值±标准误（Mean±S.E.）表示；处理组和对照组显著性检验采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）。 2 结果与分析 2.1 镉对背角无齿蚌鳃GSH、GSSG含量和GSH/ GSSG比值的影响

由图 1可知，与对照组相比，同一时间不同浓度，或同一浓度不同时间，背角无齿蚌鳃中GSH含量表现为显著性或极显著性降低（P<0.05，P<0.01）；GSSG含量除48 h、4.22 mg·L^-1处理组出现显著性升高（P<0.05）外，其他处理组均表现为显著性或极显著性降低（P<0.05，P<0.01）。在24、72、96 h，GSH含量在低浓度组逐渐降低，高浓度组逐渐升高；GSSG含量在24、48 h逐渐降低，72 h逐渐升高，在96 h低浓度处理组GSSG含量逐渐降低，高浓度处理组GSSG含量逐渐升高。随着时间的延长，GSH/GSSG比值在低浓度（4.22、8.43 mg·L^-1）处理组先降后升，在高浓度（33.72、67.42 mg·L^-1）处理组则逐渐下降，且与对照组相比差异显著（P<0.05）。在镉浓度67.45 mg·L^-1的不同时间段，GSH/GSSG比值逐渐降低，除96 h之外均表现为显著或极显著性差异（P<0.05，P<0.01）。

图 1 镉对背角无齿蚌鳃GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG比值的影响 Figure 1 Effects of Cd2+ on GSH and GSSG contents and GSH/GSSG ratios in gill of Anodonta woodiana woodiana （*P<0.05，**P<0.01，Mean±S.E.，n=3）

图选项

如图 2所示，与对照组相比，同一时间不同浓度，或同一浓度不同时间，背角无齿蚌肝脏中GSH含量呈现极显著性降低（P<0.01）。在24、48 h，随镉浓度升高，GSH含量逐渐降低，但72 h和96 h，GSH含量在低浓度组升高，高浓度组降低。同一浓度，随着时间的延长，GSH含量在浓度4.22 mg·L^-1处理组逐渐降低；8.43 mg·L^-1处理组含量逐渐升高；16.86、33.72、67.45 mg·L^-1处理组含量先升后降。而GSSG含量无显著性变化。与对照相比，随镉浓度的升高和处理时间的延长，GSH/GSSG比值呈显著或极显著性降低（P<0.05，P<0.01）。随着镉浓度升高，在24 h GSH/GSSG比值逐渐降低，48、72、96 h其比值在低浓度升高，高浓度降低。随着处理组时间的延长，4.22 mg·L^-1处理组比值逐渐降低；8.43、16.86、67.45 mg·L^-1处理组比值短时间内升高，长时间处理则逐渐降低；33.72 mg·L^-1处理组比值逐渐升高。

图 2 镉对背角无齿蚌肝脏GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG 比值的影响 Figure 2 Effects of Cd2+ on GSH and GSSG contents and GSH/GSSG ratios in hepatopancreas of Anodonta woodiana woodiana （*P<0.05，**P<0.01，Mean±S.E.，n=3）

图选项

观察图 3（a）发现，与对照组相比，在24 h，背角无齿蚌鳃中GST活性呈梯度型降低，呈极显著性差异（P<0.01）。随着时间的延长，GST活性与对照组相比呈升高趋势；在48、72、96 h，GST活性在低浓度组升高，高浓度组降低，呈现显著性或极显著性差异（P<0.05，P<0.01），其中72 h更加突出，均为极显著性差异（P<0.01）。

图 3 镉对背角无齿蚌鳃GST和GR 活性的影响 Figure 3 Effects of Cd2+ on GST and GR activities in gill of Anodonta woodiana woodiana （*P<0.05，**P<0.01，Mean±S.E.，n=3）

图选项

由图 3（b）可知，在48、96 h，随镉浓度升高，GR活性在低浓度组升高，高浓度组降低，在72 h，GR活性逐渐升高，且在67.45 mg·L^-1达到最高。与对照相比，在48 h、8.43 mg·L^-1处理组，72 h、67.45 mg·L^-1处理组及96 h、4.22 mg·L^-1处理组，GR活性呈极显著性升高（P<0.01）。 2.4 镉对背角无齿蚌肝脏GST、GR活性的影响

观察图 4（a）发现，与对照组相比，同一时间不同浓度，或同一浓度不同时间，背角无齿蚌肝脏中GST活性整体呈升高趋势且有极显著性差异（P<0.01）；在24 h、4.22 mg·L^-1 处理组，GST活性达到最高。在同一时间，随着镉浓度的升高，GST活性呈逐渐降低趋势。

图 4 镉对背角无齿蚌肝脏GST和GR 活性的影响 Figure 4 Effects of Cd2+ on GST and GR activities in hepatopancreas of Anodonta woodiana woodiana （*P<0.05，**P<0.01，Mean±S.E.，n=3）

图选项

如图 4（b）所示，与对照组相比，除48 h外，背角无齿蚌肝脏中GR活性整体呈升高趋势且有显著或极显著性差异（P<0.05，P<0.01）；在72 h、4.22 mg·L^-1处理组GR活性达到最高，呈极显著性差异（P<0.01）。同一时间，随镉浓度升高，GR活性在低浓度组升高，高浓度组降低，且在96 h升高或降低趋势更加明显。 　　 3 讨论 3.1 镉对背角无齿蚌鳃和肝脏GSH和GSSG含量及GSH/GSSG比值的影响

本实验结果表明，背角无齿蚌鳃和肝脏中GSH含量与对照相比均出现了显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）性降低，且在24 h、4.22 mg·L^-1处理组即出现降低现象，说明鳃和肝脏中GSH对镉的胁迫反应较敏感。GSH作为一种天然活性肽，利用自身的-SH结构与组成特性，与进入组织的镉离子螯合，避免了鳃与肝脏中重要酶蛋白变性、失活，从而有利于重要酶活性的发挥^[11]；GSH还是生物有机体重要的还原剂，在GPx、GST催化作用下，还原由于镉胁迫产生的H₂O₂、羟自由基、脂质过氧化物等，使其转变为酸类等疏水性物质和水，从而达到解毒功效^[12]，而GSH被氧化为GSSG^[13]。

然而，随着镉浓度的升高与暴露时间的延长，鳃中GSSG含量极显著（P<0.01）降低。这可能是因为：鳃中的GSSG可在GR的作用下与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）反应，依赖机体提供的能量，还原为GSH^[14]；GSH与镉离子螯合^[11]，致使氧化还原反应生成的GSSG含量减少。而肝脏中GSSG含量无显著性变化（P>0.05），可能因为肝脏中GSH与GSSG的氧化还原反应达到了动态平衡。这进一步说明肝脏作为机体的解毒器官，对镉（Cd²⁺）引起的氧化损伤有一定的抵御作用。

大量研究证实，GSH/GSSG比值可以灵敏评价组织抗氧化平衡状态^{[15, 16]}。正常人体血液中GSH/ GSSG比值维持在100/1^[13]，Jain等^[11]和孙光闻等^[17]研究证明，在GSH中加入一定比例的GSSG可以增强GSH清除自由基的能力，不同比率的GSH/GSSG对自由基的清除率不同；Jain等^[11]在血液中输入GSH，可以增加GSH/GSSG的比率，从而增加机体免疫反应。本研究发现，随着镉浓度的增加和处理时间的延长，背角无齿蚌鳃中GSH/GSSG整体基本呈升高趋势（P<0.05），说明机体为了应对镉引起的氧化损害，不断提高GSH/GSSG比率，清除机体内自由基等氧化物质，避免生物有机体受到更大损伤^[16]，尤其在66.75 mg·L^-1浓度组，鳃组织抵御能力更为明显。而肝脏中GSH/GSSG比值出现显著（P<0.05）或极显著性（P<0.01）降低，说明肝脏受到了严重的损伤，对外来毒物的免疫能力下降。这可能因为肝脏作为解毒组织，承担着较大的解毒代谢压力。 3.2 镉对背角无齿蚌鳃和肝脏GST和GR活性的影响

GST是机体重要的抗氧化酶之一，有多种同工酶，广泛分布于组织细胞与血液中，与机体多种疾病相关^[18]。本研究结果显示，在24 h，处理组GST活性与对照组相比均被显著或极显著地抑制（P<0.05，P<0.01）。这可能因为鳃作为呼吸器官没有解毒功能，对镉造成的胁迫反应迟钝^[19]，致使GST活性随镉浓度升高呈梯度下滑的现象。随着处理时间的延长，在48、72、96 h，鳃中GST活性在低浓度处理组被显著诱导（P<0.05），高浓度处理组诱导反应逐渐降低（P<0.05），并恢复到对照组水平。低浓度处理组被显著诱导可能是因为河蚌受到镉的毒性攻击而产生氧化应激反应，GST活性升高，加快催化GSH巯基与亲电子基团结合，增加其疏水性，使外源毒物易于被机体分解排泄^[6]。这一结果与许超群等^[5]检测的四溴联苯对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力的影响结果一致。高浓度处理组诱导反应逐渐降低说明鳃中脂质过氧化物（MDA）含量随镉浓度增加逐渐升高^[10]，受到的氧化胁迫逐渐增强，组织受损严重，GST清除脂类过氧化物能力逐渐降低^[4]。与对照组相比，肝脏中GST活性均被显著诱导，且在24 h、4.22 mg·L^-1时即作出升高的反应，说明肝脏对镉引起的胁迫反应较为敏感^[19]，可能与肝脏承担机体的解毒功能有关。但是，随镉浓度的升高，肝脏中GST活性逐渐降低，可能因为肝脏对进入体内的镉经膜包被，使镉与细胞其他组分相隔，达到清除重金属颗粒的作用^[20]，迫使组织细胞脂质过氧化损伤严重，GST活性逐渐降低。类似研究证明，铜可以诱导牡蛎（Ostrea gigas thunberg）和淡水贻贝（Lampsilis siliquoidea）GST活性升高^{[9, 18]}。Li等^[21]发现，垃圾渗透液可以诱导蜗牛（Bellamya purificata）鳃与消化腺GST活性升高。

GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，以GSSG为底物，NADPH供氢，合成GSH，促使机体GSH与GSSG含量达到动态平衡，维持机体氧化还原平衡状态^[22]。本实验结果显示，背角无齿蚌肝脏中GR活性被显著诱导（P<0.05）。处理96 h，镉浓度与GR活性间呈现明显的剂量-效应关系。这与肝脏中GSSG含量变化相对应，GR活性升高，促使大量GSSG源源不断还原成GSH，维持机体GSH与GSSG的动态平衡，抵御外来镉对机体造成损伤。 4 结论

（1）肝脏中GSH含量的变化对镉引起的损伤反应灵敏且发挥了重要作用，可以作为环境监测的生物学指标。

（2）GST解毒酶对镉的毒性反应灵敏，且肝脏较鳃的反应迅速。GST活性和肝脏组织分别可以作为环境监测的酶学指标和靶器官。