近些年来，为防治病虫害，我国化学农药的使用量持续增加，其中杀虫剂占有相当比例。化学农药的土壤残留^[1]和农产品农药残留^[2]问题逐渐突出，有些化学农药具有神经毒性，甚至还有致突变、致癌等毒性，严重地威胁人们的健康。农药残留引起的食品安全问题已经引起全社会高度关注。基于环境保护和国民健康的角度，寻找其他环境友好型措施替代化学农药对有害昆虫进行生物防治显得尤为迫切。

昆虫病原线虫作为一种新型的高效防治有害昆虫的生物措施^{[3, 4]}，具有分布广泛，寄主范围广，能主动寻找寄主，能人工大量培养^[5]，对人畜及环境安全无毒等优点，受到了国内外广泛关注。在昆虫病原线虫的自然生活史中，或以侵染期线虫自由存活在土壤中，或在寄主体内进行发育和繁殖。侵染期线虫具有一定的耐受性，对低温^[6]、冰冻^[7]、高温和干燥等^[8]具有一定的抗性。研究表明在环境胁迫下，虫尸剂（感染昆虫病原线虫的昆虫尸体）能够帮助昆虫病原线虫抵御不良环境^[9]，而且有研究表明与喷洒线虫悬液的施用方式相比，田间直接施用虫尸剂的防治效果更明显^[10]。如何使用虫尸剂对有害靶标昆虫进行高效防治，已经成为昆虫病原线虫应用研究的热点之一^{[11, 12]}。

对于昆虫病原线虫，只有安全越冬，其种群才能得以保存和发展。李春杰等^[13]研究发现，越冬过程中随温度的降低，Heterorhabditis bacteriophora-HBN线虫有向深层土壤迁移的趋势，但移动距离很小。不同种属的昆虫病原线虫对低温的敏感性不同^[14]。Susurluk^[15]连续两年的研究发现，夜蛾斯式线虫Steinernema feltiae的存活时间要长于噬菌性异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora。昆虫病原线虫在土壤中的存活时间尤其是能否成功越冬，直接决定线虫的使用次数，并最终与防治成本密切相关，故对于该生物防治措施的推广应用十分重要。

对昆虫病原线虫越冬能力的调查研究，能够更好地在生产实践中指导人们选择更为优良的品系进行生物防治。本试验拟解决的问题是：（1）侵染期小卷娥斯式线虫Steinernema carpocapsae和噬菌性异小杆线虫H. bacteriophora能否在寒冷的华北地区安全越冬？（2）相对于线虫悬液，虫尸剂能否为线虫提供一个更好的环境帮助其越冬？（3）两种土壤深度（5、15 cm），哪种深度的线虫存活率更高？（4）哪一个线虫品系的低温耐受性更强？本研究将为昆虫病原线虫部分替代化学农药，为生物防治措施的规模应用和我国蔬菜的安全生产提供一些理论支撑。

试验包括两种品系Heterorhabditis bacteriophora和 Steinernema carpocapsae。在室温（21~25 ℃）下，用大蜡螟（Galleria mellonella ，购买于天津惠裕德生物科技有限公司）进行活体繁殖，并利用White trap 收集侵染期线虫。将收集到的侵染期线虫储存在灭菌蛭石内，每个培养皿内蛭石质量为8 g，内含10万条侵染期线虫。将培养皿置于6.7 ℃冰箱内，保存时间不超过两周。

实验前8 d，细胞培养板每孔放置一头体重相近（约0.35 g）的大蜡螟，用两种侵染期线虫（H. bacteriophora 和S. carpocapsae）侵染大蜡螟，线虫的浓度为每头大蜡螟60条线虫。室温（21~25 ℃）下培养。

试验在天津市现代农业科技创新基地（39°42′69″N，116°95′97″E）的露天韭菜试验田进行。该样地5 cm深度处的pH为7.80，15 cm深度处的pH为7.77，土壤类型为重粘土，沙土∶壤土∶粘土=1∶14∶35，有机质含量为2.271%，碱解氮为85.73 mg·kg^-1，速效磷为71.96 mg·kg^-1，速效钾为329.5 mg·kg^-1，C/N为13.35。三次取样时该样地5 cm和15 cm深度处土壤的相对湿度和温度如表1所示。

表 1 土壤两种深度处的温度和相对湿度 Table 1 Soil temperature and relative humidity at two depths on each sampling date

表选项

试验于2013年11月2日在韭菜试验田进行布置。试验包括5个处理：H. bacteriophora 线虫悬液（约5万条侵染期线虫）；S. carpocapsae 线虫悬液（约5万条侵染期线虫）；H. bacteriophora虫尸剂2头；S. carpocapsae 虫尸剂2头；对照组。试验包括两个深度，5 cm和15 cm土层。

为了相对准确计数，将各处理放置于孔径为25 μm的尼龙网兜（12 cm×12 cm）内。将含昆虫病原线虫的蛭石、虫尸剂分别放于网兜内，虫尸剂组及对照组加等量的蛭石（4 g）。在田间取同等深度的土壤，充分混匀，称取100 g放于各处理的网兜内，使线虫置于与周围一样的土壤环境中，然后用尼龙扎带封口。除对照组外，每处理、每深度包含21个袋。对照组每深度24个袋，分3次取样。共计（2×2×2×7+2×8）×3=216袋。共22个小组样方（1 m×10 m），每个样方包含10袋不同深度（15 cm和5 cm）相间排列，来自不同处理的袋子根据深度随机放入，其中一个样方放6个对照组（深度15 cm和5 cm各3袋，每次取样一组）。在整个实验过程中，用5 cm和15 cm的2支不同规格直角曲管地温计，分别插入试验地相应深度（5 cm和15 cm），每次取样时人工观测并记录两种深度的土壤温度。每次取样后，每个深度均称取10 g土壤，105 ℃烘干到恒重，然后计算土壤相对湿度。采样日期分别为2013年12月8日、2014年2月18日和4月14日。

为了观察尼龙网袋中线虫活力，试验采用大蜡螟诱捕法对线虫活力进行评价。从每个样袋内称取约15 g土壤，放于直径6 cm的塑料培养皿内，然后加入体重相近的大蜡螟5头，并向每个培养皿内加入适量水，使整个培养皿的小环境维持一定的湿度，用封口膜将培养皿封好，用医用注射器扎4~6个孔。将培养皿置于25 ℃的恒温培养箱黑暗条件下进行诱捕。在第3、5、7 d记录每皿内大蜡螟的死亡头数，最终计算第7 d大蜡螟的死亡率。

采用浅盘法评价尼龙网袋中具有活力的线虫总数。从每个样品内称取20 g左右的土壤，将其放置在浅盘内，小心铺平，然后从浅盘外围加入约150 mL水。室温25 ℃条件下静置48 h后，将溶液倒出，再静置40 min，将溶液上清部分吸走，剩余约5 mL，在倒置显微镜下观察并计数。最后计算样袋内活线虫的数量，并统计分析。

所有数据进行单因素方差（ANOVA）分析，用Turkey HSD对平均值进行多重比较。其中线虫数量进行ln（x+1）转换（x为100 g干土内的线虫数量），并进行统计分析。以单变量检测土壤深度、取样时间、线虫品系和施用形式对大蜡螟死亡率以及线虫数量的影响，P≤0.05为差异显著。所有数据利用SPSS20进行统计分析。

在两种深度条件下CK组的诱捕率在三次取样中均为0%，故试验样地本身不存在昆虫病原线虫。由图1可知，土壤深度5 cm和15 cm条件下各处理致死率表现出相同趋势。随着越冬时间的延续，S. carpocapsae线虫悬液处理线虫一直维持较高的毒力，三次取样没有差异；H. bacteriophora线虫悬液处理线虫毒力持续下降，其中最后一次取样土壤深度5 cm处线虫毒力几乎为零，而土壤深度15 cm处线虫毒力维持在50%左右。虫尸剂处理结果为S. carpocapsae毒力高于H. bacteriophora。最后一次取样结果表明，土壤深度5 cm和15 cm处S. carpocapsae虫尸剂具有高于其他两次取样的趋势，其中15 cm处差异达到显著水平。

每种线虫品系的不同施用方式处理中字母不相同表示不同采样 时间对大蜡螟的致死率差异显著（P < 0.05）。下同 Bars with different letters within an application method of each nematode strain indicate significant difference between different sampling times（P < 0.05）. The same as below 图 1 大蜡螟置于不同深度土壤中的死亡率 Figure 1 Mortality of G. mellonella larvae exposed to different soil samples

图选项

随着越冬时间的延续，各处理的土壤线虫数量在5 cm和15 cm两个土壤深度基本表现出相同的趋势（图2）。

图 2 不同取样时间不同土层各处理样袋内线虫数量 Figure 2 Number of nematodes in each treatment at different sampling times

图选项

从对照来看，土壤深度5 cm和15 cm处活的线虫数量比较稳定而且数量接近。土壤线虫的增量主要是线虫悬液或虫尸剂释放的线虫引起。就线虫悬液而言，土壤线虫活体数量随着越冬时间延续显著下降。其中5 cm处H. bacteriophora悬液处理中土壤线虫数量下降更明显。

虫尸剂处理中，S. carpocapsae线虫处理最后一次取样的土壤中线虫总数显著高于其他处理。15 cm土壤处H. bacteriophora虫尸剂最后一次取样线虫总数显著高于对照，但5 cm土壤处 H. bacteriophora虫尸剂最后一次取样却与前两次取样无差异。

单变量方差分析结果（表2）显示，土壤深度、取样时间、线虫品系和施用方式对大蜡螟的死亡率和线虫数量有极显著的影响，两两之间的交互作用以及取样时间和其他任何一种因子的交互作用均对大蜡螟的致死率和线虫数量有显著的影响。

表 2 土壤深度、取样时间、线虫品系以及施用方式对大蜡螟致死率和线虫数量的影响 Table 2 Effects of soil depth，sampling time,species and application approach on G. mellonella mortality and total nematode number

表选项

本试验直接将线虫埋在土里，避免了紫外线、环境湿度的胁迫，越冬过程中只有环境低温的影响，将为昆虫病原线虫在我国北方的应用提供一定的理论依据。

实验室一般用孔径25 μm尼龙筛网收集线虫，已经能将线虫分离^[16]。因此，试验中采用孔径25 μm尼龙网做成的试验袋能够阻止线虫在尼龙袋和周围土壤之间移动，当然不能排除个别体长短小的线虫主动钻出尼龙袋。我们的设计能够相对准确的评价尼龙袋内基质中的线虫数量，从而为试验的顺利进行奠定基础。

三次诱捕实验中，对照组内的大蜡螟均未死亡，说明实验样地土壤本身不含有土著昆虫病原线虫。最后一次取样的结果表明，悬液组S. carpocapsae和H. bacteriophora在5 cm和15 cm深度处的最终存活率分别为4.5%、3.4%以及0.5%、2.5%，数量远远低于施用时的量。S. carpocapsae虫尸剂随着温度的回升开始释放线虫，且释放的侵染期线虫数量与相应土壤深度处线虫悬液组的线虫数量无显著差异。同时，我们观察到置于15 cm深度处的 H. bacteriophora虫尸剂在最后一次取样时，也有一定数量的侵染期线虫释放。总之，昆虫病原线虫S. carpocapsae较H. bacteriophora 的低温耐受性更强。

土壤相对湿度对于昆虫病原线虫在土壤内的存活十分重要^{[17, 18]}，能够影响线虫的毒力^[19]。每次取样测定的土壤相对湿度结果表明，15 cm深度的相对湿度均稍微高于5 cm深度，只有最后一次取样，由于前两天实验样地进行了漫灌，两种深度的相对湿度相同。随两种深度土壤湿度的变化，几乎每种处理（除去对照组）15 cm深度处的线虫数量均高于5 cm深度处的数量。本实验结果与李春杰等^[13] 的调查结果一致，在越冬过程中，即15 cm深度处侵染期线虫的存活率高于5 cm深度的存活率。

土壤温度同土壤湿度一样，也对昆虫病原线虫的存活、毒力、繁殖以及迁移有影响^[20]，被认为是影响侵染期线虫毒力的重要因子^[21]。5 cm深度的土温变化较15 cm深度更为强烈，15 cm深度处的线虫存活率更高。除土壤的温度、湿度外，土壤质地类型^[22]以及日常的农田管理如犁地^[23]和喷施杀虫剂^[24]等也会影响线虫的存活。

有多个试验研究表明昆虫病原线虫悬液在释放到土壤中时，种群密度下降非常迅速^[25]。Ishibashi等^[26]的研究表明，将S. carpocapsae侵染期线虫悬液喷洒到土壤表面后，其种群密度下降非常迅速，并且两周后很难从土壤中回收。出现这种情况的原因可能是紫外线、干燥^[7]以及低温对线虫的存活产生了负作用。本研究中，整个试验过程线虫几乎没有受到紫外线以及干燥的胁迫，但最终存活率依旧很低（图2），因而利用昆虫病原线虫进行生物防治的时候，要设法提高侵染期线虫在土壤中的存活率以及持续能力。

在环境胁迫条件下，虫尸剂能够帮助线虫抵御不良环境^[9]。虫尸剂组在前二次诱捕实验结果显示（图1），S. carpocapsae和H. bacteriophora虫尸均未释放侵染期线虫，在4月中旬取样检测到侵染期线虫，可能是由于在最初的两个月里，气温低、土壤温度也较低，外界环境条件恶劣，虫尸剂几乎没有释放线虫，这也许是一种对种群的保护策略。4月中旬，由于气温升高，土温（5 cm处13.3 ℃；15 cm处13.4 ℃）也比较适合侵染期线虫的存活，在5 cm和15 cm深度，S. carpocapsae较H. bacteriophora虫尸处理分别多释放了974条和3109条线虫。正如Bornstein-Forst等^[27]对S. carpocapsae A10线虫的研究结果表明，低温胁迫会对线虫在大蜡螟寄主体内的发育产生负面影响，其在低温条件下发育过程会停止，并且大蜡螟体内的线虫会死亡很大一部分；同时，温度升高，到适合线虫发育后，体内的线虫会发育成为侵染期线虫，但是数量远远少于室温培养下的线虫。这与本试验结果一致，最终虫尸剂组的线虫数量也较室温培养下的数量少很多。有研究表明，在低温条件下，H. bacteriophora虫尸释放的侵染期线虫数量较S. carpocapsae虫尸释放的数量显著下降^[28]。Elmowitz等^[25]的研究没有发现昆虫病原线虫在寄主体内越冬的生存策略，尽管实验室内的研究认为它是一种潜在的帮助昆虫病原线虫越冬的一种方法，并认为侵染期线虫在寄主体外的存活才是线虫的越冬方式。在4月中旬经历了整个严冬后，S. carpocapsae 虫尸剂组及其悬液组在两种深度条件下数量并无显著差异，H. bacteriophora虫尸释放线虫量较少。H. bacteriophora 虫尸剂在三次取出后于室温下培养，发现虫尸剂上长满了真菌，但由于条件限制，并未检测真菌的具体类型。在昆虫尸体表面进行包衣处理，有针对性的预防真菌感染，也许会提高H. bacteriophora 虫尸剂的线虫释放率。在施用虫尸剂时进行适度的干燥处理，虫尸剂释放的线虫数量会增加^{[11, 29]}。总之，本试验结果表明，利用适度干燥的虫尸剂来帮助昆虫病原线虫越冬，有助于生物防治措施持续控制有害昆虫。

与H. bacteriophora相比，在两种形式（虫尸剂以及线虫悬液）条件下，S. carpocapsae均表现出更强的存活持续能力（图2）。这与Susurluk^[30] 连续两年的研究结果相一致，即在低温条件下，斯氏属线虫较异小杆属线虫的存活能力更强，但他认为这是由于低温对H.bacteriophora迁移能力的抑制性更强，即在低温等不良环境条件下，线虫会进行垂直方向上的迁移运动。但本实验中，因为将所有处理的线虫及虫尸剂均密封于孔径为25 μm的尼龙网内，线虫扩散受限，垂直迁移运动也被限制，所以结果更能说明H. bacteriophora较S. carpocapsae对低温的反应更为敏感，S. carpocapsae 耐受低温的能力更强。

Ma等^[31]初步筛选了37种昆虫病原线虫对韭蛆的致死效率，结果表明昆虫病原线虫的浓度为50IJ/韭蛆时，能取得良好的致死效果。本试验在最终取样时，S. carpocapsae虫尸剂在5 cm和15 cm深度的线虫数量分别为1436条和3598条，这些线虫足以杀死1 m2内的害虫。可见，利用昆虫病原线虫虫尸剂代替化学农药进行害虫防治是一种较好的生物防治方法，不仅有效而且可以减轻化学农药对土壤^[32]、地下水^[33]、人类健康^[34]的影响。

本研究表明，昆虫病原线虫H. bacteriophora和S. carpocapsae能够安全度过华北地区寒冷的冬季，为两种线虫在生物防治中的应用提供了一定的理论基础。两种品系的线虫能否度过华北炎热的夏季，线虫的毒力是否持续，两种施用方式下线虫毒力是否存在差异？无疑需要进一步深入研究。总之，昆虫病原线虫在田间的种群动态和活力研究，对于利用这一生物措施部分替代化学杀虫剂防治有害昆虫，提高农产品质量，保护水体和土壤等的安全具有重要意义。

昆虫病原线虫H. bacteriophora和S.carpocapsae能够安全度过华北地区寒冷的冬季，各处理组在15 cm深度处的线虫数量均高于5 cm深度处。线虫悬液施用的最终存活率较低，且H. bacteriophora较S. carpocapsae对寒冷更为敏感。部分侵染期线虫的成功越冬，为线虫种群的繁衍提供了直接证据。4月中旬取样结果表明，虫尸释放侵染期线虫的数量与悬液组无显著差异。可见，在避免紫外线和干燥两种胁迫的同时，虫尸剂也有助于昆虫病原线虫越冬，直接施用虫尸剂将是一种有潜力的生物防治措施。