据统计，自1996年以来，全球转基因作物种植面积逐年增长，从1996年的1700 万hm²增加到2014年的1.815亿hm²，转基因作物成为近年来应用最为迅速的作物 ，为农户及消费者带来的利益不言而喻^{[1, 2]}。但与此同时，转基因作物的安全 性及对生态环境的影响也日益受到公众的关注。目前，对转基因作物环境安全 性评价主要集中在基因漂移、对靶标和非靶标生物的影响及对农业生态环境的 影响等方面^{[3, 4]}。

当前我国农业生产面临着增肥不增产、土壤养分过量累积、化肥施用过量和养 分利用效率下降等重大问题。因此，提高作物产量和养分利用效率是我国农业 可持续发展的关键^[5]。氮磷钾养分吸收、转运、同化和循环再利用等过程机制 的研究及相关功能基因的克隆、功能分析和转化，最终获得养分高效利用的转 基因作物已成为国内外研究的热点^{[6, 7, 8, 9]}。

磷是作物生长发育和产量形成过程中必需的大量元素之一。土壤中含有较多的 磷元素，但绝大多数不能被作物直接吸收利用^[10]，可被直接吸收利用的可溶 性正磷酸盐含量一般都很低，通常小于10 μmol·L^{-1[11, 12]}；另外，磷在土 壤中移动性很差，作物根系一般只能吸收距根表面1~2 mm以内的有效磷。这就 造成了普遍性的土壤缺磷现象^[13]。前人研究发现土壤的磷素循环对土壤磷流 失有重要作用^[14]，土壤中的磷素循环主要是围绕着植物、土壤和微生物三者 进行，植物根系分泌物在土壤磷素的循环转化中起着重要作用^[15]。磷高效水 稻在获取土壤磷素的过程中可能会打破原有土壤磷素的平衡，进而影响不同磷 形态的组成^[16]。

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物，随着人口的增加、耕地面积的减少和人 们生活水平的迅速提高，生产高产优质的水稻已成为农业生产关注的重要问题 ^[17]。水稻的养分吸收尤其是磷素吸收极大地受到土壤有效磷的制约，因而磷 高效转基因水稻以其对土壤磷素的高效吸收利用优势受到植物营养学家和遗传 育种学家的广泛关注。南京农业大学将克隆的水稻Pht1家族成员OsPT4基因转入 日本晴而创制的超表达材料实现了水稻磷素的高效吸收，与对照相比，在水培 正常供磷条件下该材料苗期地下部全磷含量平均增加10%~20%，地上部平均增加 36%~50%，在低磷条件下苗期地下部平均增加8%~15%，地上部平均增加15%~30% ^[18]；磷高效突变体材料PHO2是编码OsLTN1基因发生无义突变产生的磷高效吸 收材料，该材料在不添加磷素的水培条件下苗期地上部的磷含量较亲本日本晴 高，地下部较对照低^{[19, 20, 21]}。磷高效转基因水稻因其特有的磷素高效吸收和转运能力可以在土壤有效磷浓度较低的情况下吸收到更多的磷素，从而满足作物 的正常生长发育。

由于土壤磷库长期处在一个动态的平衡状态，而磷高效转基因水稻对土壤磷素 的高效吸收是否会对土壤磷形态转化及其有效性存在潜在的影响还不得而知。 目前，有关磷高效吸收转基因作物对土壤磷形态及有效性影响的研究相关报道 较少。本文采用盆栽试验研究在不施磷条件下磷高效转基因水稻全生育期土壤 磷素形态的变异情况，为探寻磷高效水稻对土壤中不同形态磷素的利用特征， 探明磷高效水稻高效吸收利用磷素机理及科学评价磷高效转基因水稻的土壤安 全性提供相关技术支撑。

供试水稻品种：日本晴（CK）、磷高效吸收转基因材料OsPT4和磷高效突变体材 料PHO2，试验材料均由南京农业大学资源与环境学院植物营养分子生物学实验 室提供。

供试土壤：采自天津市武清区常规水稻田，基本理化性质为：pH 8.23，有机质 20 g·kg^-1，全氮0.89 g·kg^-1，全磷1.1 g·kg^-1，速效磷19.63 mg·kg^-1。

试验在农业部环境保护科研监测所网室内进行。采用不透明塑料桶（直径30 cm ，高35 cm），土壤自然风干，捶碎，剔除石块，磨碎，过筛（2 mm孔径），每 桶装土19.5 kg。种植前每桶施N 100 mg·kg^-1（（NH₂）₂）、K₂O 100 mg· kg^-1（K₂SO₄）作为基肥，播种前一周将CO（NH₂）₂、K₂SO₄以水溶液的形式混 入土壤。另外，50 mg·kg^-1 N作为追肥，不施用磷肥。

水稻种子用5%的次氯酸钠溶液消毒5 min，然后用去离子水冲洗3次。在育苗盘 播5粒水稻种子，待3叶期（播种后20 d）时，每塑料桶中移3株苗，每个水稻材 料种植6桶。试验中浇水量及管理条件均保持一致。分别于分蘖期（播种后50 d ）、幼穗分化期（播种后80 d）、抽穗扬花期（播种后110 d）、灌浆成熟期采 样（播种后140 d），用取土器紧贴根部采集土壤作为根际土壤，剔除碎根，风 干，研磨过筛后备用。成熟期将整桶土倒出，取出水稻植株，用自来水冲洗其 根部，再用蒸馏水洗净，吸水纸擦干，分为根、茎、叶、穗4个部分。在105 ℃ 下杀青30 min，再将温度降到65 ℃烘干至恒重，称重后粉碎测定含磷量。

植株样品磷浓度采用H₂SO₄-H₂O₂消煮-钼锑抗比色法测定^[20]，用干物重与磷浓 度（g·kg^-1）之积的总和计算植株磷积累量。土壤有效磷含量采用0.5 mol· L^-1NaHCO₃提取，钼锑抗比色法测定^[22]。

土壤无机磷的组分：用0.25 mol·L^-1NaHCO₃浸提Ca₂-P，继而用0.5 mol·L^-1CH₃COONH₄浸提Ca₈-P，用0.5 mol·L^-1NH₄F浸提Al-P，用0.1 mol·L^-1NaOH+0.1 mol·L^-1（1/2Na₂CO₃）浸提Fe-P，用0.3 mol·L^-1（Na₃C₆H₅O₇· 2H₂O）+Na₂S₂O₄浸提O-P，用0.25 mol·L^-1 H₂SO₄浸提Ca₁₀-P^[22]。

土壤有机磷的组分：活性有机磷为 0.5 mol·L^-1 NaHCO₃提取的有机磷，中活 性有机磷为 1.0 mol·L^-1 H₂SO₄+0.5 mol·L^-1NaOH 提取的有机磷，中稳性有 机磷为富里酸磷，高稳性有机磷为胡敏酸磷^[22]。

土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以2 h后100 g土壤中P₂O₅的 毫克数表示^[23]。

采用 SPSS13.0 和 Excel 2010 进行数据处理和图表绘制，用 Duncan 法进行 显著分析。

成熟期OsPT4的根干重、生物量均显著高于CK和PHO2（表 1）。OsPT4和PHO2的磷 素积累量分别高出CK处理13.10%和40.64%，其中PHO2的磷素积累量和CK呈显著 差异。

表 1 磷高效转基因水稻生物量及磷素积累量的差异 Table 1 Difference in total biomass and phosphorus accumulation of different high-P efficiency rice plants

表选项

分蘖期水稻OsPT4根际土壤的有效磷含量为55.28 mg·kg^-1，均显著高于PHO2和CK，但PHO2和CK间无显著差异（图 1）。抽穗扬花期水稻OsPT4和PHO2根际土壤 的有效磷含量分别为27.56、30.17 mg·kg^-1，其中OsPT4显著低于CK，而PHO2与CK无显著性差异。幼穗分化期和灌浆成熟期各水稻间无显著性差异。

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同 Different lower case letters mean significant difference at 0.05 level. The same below 图 1 不同处理下整个玉米生育期土壤微生物量碳（MBC）的变化 Figure 1 Variation of soil microbial biomass carbon（MBC） in different treatments during maize growing season

图选项

在水稻生长的四个生育期内，3个水稻材料根际土壤的Ca₂-P含量随着生长时期的推进均呈先下降后上升的趋势，磷高效转基因水稻材料OsPT4、磷高效突变体 水稻材料PHO2根际土壤的Ca₂-P含量和同期日本晴相比差异均不显著（P＜0.05，图 2a）。水稻根际土壤的Ca₈-P含量随着生长时期的推进均呈先下降后上升的趋 势，分蘖期最高，抽穗扬花期最低。同期的根际土壤Ca₈-P含量三者之间差异均不显著（P＜0.05，图 2b）。水稻根际土壤的Ca₁₀-P含量随着生长时期的推进先下降再上升，最后缓慢下降，3种水稻的变化趋势一致，OsPT4和PHO2根际土壤 的Ca₂-P含量与同期日本晴相比差异均不显著（图 2c）。

图 2 不同生育期磷高效转基因水稻根际土壤无机磷含量 Figure 2 Inorganic phosphorus fractions in rhizospheric soils of different high-P efficiency rice plants at different growth stages

图选项

在水稻生长的四个生育期内，水稻根际土壤的Al-P含量随着生长时期的推进均 呈先上升再下降的趋势（图 2d），磷高效转基因水稻材料OsPT4、磷高效突变体 水稻材料PHO2根际土壤的Al-P含量和同期日本晴相比均差异不显著（P＜0.05） 。水稻根际土壤的Fe-P含量随着生长时期的推进均呈先下降再升高的趋势（图 2e），三种水稻同期根际土壤的Fe-P含量无显著性差异。水稻根际土壤的O-P含 量随着生长时期的推进均呈逐渐下降后升高的趋势（图 2f），同时期三种水稻 的根际土壤的O-P含量均无显著性差异。

在水稻生长的整个生育期内，水稻根际土壤的活性有机磷含量随着生长时期的 推进均呈先上升后下降的趋势（图 3a）。磷高效转基因水稻材料OsPT4、磷高效 突变体水稻材料PHO2根际土壤的活性有机磷含量和同期日本晴相比均差异不显 著（P＜0.05）。水稻根际土壤的中活性有机磷含量随着生长时期的推进趋势各 不相同（图 3b），但三种水稻同期根际土壤的中活性有机磷含量无显著性差异 。各水稻根际土壤的中稳性有机磷和高稳性有机磷的含量随着生长时期的推进 均呈逐渐下降再升高后下降的趋势（图 3c、图 3d），同时期三种水稻根际土壤 的中稳性有机磷和高稳性有机磷的含量也均无显著性差异。

图 3 不同生育期磷高效转基因水稻根际土壤有机磷含量 Figure 3 Organic phosphorus fractions in rhizospheric soils of different high-P efficiency rice plants at different growth stages

图选项

在水稻生长的四个生育期内，磷高效水稻OsPT4和PHO2根际土壤磷酸酶活性随着 生长时期的推进均呈先上升后下降的趋势（图 4）。在分蘖期、抽穗扬花期和灌 浆成熟期，磷高效转基因水稻材料OsPT4、磷高效突变体水稻材料PHO2和日本晴 相比，根际土壤碱性磷酸酶活性均无显著差异。但在幼穗分化期磷高效转基因 水稻材料OsPT4的根际土壤碱性磷酸酶活性显著高于PHO2。

图 4 不同生育期磷高效转基因水稻根际土壤磷酸酶活性 Figure 4 Alkaline phosphatase activity in rhizospheric soils of different high-P efficiency rice plants at different growth stages

图选项

转基因作物释放的生态风险之一就是对土壤生态系统环境和功能的影响。研究 表明，转基因植物在田间种植可通过根茬、残枝落叶、根系分泌物、花粉等途 径，直接或间接影响土壤营养元素转化相关过程^{[24, 25, 26, 27]}。

吴娜^[18]等发现磷高效转基因水稻材料OsPT4在水培条件下，苗期干重及全磷含 量与对照相比均有显著增加。另有研究发现，磷高效突变体材料PHO2在不添加 磷素的水培条件下苗期地上部分的磷含量较亲本日本晴显著增加^[19]。张浩等 ^{[16, 28, 29]} 研究表明，磷高效品种较低效品种能够形成较多的生物量和单株 磷积累量，具有较强的干物质形成能力，是磷高效材料筛选和评价的首选指标 。林文雄等^[30]研究表明，高的磷吸收效率主要是由于根系生长旺盛所致。本 研究也发现在土培不施磷条件下磷高效水稻材料OsPT4和PHO2的根干重、总干重 、磷素积累量均高于日本晴。这说明磷高效转基因水稻材料OsPT4和磷高效突变 体材料PHO2可以增加植株对磷的吸收，且呈现出旺盛的生长趋势，同时也证明 根干重、总干重及磷积累量等是磷高效水稻材料筛选和评价的首选指标^{[28, 29, 30]} 。

蔡秋燕等^[31]发现磷高效基因型野生大麦根际有效磷含量显著高于磷低效基因 型，吴凡等^[32]发现转AtPAP15基因大豆根际土壤速效磷含量与受体在同一时期 均无显著性差异。本研究发现磷高效转基因水稻OsPT4在分蘖期促进磷素向速效 态的转化，而在分化期抑制磷素向速效态的转化。这可能是OsPT4在低磷浓度下 ，就能满足自身的生长需要，造成土壤中有效磷的积累。PHO2的种植对根际土 壤的速效磷含量几乎没有影响。在不施磷条件下，3种水稻根际土壤无机磷组分 浓度表现为Ca₁₀-P>O-P>Ca₈-P>Fe-P>Al-P>Ca₂-P，与石灰性土壤的Ca₁₀-P、 Ca₂-P的浓度分别为最高和最低一致^[33]。前人研究发现在不施加磷肥的盆栽试 验中，磷高效基因型野生大麦在拔节期根际土壤中有机磷各组分含量为中活性 有机磷＞中稳性有机磷、高稳性有机磷＞活性有机磷，且根际土壤中Ca₂-P、 Ca₈-P、Ca₁₀-P、O-P，高稳性有机磷、中稳性有机磷和活性有机磷含量与低效 基因型大麦均无显著性差异^[30]。本研究也发现，水稻生长的4个时期内， OsPT4和PHO2的根际土壤Ca₂-P、Ca₈-P、Ca₁₀-P、Al-P、Fe-P、O-P，高稳性有 机磷、中稳性有机磷、中活性有机磷和活性有机磷含量与其亲本日本晴相比均 无显著性差异，且各个磷形态的含量变化趋势与日本晴基本一致。张锡州等 ^[16]的研究也表明紫潮砂泥土上种植不同磷效率小麦根际土壤的磷分级特征无 差异，说明短期内磷高效植物材料不会对土壤中无机磷和有机磷组分造成影响 。据报道，根际分泌磷酸酶有利于提高土壤中磷的生物有效性，磷酸酶能将复 杂的有机磷化合物水解成为植物可吸收利用的正磷酸盐^[34]。乌兰图雅等^[35] 研究发现土壤酶活性和速效养分含量受转双价基因棉的影响较小，吴凡等^[32] 发现转AtPAP15基因大豆的种植对根际土壤的磷酸酶活性无影响。本研究发现磷 高效转基因水稻OsPT4、磷高效突变体水稻PHO2和亲本对照日本晴四个时期的磷 酸酶活性因时期不同而异，但同时期内OsPT4和PHO2与日本晴相比根际土壤碱性 磷酸酶活性均无显著性差异。

值得注意的是，本文只是在盆栽条件下对转基因水稻OsPT4和PHO2种植对土壤无 机磷和有机磷形态特征及磷酸酶活性的影响进行了初步研究，旨在为其风险评 价提供理论依据。目前国内外针对转基因作物释放对土壤生态系统的影响已开 展了一系列研究^{[16, 36, 37]}，转基因作物在环境中的释放所带来的影响很难说 是否只是一种短暂的效应。因此，要综合评价OsPT4和PHO2的种植对土壤磷素形 态的影响仍需通过不同施磷水平的长期田间试验进一步阐明。

（1）磷高效转基因水稻OsPT4和磷高效突变体水稻PHO2的根干重、生物量、磷 素积累量均高于日本晴。

（2）水稻OsPT4根际土壤的有效磷含量分蘖期显著高于CK，抽穗扬花期显著低 于CK。

（3）在水稻生育期内，OsPT4和PHO2根际土壤各个磷形态的含量变化趋势与其 对照日本晴一致，均无显著差异。OsPT4和PHO2根际土壤无机磷组分浓度表现为 Ca₁₀-P>O-P>Ca₈-P>Fe-P>Al-P>Ca₂-P，有机磷浓度表现为中活性有机磷>中稳性 有机磷>高稳性有机磷>活性有机磷。

（4）磷高效水稻OsPT4和磷高效突变体水稻PHO2根际土壤的磷酸酶活性随着生 长时期的推进均呈先上升后下降的趋势。OsPT4和PHO2水稻材料根际土壤的磷酸 酶活性和同期日本晴相比均差异不显著。