近年来，人们为了提高蔬菜产量，盲目施用大量的化学氮肥，导致严重的硝酸盐累积，进而危害人类健康^[1]。业已证明，植物不仅能够吸收硝态氮（NO₃^--N）、铵态氮（NH₄⁺-N）等无机氮，还能直接吸收环境中氨基酸态氮^{[2, 3]}。氨基酸态氮部分替代NO₃^--N能够降低蔬菜叶片硝酸盐含量，并可提高其可溶性糖及游离氨基酸含量，从而改善蔬菜的营养品质^{[4, 5]}，且不同形态氮（无机氮、有机氮）比例显著影响作物体内硝酸盐含量及其碳、氮代谢^{[6, 7]}。然而，目前的研究大多集中于单一无机氮、有机氮部分替代无机氮对作物生长和碳、氮代谢的影响，混合氮源浓度配比对作物体内碳水化合物积累和氮素吸收影响的报道尚不多见。常规培养条件下，有机氮尤其是氨基酸态氮易于被微生物分解，且不同形态氮素之间也可以相互转化。因此，当前已取得的试验结果存在很大争议^{[8, 9]}，而且无菌条件下不同外源氮浓度配比对作物生长、根系结构以及品质指标的影响也并不十分清楚。

甘氨酸（Gly）是土壤中含量较高的一种氨基酸，也是分子量最小、结构最简单的氨基酸^[10]；与其他氨基酸相比，甘氨酸不易被微生物分解^[11]，且长久以来一直是植物氨基酸态氮研究的理想氮源。因此，本文选择甘氨酸（Gly-N）作为供试氨基酸态氮，以双子叶植物小白菜（Brassica chinensis L.）为供试材料，旨在探讨无菌条件下小白菜幼苗生长、氮素吸收及品质等对不同外源氮浓度组成（Gly-N、NO₃^--N和NH₄⁺-N）的响应，为蔬菜养分综合高效管理提供理论依据。

试验于2014年3—5月在浙江大学紫金港校区植物有机营养实验室内进行，供试作物为小白菜（Brassica chinensis L.），品种为浙白6号。将小白菜种子于25 ℃下浸泡12 h后，按照莫良玉等^[12]组合灭菌方法进行灭菌，然后将消毒种子播于含10 mL营养琼脂培养基的培养皿中（直径约为60 mm），每皿播种子15~20粒，盖上培养皿的盖子并用封口膜封好，置于白天温度25 ℃、夜间温度22 ℃、空气湿度为60%、光照强度为15 000 lx的植培台上发芽，并同时进行菌检。种子发芽后，选取无菌的种子3粒点播于已灭菌且装满琼脂（0.1%）的50 mL塑料离心管（上端带有直径0.5 cm小孔的塑料盖），并包上已灭菌的玻璃纸，然后置于无菌植培台上（离心管用铝箔包裹，以保证植物根系在黑暗条件下生长），光照和温度条件与发芽时相同，且整个实验期间保持一致，培养好的无菌幼苗供下一阶段使用。

试验采用水培法，供试氮源为Gly-N、NO₃^--N、NH₄⁺-N三种混合氮源，每种氮源设250、2500 μmol·L^-1 两个水平，共8个处理（表 1），其总氮浓度分别为750、3000、3000、5250、3000、5250、5250、7500 μmol·L^-1。除氮外，其他养分配方参考MS培养基的无机盐组成稍加改变，主要成分为：2.0 mmol·L^-1 K₂SO₄，2.0 mmol·L^-1 KH₂PO₄，4.0 mmol·L^-1 CaCl₂，1.4 mmol·L^-1 MgSO₄·7H₂O，0.000 1 mmol·L^-1 NaMoO₄，0.000 4 mmol·L^-1 CuSO₄·5H₂O，0.001 mmol·L^-1 ZnSO₄·7H₂O，0.008 mmol·L^-1 H₃BO₃，0.01 mmol·L^-1 MnCl₂，0.005 mmol·L^-1 Na₂EDTA，0.01 mmol·L^-1 FeSO₄。上述无氮营养液采用121 ℃高压灭菌30 min，NO₃^--N、NH₄⁺-N、Gly-N采用0.22 μm微孔滤膜灭菌，然后添加到121 ℃高压灭菌的无氮营养液中。

表 1 不同处理中外源氮浓度组成 Table 1 Concentrations of exogenous Gly-N，NO₃^--N，and NH₄⁺-N in different treatments

表选项

待培养好的无菌幼苗从离心管中长出后去掉玻璃纸，每个离心管保留一株幼苗，然后用南大704硅橡胶密封小孔；3 d后，把无菌苗转移到另一批灭菌且装有上述1/2强度营养液的50 mL离心管中；再培养3 d后，将营养液更换为完全营养液，pH为6.0左右。每个处理设8个重复，随机排列。每3 d更换一次营养液，去掉污染幼苗，局部无菌培养21 d后收获。

小白菜收获时将地上部和根系分开，并分别称重。根系形态结构（包括总根长、根表面积、根直径、根体积和根尖数）用根系扫描仪（STD1600，Epson，Nagano，Japan）进行扫描分析。样品烘干后粉碎，用浓硫酸-双氧水法进行消解，样品氮含量采用半微量凯氏定氮法测定^{[13, 14]}；游离氨基酸总量采用水合茚三酮比色法测定；可溶性蛋白总量采用考马斯亮蓝染色法测定，并用牛血清白蛋白作标准曲线；可溶性糖总量采用蒽酮比色法测定；根系活力采用TTC法测定；硝酸盐含量采用水杨酸比色法测定^[15]。

数据采用STATISTICA 5.5（StaSoft Inc，USA）软件进行ANOVA方差分析，图表中各指标不同处理间显著性检验采用Duncan新复极差法（P＜0.05）。

如图 1所示，不同处理中各外源氮浓度配比对小白菜地上部和根系生物量的影响差异显著（P＜0.05）。GnA处理中小白菜根系、地上部和整株生物量最高，分别达13.5、81.0、94.5 mg·株-1，且显著高于其他7个处理（根系生物量除外，P＜0.05）。低Gly-N浓度条件下（250 μmol·L^-1），小白菜的地上部、整株生物量在gna、gnA和gNa处理间差异不显著。高Gly-N浓度条件下（2500 μmol·L^-1），GnA处理整株生物量较Gna、GNa和GNA处理分别增加了19.6%、110%和85.7%。虽然GNA处理中氮浓度是gna处理的10倍，但前者整株生物量仅较后者增加了6.60%。等氮量条件下（3000 μmol·L^-1），Gna处理中整株生物量显著高于gnA和gNa处理（P＜0.05）；在5250 μmol·L^-1条件下，低NO₃^--N的GnA处理中整株生物量显著高于高NO₃^--N的gNA和GNa处理（P＜0.05）。

图中不同小写字母表示各部位不同处理间差异显著（P＜0.05），下同 Different lowercase letters indicate significant differences（P＜0.05）between different treatments of root，shoot and whole plant of pakchoi.The same below 图 1 局部无菌水培条件下不同外源氮浓度配比对小白菜 生物量的影响 Figure 1 Effects of different exogenous nitrogen forms on biomass of pakchoi under localized sterile hydroponic cultivation

图选项

如图 2所示，GnA处理中小白菜根系、地上部和整株氮含量显著高于其他各处理（P＜0.05）。GNA处理中营养液氮浓度最高，但其植株总氮含量较Gna和GnA处理分别降低了22.8%和44.3%。在等氮量条件下（3000 μmol·L^-1），整株氮含量的大小顺序为Gna>gNa>gnA；在5250 μmol·L^-1条件下，整株氮含量的顺序为GnA>gNA>GNa。

图 2 局部无菌水培条件下不同外源氮浓度配比对小白菜 氮含量的影响 Figure 2 Effects of different exogenous nitrogen forms on nitrogen content of pakchoi under localized sterile hydroponic cultivation

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三因素方差分析显示，Gly-N、NO₃^--N和NH₄⁺-N三种氮源对小白菜整株生物量均存在显著的主效应（P＜0.05），即三种氮源不同浓度均显著影响小白菜的生长，且Gly-N和NO₃^--N的交互效应也显著影响小白菜的生长（表 2）。然而，Gly-N、NO₃^--N和NH₄⁺-N三种氮源的主效应及其交互效应对小白菜全氮含量影响均不显著。

表 2 甘氨酸、硝态氮和铵态氮对小白菜生物量和氮含量的 主效应及其交互效应分析 Table 2 Main and interaction effects of Gly-N，NO₃^--N，and NH₄⁺-N on biomass and nitrogen content of pakchoi using three-factor analysis of variance（ANOVA）

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由表 3可知，GnA处理中小白菜根系总根长、根表面积、根体积及根系活力最高，分别达359 cm、129 cm2、2.50 cm3、0.680 mg·h-1·g-1，且均显著大于其他各处理（除Gna外，P＜0.05）。在高Gly-N浓度条件下，增加NO₃^--N浓度（如GNa和GNA）显著抑制小白菜根系形态特征的增长，其总根长、根表面积、根体积及根系活力显著低于Gna和GnA处理。低Gly-N浓度条件下，gNA处理小白菜各主要根系形态指标值最高。小白菜主要根系形态指标和根系活力变化趋势与生物量变化趋势相似，其总根长、根表面积、根体积、根系活力均呈现GnA>Gna>gNA>gnA>gNa>gna>（GNa，GNA）的变化趋势。不同外源氮浓度配比对小白菜根系直径影响差异不大，gna处理中根直径最低，为0.901 mm，其他各处理间差异不显著。

表 3 局部无菌水培条件下不同外源氮浓度配比对小白菜根系形态及根系活力的 影响 Table 3 Effects of different exogenous nitrogen forms on root morphology and root activity of pakchoi under localized sterile hydroponic cultivation

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由图 3可知，不同处理中小白菜叶片可溶性蛋白、游离氨基酸、可溶性糖及硝酸盐含量因外源氮浓度配比的不同而差异显著（P＜0.05）。Gna处理中可溶性蛋白、游离氨基酸和可溶性糖含量最高，分别达26.2、126、 24.0 mg·kg^-1。 等氮量条件下（3000 μmol·L^-1），Gna处理可溶性蛋白、游离氨基酸和可溶性糖含量较gnA和gNa处理平均值分别增加了17.3、11.5倍和1.10倍。在5250 μmol·L^-1条件下，GnA和GNa处理中可溶性蛋白和可溶性糖含量较gNA处理显著增加（P＜0.05），但游离氨基酸含量增加趋势不显著，GNa处理甚至较gNA处理降低了47.0%。高Gly-N浓度处理中，高NO₃^--N和NH₄⁺-N浓度（如GNA处理）显著降低可溶性蛋白、游离氨基酸和可溶性糖含量，而低Gly-N浓度处理中此趋势不明显。

图 3 局部无菌水培条件下不同外源氮浓度配比对小白菜品质指标的影响 Figure 3 Effects of different exogenous nitrogen forms on quality indicators of pakchoi under localized sterile hydroponic cultivation 30

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此外，不同外源氮浓度组成也显著影响小白菜硝酸盐含量。无菌培养21 d后，小白菜叶片硝酸盐含量在gna处理中最低，为34.2 mg·kg^-1；在GNa和GNA处理中最高，且显著大于其他各处理（P＜0.05）。在等氮量条件下（3000 μmol·L^-1），小白菜叶片硝酸盐含量的大小顺序为gNa>Gna>gnA；在5250 μmol·L^-1条件下，小白菜叶片硝酸盐含量的大小顺序为GNa>gNA>GnA。

氮素是调控植物生长发育的关键因素，不同形态氮源对植物生物量和氮素吸收有很大影响^[16]。本试验结果表明，小白菜的生物量和氮含量受外源氮浓度及其组成影响差异显著，在高Gly-N和NH₄⁺-N浓度、低NO₃^--N浓度处理中（GnA）达到最高。低Gly-N浓度条件下，受氮浓度影响小白菜整株生物量在各处理间差异不显著。高Gly-N浓度条件下，增加NO₃^--N浓度（如GNa和GNA）使小白菜生物量和氮含量显著降低，我们推测小白菜对Gly-N和NO₃^--N的吸收可能存在激烈竞争；NH₄⁺-N则表现出相反的趋势，低NO₃^--N浓度条件下提高NH₄⁺-N浓度显著增加小白菜生物量和氮含量（如GnA），表明适当增加混合氮源中Gly-N和NH₄⁺-N浓度、降低NO₃^--N浓度有利于小白菜生物量的增加。Wu等^[17]发现无菌条件下小麦生物量随着外源Gly-N∶NH₄⁺-N比例的增加而增大，与Gunes等^[9] 对洋葱的研究结果以及我们前期的试验结果一致^[4]。高浓度外源Gly-N和NH₄⁺-N 增加了小白菜叶片生物量和全氮含量，表明除NO₃^--N外小白菜还易于吸收还原态形式的氨基酸态氮和NH₄⁺-N，并增强体内氮代谢过程。这可能与蔬菜体内存在氮代谢的反馈调节机制有关；也可能由于NH₄⁺-N主要在根部同化，而NO₃^--N既会在根部也会运到地上部同化。故两者配合施用可以使植株各部位累积的碳水化合物即碳架得到合理和高效利用，可节省能量，使植物以少量能耗贮存较多氮素^[18]。此外，NH₄⁺-N在植物体内的同化比NO₃^--N所需的能量更少，因此从理论上植物应倾向于利用NH₄⁺-N作为氮源。但目前外源氨基酸对植物NH₄⁺-N吸收、转运机理等方面的影响仍不十分清楚。

小白菜作为喜硝植物，当NO₃^--N的同化速率超过其吸收速率时，就容易造成体内硝酸盐的累积^[19]。高NO₃^--N浓度处理中（如gNa和GNa处理），小白菜硝酸盐含量较低NO₃^--N浓度处理（如gnA和GnA）显著增加，可间接证明小白菜硝酸盐含量主要来源于外源NO₃^--N。作为NO₃^--N的还原产物，氨基酸对氮代谢具有反馈调节作用，当植株本身具有足量还原态氮时，植物不会吸收或仅吸收少量的NO₃^--N，以节省NO₃^--N的吸收、还原及最终氨基酸合成所用能量^[20]。因此混合氮源条件下，小白菜会优先吸收Gly-N，从而抑制植株根系对NO₃^--N的吸收，进而减少体内硝酸盐含量。此外，不同形态氮源间的相互作用也可能是小白菜体内硝酸盐含量降低的原因之一。与Gna处理相比，GnA处理显著增加小白菜生物量和氮含量，但其硝酸盐含量却处于较低水平，表明在低NO₃^--N浓度条件下，高浓度的外源NH₄⁺-N会抑制高亲和力的NO₃^--N的吸收，与Nazoa等^[21] 和Vidmar等^[22]的研究结果一致。有研究指出氨基酸能够抑制根系中HvNRT2转录基因的表达，进而阻碍编码NO₃^--N转运蛋白mRNA合成，而该转运蛋白与NO₃^--N的吸收紧密相关^[22]。Aslam等^[23]发现虽然氨基酸能够诱导NO₃^--N转运蛋白，但编码NO₃^--N转运蛋白的mRNA周转速率却显著增加。考虑到小白菜吸收的NH₄⁺-N和氨基酸态氮在其体内并不能转化成硝酸盐^[24]，因此适当增加外源氨基酸态氮和NH₄⁺-N水平有利于降低蔬菜的硝酸盐污染。

长久以来，与单一供应NH₄⁺-N或NO₃^--N相比，铵硝混合氮源可显著提高植物生长速率，增加吸氮总量和蛋白质含量，改善植物的营养品质^{[25, 26, 27]}。本试验在严格的局部无菌条件下发现，在无机氮中添加适量的氨基酸态氮能够在不影响小白菜产量的前提下，提高可溶性蛋白、游离氨基酸、可溶性糖含量，降低硝酸盐含量，改善小白菜的营养品质。氨基酸态氮和NH₄⁺-N部分替代NO₃^--N后，小白菜叶片的可溶性糖含量上升。这可能与液泡中NO₃^--N的数量减少，可溶性糖和氨基酸进入液泡维持渗透平衡有关^[28]。从叶片中游离氨基酸与可溶性蛋白含量的变化分析，小白菜在高Gly-N、低NO₃^--N浓度处理中对氮吸收利用效率较高，氮代谢速度快，叶片游离氨基酸含量增加，蛋白质含量相应提高。氨基酸含量及其组成是评价蔬菜营养品质的重要指标^[29]。但也有人发现氨基酸虽能显著改善作物品质，却不能提高作物产量。这可能与作物种类及氨基酸类型、氮浓度等有关^{[5, 7, 30]}。

作物产量的形成是养分供应水平与根际环境条件共同作用的结果，根系形态及其根际环境也影响到地上部的生长及品质^[31]。本研究表明不同外源氮浓度组成对小白菜根系形态的影响主要表现在根系长度、根表面积、根体积及根系活力上，其与小白菜生物量变化趋势高度相似，呈现出GnA>Gna>gNA>gnA> gNa>gna>（GNa、GNA）的变化趋势，表明良好的根系形态特征有利于地上部的生长发育。高Gly-N和NH₄⁺-N浓度、低NO₃^--N浓度处理有利于促进小白菜根系总根长、根表面积、根体积和根系活力，但各处理间根系直径差异不显著。值得注意的是，在低NO₃^--N浓度条件下，增加混合氮源中NH₄⁺-N的浓度有利于根系形态特征的发育。这可能是由于吸收NH₄⁺-N后产生的根际酸化可以部分抵消NO₃^--N吸收产生的根际碱化，形成适宜于根系生长的环境^[32]。然而，高浓度NH₄⁺-N抑制作物生长，容易造成光合产物向根部运输减少，制约根系生长发育，产生细根或黑根，出现根茎比降低等现象^[33]。因此，寻求适宜的氮浓度组成对构建理想的植物根系形态特征具有重要意义。当前外源有机氮调控根系吸收特性的相关研究较少，进一步揭示混合氮源条件下水稻根系功能与养分利用间的内在联系也是氮营养吸收研究的发展趋势。

局部无菌水培条件下，提高混合氮源中Gly-N浓度、降低无机氮（尤其是NO₃^--N）浓度，能够提高小白菜生物量、可溶性蛋白、游离氨基酸和可溶性糖含量，并降低硝酸盐含量，一定程度改善小白菜营养品质。小白菜的总根长、根表面积、根体积、根系活力等指标变化趋势与生物量变化趋势一致，表明良好的根系形态特征和根系活力有利于地上部的生长发育。