随着我国规模化畜禽养殖业的迅速发展，大量畜禽粪便已成为新的污染源。高温好氧堆肥是畜禽粪便无害化处理和肥料化利用的重要途径^{[1, 2]}。传统堆肥一般发酵周期较长，效率低，为加快堆肥腐熟进程，人们往往对堆肥原料进行预处理，在预处理过程中，使用最多的方法是向物料中加入微生物制剂^{[3, 4]}。据报道，我国生产微生物菌剂的厂家已超过2000 家^[5]。但不同复合菌剂、不同的添加辅料和配比，导致堆肥腐熟效果不同^{[6, 7, 8, 9, 10]}。探明不同畜禽粪便中微生物的数量变化规律对于选择适宜的畜禽粪便堆肥菌剂，促进其堆肥效果具有重要的意义。

堆肥过程中，易分解的有机物（如淀粉、糖类等）和较易分解的有机物（如纤维素等）在升温和高温期在酶参与下已得到分解，此阶段微生物活动最为强烈。对堆肥升温期和高温期微生物数量和酶活性进行研究，了解堆肥过程中微生物动态变化，有利于推断有机物的降解程度^[6]。然而，以往的研究着重于单一微生物数量或者酶活性变化规律研究，而对堆肥微生物与酶活及温度变化的关系关注较少。因此，对堆肥启动及高温过程中微生物及酶活性变化进行研究，有利于了解堆肥启动期和高温期的生物化学过程，揭示影响畜禽粪便堆肥持续高温的主要因素，从而为适合于不同畜禽粪便的微生物菌种筛选、堆肥辅料组合配制及适宜的接种时间等提供重要理论依据。

堆肥用原料猪粪、牛粪取自江苏省农业科学院六合动物科学基地，鸡粪取自江苏省农业科学院附近蛋用鸡养殖场。其基本理化性质见表 1。

表 1 堆肥原料的基本性质 Table 1 Basic characteristics of composting materials

表选项

将新鲜的鸡粪、猪粪和牛粪在阴凉处风干至含水率为55%左右开始堆肥。堆肥试验在江苏省农业科学院网室内进行，堆肥共设三个处理，分别为鸡粪、猪粪、牛粪。堆体均为锥形体，规格为直径1.5 m、高1 m。堆肥过程中不翻堆，共堆制11 d。在堆肥第0、4、 8、12、16、20、24、30、42、54、66、92、102、117、126、138、208、256 h取样，每次按四分法从堆肥外层、中层、里层各取约 200 g样品，混匀；然后把样品一分为二，一份在4 ℃冰箱保存用于微生物指标测定，一份风干磨细用于理化性质测定。

堆肥温度测定：将水银温度计从堆体部四周插入，在堆体上（距离地面80 cm）、中（距离地面50 cm）、下层（距离地面20 cm）分别插入温度计，插入深度为30 cm。每隔一段时间记录堆温和气温，以所得平均值为最终堆体温度。

pH值采用肥水比1∶5（W/W），ORION酸度计测定；电导率采用肥水比1∶5（W/W），雷磁DDS-307电导率仪测定。含水率、有机质、全氮、灰分的测定采用国家标准方法^[11]。有机物损失率（OM-loss，%）=（X₂-X₁）/X₁×100，其中X1、X₂为堆肥开始和结束时灰分含量。

可溶性有机碳（DOC）、可溶性有机氮（DON）测定：称取10 g新鲜堆肥于50 mL 三角瓶中，加50 mL 0.5 mol·L^-1 K₂SO₄振荡1 h 后以滤纸过滤，然后过0.45 μm 滤膜，取上清液用TOC（Analytikjena multi N/C 3100）测定待测液中的DOC、DON。

堆肥中细菌、真菌、放线菌数量测定采用梯度稀释涂平板法。所用培养基分别是牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基和高氏1号培养基^[12]。纤维素分解细菌、真菌分别在Mendels、刚果红培养基培养2 d和5 d后开始计数^{[13, 14]}。嗜温和嗜热微生物培养温度分别为30 ℃和55 ℃。堆肥蛋白酶、纤维素酶、脱氢酶的测定分别采用福林酚法、3，5-二硝基水杨酸法、三苯基四唑氯化物（TTC）法^[15]。蛋白酶活性以1 h后1 g样品产生的酪氨酸质量表示（μg Tyr·g^-1·h^-1）；纤维素酶活性以24 h 后 1 g 样品生成葡萄糖的质量表示（mg·g^-1·d^-1）；脱氢酶活性以每24 h 每克样品中生成的1，3，5-三苯甲臢triphenyl formazan（TPF）的质量表示（μg TPF·g^-1·d^-1）。

图表采用Sigmaplot 10.0制作，数据显著性分析采用SPSS 16.0软件进行。

堆肥过程中的温度变化是堆肥腐熟的重要参数之一。在11 d的堆置期间，各处理温度在2 d内均可升至50 ℃以上，并维持此温度的时间均超过5 d，达到了粪便无害化标准^[16]。2 d后各处理温度逐渐升高并达到最高峰，其中牛粪最先（66 h）达到最高温度（61.6 ℃），其次为鸡粪，发酵71 h时达到最高温度61.3 ℃，此后略有下降；猪粪发酵138 h后温度达到峰值（66.8 ℃），此后一直维持在66 ℃以上，见图 1（A）。堆肥过程中，三种堆肥含水率变化如图 1（B）所示，各处理初始含水率为50%~55%，随着堆肥的进行，各处理含水率很快下降，至试验结束时，鸡粪、猪粪、牛粪堆肥的含水率均下降至39%左右。

图 1 堆肥前期温度和含水率变化 Figure 1 Temperature and moisture variations in different waste piles during early stage of composting

图选项

图 2（A）所示的是堆肥过程中pH 值的变化趋势。在前3 d（升温期），由于微生物分解蛋白质类有机物产生氨氮，促使pH值上升较快^[17]。试验结束时，鸡粪、猪粪两种堆肥的pH值分别为9.1、8.8。由于牛粪中蛋白质类有机物含量较鸡粪和猪粪少，在堆肥后期，随着氨的挥发及蛋白质类有机物的降解，pH 值下降到8.2。堆肥中电导率的变化在一定程度上反映了堆肥中有机、无机氮的相互转化程度和可溶性盐的浓度^[18]。从图 2（B）可以看出，鸡粪堆肥电导率呈先上升后下降趋势，猪粪、牛粪堆肥电导率前期上升明显，后期变化不大。三种堆肥原料相比，鸡粪堆肥的电导率最大、其次为猪粪，牛粪堆肥电导率最小。

图 2 堆肥前期pH、电导率变化 Figure 2 Dynamics of pH and EC in different waste piles during early stage of composting

图选项

水溶性有机碳（DOC）是微生物在分解有机物料中半纤维素、纤维素等的产物，但它又是微生物本身所依赖的碳源与能源^[19]。DOC含量可能与物料的分解速度和微生物的利用有关。堆肥前期，水溶性有机碳呈波动上升趋势，可能是因为堆肥前期物料中有机碳分解的速率大于微生物的降解和利用，使得堆肥中水溶性有机碳含量增加^[20]。堆肥前期水溶性氮的含量呈上升趋势，鸡粪、猪粪、牛粪堆体DON含量在48~72h达到最大值，分别由初始的2.78、2.75、0.16上升到4.46、4.21、2.16 g·kg^-1。这是部分无机 N 转变成有机N，而被同化固定下来的缘故^[21]。堆肥物料间相比，堆肥前期猪粪和鸡粪DOC、DON含量相近，后期猪粪DOC含量显著高于鸡粪，牛粪DOC、DON含量最小（图 3）。

图 3 堆肥前期可溶性有机碳、可溶性有机氮含量变化 Figure 3 Dynamics of water soluble carbon（DOC） and water soluble nitrogen（DON） in different waste piles during early stage of composting

图选项

堆肥开始后的72 h内，鸡粪、猪粪、牛粪堆体C/N比分别由初始的34、32、42上升到最大值41、35、52，72 h后3种堆体C/N开始下降，至试验结束（256 h）时，C/N下降至初始水平。在整个堆肥期间，牛粪C/N最大，其次为鸡粪，猪粪C/N最小，见图 4（A）。从有机质消耗曲线来看，牛粪堆肥72 h前的有机质消耗速率最大，此后逐渐放缓，鸡粪、猪粪堆置120 h有机质消耗最快。至试验结束，鸡粪、猪粪、牛粪有机物分别损失了33%、30%、15%，见图 4（B）。

图 4 堆肥前期碳氮比、有机物损失率变化 Figure 4 Changes of C/N and organic matter loss rate in different waste piles during early stage of composting

图选项

微生物的数量直接影响堆肥的进程。堆肥过程中细菌是分解有机物和产热的主要微生物种群。在堆肥初期，一些嗜温性和嗜热性细菌快速增殖，堆肥前期，鸡粪、猪粪、牛粪堆体嗜温性细菌持续上升并达到最大（表 2）。鸡粪、猪粪、牛粪堆置138 h、96 h、24 h后分别由初始的8.38、8.81、7.23 lg CFU·g^-1上升至10.15、9.63、8.83 lg CFU·g^-1。当堆肥进入高温期后，随着温度的升高和营养物质的消耗，嗜温性细菌数量开始下降，嗜热性细菌则呈不断上升趋势，堆肥结束时，鸡粪、猪粪、牛粪嗜热细菌数量分别由初始的4.79、4.37、5.23 lg CFU·g^-1上升至6.05、6.69、6.83 lg CFU·g^-1（表 2）。

表 2 堆肥前期各类型微生物数量（lg CFU·g^-1）变化 Table 2 Changes of mesophilic and thermophilic microbiological populations（lg CFU·g^-1） in different waste piles during early stage of composting

表选项

在堆肥前期，嗜温性放线菌数量的变化趋势与细菌大致相同，但其数量较细菌少。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥的嗜温性放线菌数量分别在92 h、72 h、138 h达到最大（表 2）。整体而言，牛粪高温放线菌数量显著高于鸡粪和猪粪，且随温度的上升呈上升趋势，说明放线菌是牛粪堆肥高温期分解木质纤维素的优势菌群，在堆肥高温期能稳定分解木质纤维素^[22]。Liu等^[23]研究表明，牛粪与稻糠堆肥中嗜温性细菌和放线菌数量呈先上升后下降趋势，与本研究结果一致。Goyal等^[2]研究了鸡粪、牛粪与甘蔗秸秆混合堆肥嗜温和嗜热性微生物变化规律，结果表明嗜热性微生物数量在前14 d呈持续上升趋势。

真菌对堆肥原料的分解起着重要作用，特别是高温真菌对纤维素具有很强的分解作用^[24]。堆肥前期，三种粪便中真菌数量均显著低于细菌和放线菌。堆肥过程中，鸡粪、猪粪堆肥嗜温性真菌数量无明显变化趋势，牛粪堆肥中嗜温真菌数量呈先上升后下降趋势，且牛粪堆肥中真菌数量显著高于（P≤0.001）猪粪堆肥和鸡粪堆肥（表 2）。在本试验中，猪粪堆肥和鸡粪堆肥过程中均未分离到嗜热真菌。Tiquia等^[25]研究了堆肥中真菌数量变化规律，结果表明大多数真菌在堆肥温度高于50 ℃时均消失，但当温度低于45 ℃后一些真菌群落开始恢复。牛粪堆肥中嗜热真菌的数量随着堆肥温度的升高而增加，与Goyal等^[2]的研究结果一致。

堆肥过程中，纤维素分解菌通过分泌纤维素酶对纤维素、木质素等的降解是堆肥腐熟的关键^[25]。本试验中，鸡粪、猪粪、牛粪堆肥中嗜温性纤维素分解细菌和真菌数量也呈现先上升而后下降并逐步趋于平稳的趋势（表 2）。牛粪堆肥中嗜温和嗜热纤维素分解菌的数量均显著高于猪粪和鸡粪堆肥（P≤0.001），与牛粪的纤维素含量较猪粪、鸡粪高有关。鸡粪和猪粪堆肥嗜热性纤维分解细菌在48 h后随着温度的上升而升高。牛粪堆肥中嗜热纤维素分解菌的数量随着温度的上升而持续增加，牛粪堆肥结束时，嗜热纤维素分解细菌的数量均较初始值增加了1个数量级。这与Liu等^[23]的研究结果一致。Kornillowicz-Kowalska等^[26]研究也发现，动物羽毛废弃物堆肥第1周嗜温性纤维素分解菌占绝对优势，且其数量达到最大，但随着堆肥温度的上升，嗜温性纤维素分解菌数量开始下降，嗜热性纤维素分解菌数量开始上升。这是因为在堆肥初期由于存在大量的可溶性碳源供微生物利用，但随着堆肥的进行，这些可溶性物质被消耗殆尽，一些复杂碳源如木质纤维素类开始被降解，纤维素分解菌数量增加^[23]。本试验中（表 3），牛粪堆肥的温度与嗜热纤维素分解细菌数量相关性达显著水平r²=0.765（P≤0.05）。梁东丽等^[10]研究也表明，鸡粪、猪粪、牛粪堆肥温度与纤维素酶活性呈显著正相关关系，说明堆肥高温期，嗜热性纤维素分解菌对纤维素、木质素等的矿化和分解及高温的维持起了重要作用。在猪粪、鸡粪堆肥高温期接种嗜热性纤维素分解菌可能加快堆肥中有机质分解和转化，促进腐熟。

表 3 不同类型微生物数量与堆肥温度的相关性（r²值） Table 3 Correlationship between microbial population and temperature（r²）

表选项

脱氢酶变化可反映堆肥过程中有机物质的氧化程度^[10]。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥过程中脱氢酶活性的变化趋势都随着反应的进行先上升后下降（图 5A），且鸡粪和猪粪堆体的脱氢酶活性上升速度和峰值均较牛粪大。由表 4可见，鸡粪、猪粪堆肥脱氢酶活性变化均与嗜温纤维素分解菌数量显著相关（P≤0.05），牛粪脱氢酶活性与嗜温真菌及嗜热菌数量呈显著正相关（P≤0.05）。本试验脱氢酶活性变化趋势与梁东丽等^[10]、高华等^[27]报道一致，但活性高峰提前，其原因可能是堆肥原料与堆肥方式差异所致。

图 5 堆肥过程中脱氢酶、蛋白酶、纤维素酶活性变化 Figure 5 Dynamics of dehydrogenase（A），protease（B） and cellulase（C） activities in different waste piles during composting

图选项

表 4 堆肥前期脱氢酶、蛋白酶、纤维素酶活性与微生物数量的关系 Table 4 Correlation between microbial population and activities of dehydrogenase，protease and cellulose

表选项

蛋白酶主要参与堆肥中氨基酸蛋白质等含氮化合物的分解和转化，是参与堆肥过程氮素转化的最重要酶^{[28, 29]}。由图 5（B）可见，堆肥过程中蛋白酶活性变化趋势也是随堆肥进行呈现波动上升趋势。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥蛋白酶活性均在升温期的前24 h增幅最大。这是因为在堆肥初期粗蛋白成分较多，有机质含量高，营养丰富，促进了产蛋白微生物的生长及蛋白酶的合成，蛋白酶活迅速上升^{[17, 23]}。进入高温期，蛋白酶活仍然较高，说明此阶段氨基酸蛋白质类物质尚未完全降解。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥蛋白酶活性分别在第117 h、66 h、16 h达到峰值，其峰值分别为93.2、66.4、56.8 mg·g^-1·d^-1。鸡粪堆肥蛋白酶峰值最大，这是由于家禽消化系统的特殊结构和消化道长度较短等原因，家禽饲料利用率较低，家禽粪便中有机氮含量较多^[30]。鸡粪、猪粪堆肥蛋白酶活性与嗜温性细菌和放线菌数量显著正相关，牛粪堆肥蛋白酶活性除了与嗜温性细菌显著正相关外，与嗜热放线菌及嗜热纤维素分解菌数量的相关性也达到显著水平。Liu等^[23]研究发现，牛粪和稻糠体积比85/15混合堆肥，蛋白酶活性呈现先上升后下降趋势。De等^[31]采用马粪、鸡粪和稻秸混合堆肥蛋白酶活性也呈相同趋势。

纤维素酶是堆肥有机质转化的重要酶，主要参与纤维素的水解，最终生成葡萄糖^{[32, 33]}。纤维素酶活性与环境的呼吸强度有关，同时也受底物诱导和降解产物的阻遏^{[8, 34]}。三种畜禽粪便堆肥过程中纤维素酶活性（以葡萄糖计）变化趋势有所不同，猪粪和牛粪基本上呈现波动上升趋势，鸡粪堆肥则是先上升后下降趋势（图 5C）。梁东丽等^[10]研究表明，鸡粪、猪粪、牛粪堆肥前15 d纤维素酶活性均呈上升趋势，可能是因为鸡粪纤维素含量较低，且本研究未添加秸秆等堆肥辅料。三种粪便堆肥过程中纤维素酶活性均在升温期和高温期出现2个较为明显的波峰，说明在畜禽粪便中的纤维素是在不同阶段由不同产纤维素酶微生物种群逐步降解的。堆肥初期，分泌纤维素酶的微生物主要是嗜冷微生物，随着堆体温度上升，嗜热微生物、中温微生物均随之增多，其活性也逐渐增大，因此纤维素酶活性增加^[10]。三种粪便相比，堆肥前期牛粪堆肥纤维素酶活性明显高于猪粪和鸡粪，与梁东丽等^[10]的研究结果一致。升温后期猪粪堆肥纤维素酶活性上升较快，与高温期猪粪堆肥中嗜热性微生物数量的显著上升有关，因为猪粪堆肥纤维素酶活性与嗜热性微生物数量相关性较好。鸡粪堆肥纤维素酶活性在升温后期出现明显下降，可能是因为高温期大量嗜温性微生物死亡，而鸡粪堆肥中高温纤维素分解菌数量又较低（表 4）。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥纤维素酶活性的大小均与温度呈显著正相关，皮尔逊相关系数分别为r²=0.555（P=0.017）、r²=0.525（P=0.025）、r²=0.680（P=0.002）。

（1）鸡粪、猪粪、牛粪调节含水量至55%左右，堆肥温度在2 d内均可升至50 ℃以上，并且维持此温度的时间均超过5 d。

（2）在堆肥过程中，鸡粪、猪粪、牛粪中的细菌、真菌、放线菌数量变化趋势相同，表现为嗜温性均是先升高后降低；嗜热菌的数量随温度的上升而上升。牛粪堆肥中真菌、嗜热放线菌及纤维素分解菌的数量显著高于鸡粪和猪粪堆肥。

（3）鸡粪、猪粪、牛粪堆肥过程中脱氢酶活性变化趋势为先升高后下降。三种畜禽粪便堆肥蛋白酶活性随温度的升高而上升，鸡粪堆肥蛋白酶峰值最大。猪粪和牛粪堆肥纤维素酶活性呈波动上升趋势，鸡粪堆肥则是先上升后下降趋势。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥纤维素酶活性的大小均与温度呈显著正相关，因此在堆肥高温阶段接种嗜热性纤维素分解菌对于维持堆肥高温，加速堆肥有机质降解，促进腐熟有重要意义。