油污染对海洋生物的毒性效应研究已有大量的报道，国际上Rice等^[1]和Wells等^[2]系统阐述埃克森瓦尔笛兹号油轮事故所产生的生态影响，给出该漏油事故对海洋动物的致死效应，得出长期毒性影响主要由高分子量的PAHs引起，在鱼类的产卵期、幼年期等生长敏感期发生油污染事故会造成更严重的影响。国内针对胜利原油、南海原油等开展了对不同海洋生物急性毒性效应研究^{[3, 4, 5]}，已有的研究结果表明油污染对海洋生物具有显著的毒性效应。溢油分散剂具有将海面油膜乳化、消除海面油膜和降低局部水体中油浓度的作用，被广泛使用于海洋溢油事故的处理^{[6, 7]}。溢油分散剂仅是将溢油分散，而分散的油滴被生物降解需要一定的时间，而且溢油分散剂本身对生物具有一定的毒性，可能会带来二次污染的问题。因此，一批低毒高效的溢油分散剂产品被成功开发和批准使用^{[8, 9]}，我国颁布了《溢油分散剂技术条件》^[10]和《溢油分散剂使用准则》^[11]等相关标准。关于溢油分散剂的毒性效应已有许多研究报道，但现有的研究主要针对溢油分散剂产品的毒性效应^{[12, 13, 14]}。有关溢油分散剂与石油的联合毒性已引起人们的关注，大多研究表明溢油分散剂处理后原油对生物的毒性增加^{[15, 16, 17, 18, 19]}，也有少量研究报道溢油分散剂处理原油后对生物毒性降低^[20]。总体上这方面研究报道相对较少，且主要针对鱼类^[17]、虾类^{[15, 25]}、刺参^[21]等类群中的某单一种类。除文献^[22]和^[23]研究了平湖原油对黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)和缢蛏(Sinonovacula constrzcta)的富集特性和基于综合生物标志物响应指数评价平湖原油对缢蛏的毒性效应^[24]外，本研究涉及的平湖原油和溢油分散剂处理的平湖原油对受试生物的毒性效应尚未见报道。本研究通过分别开展溢油分散剂、平湖原油的水溶性组分(WAF)和溢油分散剂处理的平湖原油的水溶性组分(DWAF)对不同海洋生物(鱼、虾、贝幼体)的急性毒性效应实验，比较毒性效应的差异，为溢油分散剂的使用、影响评价提供参考依据。

实验所用海水样品从自然海区抽取，盐度为21，pH为8.1，进行沉淀和砂滤，充分曝气(24 h以上)后备用。实验用黑鲷仔鱼由育苗场内直接培养孵化，为未开口刚孵化3 d的仔鱼，幼鱼体长(4.74±1.35)cm，体重(2.98±1.88)g；实验用脊尾白虾(Palaemon carincauda)幼体为江苏启东近海捕捞的抱卵亲体经土塘孵化后的糠虾幼体(M2)，平均体重(0.002 9±0.000 3) g；实验用缢蛏幼体为江苏启东近海采捕的缢蛏稚贝，平均体重(1.962±0.231)g。实验用溢油分散剂为上海新络滤材有限公司生产的捷菲特001，属常规型，主要技术指标包括：燃点85 ℃，密度0.88 g·cm^-3，粘度(30 ℃)46．7 mm·s^-1，可生物降解性BOD5/COD为34%，鱼类急性毒性(3000 mg·L^-1半致死时间)40 h。实验用原油取自东海平湖油气田开采的原油，为棕黑色，粘稠状液体，不透明，密度0.97 kg·L^-1。

WAF中主要成分的测定采用气相色谱质谱组分分析法，由同济大学理学院化学系实验室分析。具体处理方法：取 2000 mL的东海平湖原油，用 60 mL正己烷(色谱淋洗级)分 4 次萃取，每次用康氏振荡器振荡 2 min 后静置分层，共获得约 60 mL正己烷萃取液。用氮吹仪(3 L·min^-1)浓缩至 1 mL后吸取上层正己烷(底部有少量水)，上机进样进行 GC-MS 分析。分析条件：自动进样、不分流；载气为氦气(1.0 mL·min^-1)；进样量0.2 μL；进样口温度290 ℃；传输线温度280 ℃；柱温程序为初始 50 ℃，恒温1 min 后以 6 ℃·min^-1的速率升温至280 ℃，恒温保持10 min；离子源为EI源，电离能量70 eV，离子化电流300 Pa，离子源温度200 ℃；扫描范围50~550 amu自动调谐；质谱检索采用NIST98谱库^[25]。

参照文献^[4]，将东海平湖原油分别与沙滤海水按1∶10(V∶V)配比，置于磁力搅拌机上，连续高速搅拌24 h后静置30 min分离出水相，作为WAF母液贮存瓶中，使用紫外分光光度计法测定石油烃的含量，置于冰箱4 ℃保存。

参照文献^[20]，溢油分散剂处理平湖原油的制备：将溢油分散剂与已制备好的WAF母液按体积比1∶5混合，置于磁力搅拌机上连续高速搅拌1 h后静置1 h，此乳状混合液即为毒性实验的DWAF母液。使用紫外分光光度计法测定石油烃的含量。

实验浓度设置：溢油分散剂以及溢油分散剂处理前和处理后的平湖原油浓度分别在预试验基础上获得最高浓度，然后按等对数间距设置5个浓度组，同时以自然海水为对照组，每个浓度组设3个平行样，进行96 h急性毒性实验，每天换水1次，不投喂。

仔鱼实验：在每个1000 mL烧杯中放入30尾仔鱼；幼鱼实验，在每个5000 mL搪瓷缸中放入15尾幼鱼；脊尾白虾幼体实验，在每个1000 mL的烧杯中投放糠虾幼体30尾；缢蛏幼体实验，在每个1000 mL的烧杯中投放稚贝15只，每天换水1次。实验期间，每2 h观测1次，记录死亡个数。当仔鱼出现尾部弯曲、躯体发白，幼鱼漂浮于水面鱼肚朝上或完全下沉至水面底部、碰触鱼体不动，脊尾白虾体色发白、沉降至容器底部，缢蛏外壳张开且无法闭合时，判定为死亡。

采用概率单位算法，应用SPSS 17.0软件对各实验数据进行处理和统计分析，求得回归方程，计算半致死浓度LC₅₀及 95%置信区间，P＜0.05为相关性显著，P＜0.01为相关性极显著。

采用气相色谱质谱组分分析法，测定了WAF主要成分。图 1为WAF总离子流色谱图。分析结果显示WAF中苯、萘、茚等芳烃及其取代物含量约占总成分的28.5%，烷烃约占48%，其余为苯甲酸、酚、烯烃、杂环化合物等。

图 1 WAF总离子流色谱图 Figure 1 Total ion chromatogram of WAF

图选项

试验测定了不同溢油分散剂浓度下黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体死亡率随时间的变化情况(图 2)。通过统计软件处理，得出了溢油分散剂对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体的剂量效应关系式、相关系数和96 h LC₅₀值(表 1)。由表 1可看出，溢油分散剂对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体存在极显著的剂量效应关系(P < 0.01)。以96 h LC₅₀值为判别标准，溢油分散剂对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体的毒性效应大小依次为脊尾白虾幼体(57.55 mg·L^-1)>黑鲷仔鱼(136 mg·L^-1)>黑鲷幼鱼(261 mg·L^-1)>缢蛏幼体(397 mg·L^-1)。

图 2 溢油分散剂各浓度组中4 种海洋生物随时间的死亡率 Figure 2 Mortality of four organisms in different oil dispersant concentrations over time

图选项

表 1 溢油分散剂对黑鲷仔鱼、幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体的急性毒性 Table 1 Acute toxic effects of oil dispersant on larvae and juveniles of Acanthopagrus schlegelii，and juveniles of Palaemon carincauda and Sinonovacula constrzcta

表选项

试验测定了不同浓度组的WAF和DWAF对黑鲷仔鱼、幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体死亡率随时间的变化情况(图 3和图 4)。通过统计软件处理，得出了WAF和DWAF对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体的剂量效应关系式、相关系数和96 h LC₅₀值(表 2)。由表 2可看出，WAF和DWAF对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体均存在极显著的剂量-效应关系(P < 0.01)。以96 h LC₅₀值为判别标准，WAF未经溢油分散剂处理，其毒性大小依次为黑鲷仔鱼(1.51 mg·L^-1)>脊尾白虾幼体(2.62 mg·L^-1)>黑鲷幼鱼(3.37 mg·L^-1)>缢蛏幼体(11.62 mg·L^-1)。DWAF经溢油分散剂处理，其毒性大小依次为黑鲷仔鱼(0.66 mg·L^-1)>脊尾白虾幼体(1.20 mg·L^-1)>黑鲷幼鱼(1.75 mg·L^-1)>缢蛏幼体(3.09 mg·L^-1)，毒性大小的次序不变，但毒性效应显著增加。

图 3 WAF各浓度组4 种海洋生物随时间的死亡率 Figure 3 Mortality of four organisms in different concentrations of WAF over time

图选项

图 4 溢油分散剂处理的DWAF各浓度组中4 种海洋生物随时间的死亡率 Figure 4 Mortality of four organisms in different concentrations of WAF over time

图选项

表 2 WAF和DWAF对黑鲷仔鱼、幼体、脊尾白虾幼体和缢蛏幼体急性毒性 Table 2 Acute toxic effects of WAF and DWAF on larval and young Acanthopagrus schlegelii，young Palaemon carincauda and Sinonovacula constrzcta

表选项

本研究结果表明，捷菲特001溢油分散剂对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体存在极显著的剂量-效应关系，不同海洋生物幼体对溢油分散剂的忍受浓度存在较大差异，缢蛏幼体的96 h LC₅₀值分别是脊尾白虾幼体、黑鲷仔鱼和黑鲷幼鱼的6.90、2.92倍和1.52倍。文献^[13]报道英国消油剂产品Nalneet 9-010和美国消油剂产品Correxit 9527对阿葡鰕虎鱼(Abomalactipes)的96 h LC₅₀值分别是114、64 mg·L^-1，对菲律宾蛤仔(Venerupisphilppinarium)的96 h LC₅₀值分别是331、600 mg·L^-1，与本研究获得的溢油分散剂对鱼类的毒性大于贝类的结论一致，96 h LC₅₀值表明，虽处于相同量级，但捷菲特001溢油分散剂的毒性更低。国家标准规定常规型的溢油分散剂对模式生物斑马鱼的试验浓度为3000 mg·L^-1时，半致死时间(TL50)>24 h^{[10, 11]}。本实验所用溢油分散剂为上海新络滤材有限公司生产，获批准使用的捷菲特001溢油分散剂，各项技术指标符合国家标准，属于低毒类。但其对海洋生物幼体仍具有明显的致死效应，只是其毒性效应值远低于模式生物斑马鱼。因此，对溢油分散剂的毒性影响应重点关注其对海洋生物幼体的伤害。

美国环保署针对墨西哥湾漏油事故给出的8种消油剂产品处理的原油混合物对2种水生生物的急性毒性试验报告中，报道有4种消油剂-原油混合物对Americamysis bahiade的毒性高于原油毒性，有3种消油剂-原油混合物对Menidia beryllina的毒性高于原油毒性^[26]。黄逸君等认为消油剂处理的原油对海洋桡足类的急性毒性小于原油的毒性^[21]；陈皓鋆等^[20]、徐会等^[27]、杨柏林等^[28]分别认为经消油剂处理的原油对刺参幼参、海洋微藻和海胆胚胎发育的毒性效应大于未经消油剂处理的原油。这说明消油剂和受试生物种类的不同会引起毒性效应的差异。本研究结果显示DWAF对黑鲷仔鱼(3 d)、黑鲷幼鱼、脊尾白虾幼体和缢蛏幼体的96 h LC₅₀值分别为0.66、1.75、1.20、3.09 mg·L^-1，分别是未处理的WAF毒性效应值的2.29、1.93、2.18倍和3.76倍，表明溢油分散剂处理后的平湖原油明显增强了对海洋生物的毒性效应。

已有研究表明，石油烃中芳香烃类化合物的毒性较强，如萘、菲、蒽、芘等，其中中小分子量的多环芳烃是石油组分中危害海洋生物的主要成分^[29]。溢油分散剂由表面活性剂、溶剂和少量助剂组成，其主要成分表面活性剂的分子一端具有亲油性，另一端具有亲水性，具有降低溢油粘度和表面张力的特性，可将溢油从聚集态拉散到较小的分子态的油水乳化物，使水面溢油均匀分散到水体中，从而消除水面的溢油污染^{[7, 10, 11, 12]}。从本实验结果看，溢油分散剂处理平湖原油的同时，本身也会增加对受试生物的影响，但从1∶5的量和溢油分散剂的毒性效应值分析，其对受试生物毒性增强的贡献相当小。溢油分散剂的使用通常会增加油成分的生物可利用性，改变了油、溢油分散剂、生物膜之间的相互作用。已有研究表明使用溢油分散剂后，一般会增加溶入海水中的芳香族化合物的种类和含量，特别是增加碳氢化合物的含量，尤其是较大分子的、不溶性的多环芳烃的含量，引起毒性增强^[16]。Couillard等^[17] 的研究表明，加入溢油分散剂后，乳化液中多环芳烃的浓度增加，使仔鱼体内的EROD活性加强，从而对仔鱼毒性增强。本实验所用的WAF的主要成分分析结果表明，苯、萘、茚等芳烃及其取代物含量约占总成分的28.5%，烷烃约占48%，其余为苯甲酸、酚、烯烃、杂环化合物等。虽然本研究没有测定DWAF成分，但根据已有的研究成果，可以推论：这些有害物质经溢油分散剂处理后，加快了溶解速率，增加溶入海水中的含量，导致水中石油溶解和生物可利用部分的增加，致使对海洋生物的毒性效应增强，同时小油滴浓度的增加可导致生物通过吸附和过滤增大对石油溶解部分的吸收，最终对水生生物产生更大的毒性。

溢油分散剂、WAF和DWAF对黑鲷仔鱼、黑鲷幼鱼、脊尾白虾和缢蛏幼体均存在极显著的剂量效应关系。其毒性效应大小表现为DWAF>WAF>溢油分散剂，毒性效应表现为黑鲷仔鱼>脊尾白虾幼体>黑鲷幼鱼>缢蛏幼体。

使用溢油分散剂后，平湖原油对海洋生物的毒性效应增加。对溢油分散剂使用后的毒性效应，应重点关注其对海洋生物幼体的伤害。

致谢：感谢中国水产科学研究院东海水产研究所晁敏博士对英文摘要的修改。