多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)作为一种人工添加型阻燃剂被广泛地应用于塑料、纺织、电子、电器、化工等生产领域中^[1]。由于大部分PBDEs以非共价键结合到各种产品中，使其极容易从这些物质中直接释放进入环境。过去的20年，PBDEs在沉积物、鱼类、人类乳汁以及脂肪组织中的含量不断增加^[2]，在哺乳动物、人体以及水生生物中，BDE-47检出率最高^{[3, 4]}，成为PBDEs的显著代表。目前，关于PBDEs的生物毒性研究多集中在哺乳动物模型和细胞模型等方面，有关PBDEs对鱼类毒性的研究则相对较少，对复杂水环境进行生态风险评价的现实意义不大。有限的鱼类毒性研究多集中于PBDEs对鱼类甲状腺功能的影响，如：BDE-47^[5]与DE-71^[6]暴露后斑马鱼血浆中甲状腺素T4含量降低并伴随下丘脑-垂体-甲状腺相关的功能基因的表达发生显著变化。

斑马鱼，又名蓝条鱼，成鱼体长4~5 cm。由于斑马鱼具有养殖方便，产卵量大，胚胎透明，发育迅速，敏感性高，遗传背景清楚等特点，近年来作为理想的实验模型被广泛地应用于遗传学和毒理学研究。本实验采用国际上通用的斑马鱼胚胎作为受试生物，以在鱼体中检出率最高的BDE-47为研究对象，考察急性暴露对斑马鱼胚胎的氧化应激效应以及DNA的损伤，并从分子学的角度分析可能的致毒机制。

成年的斑马鱼(AB品系)购自中科院武汉水生生物研究所，饲养在曝气的重组水内(64.75 mg·L^-1 NaHCO₃，5.75 mg·L^-1 KCl，123.25 mg·L^-1 MgSO4·7H₂O和294 mg·L^-1 CaCl₂·2H₂O)，水温保持在(28±1)℃，pH值控制在7~8之间，光暗周期为14 h/10 h，早晚各投喂鲜活的丰年虫一次，进食30 min后，清理残食与粪便。用于本次试验的性成熟斑马鱼均在本实验室饲养了2周以上。选取鳞片完整、游动性强、个体健康的性成熟斑马鱼(雌雄比例为1∶2)加入水温(28±1)℃孵化箱中混合饲养，避光隔夜后，次日早晨灯光刺激雌雄鱼自然交配产卵，30 min后收集受精卵，用重组水迅速清洗，在解剖镜下挑选受精后发育正常，囊胚期的胚胎进行毒性实验，暴露时间为受精后的120 h(Hour post-fertilization，hpf)。

BDE-47(2，2′，4，4′-tetrabromodi-phenyl ether，Wellington，加拿大)，纯度>99.9%，DMSO购自Sigma公司。RNA提取液Trizol购自Invitrogen公司，DNase和M-MLV以及逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自Takara公司，随机引物由Invitrogen公司合成。测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。实验中所需要的其他化学试剂均为国药分析纯试剂。

由于BDE-47微溶于水，本实验选取DMSO为助溶剂，配置10 mg·L^-1的BDE-47储备液，用(28±1)℃的重组水稀释为1、5、10、50 μg·L^-1的BDE-47 暴露溶液。对照组与暴露组DMSO的最终浓度小于0.003%。实验在180 mm的结晶皿中进行，每个结晶皿中放置约400个胚胎。每个浓度实验组和对照组做3组重复实验。暴露期间，每天更换50%的暴露液。

在受精120 hpf后，每个暴露浓度取出80条幼鱼，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)进行清洗后，去除多余水分并称重，加入预冷的pH为7.4的匀浆介质后用手提式电动匀浆器在冰水浴中进行充分匀浆，配置成10%的组织匀浆液。匀浆介质成分如下：0.01 mol·L^-1 Tris-HCl，0.000 1 mol·L^-1 EDTA-2Na，0.01 mol·L^-1蔗糖，0.8% NaCl。每个浓度3个平行样品，于4 ℃、6000 r·min-1 离心15 min，根据南京建成生物有限公司试剂盒的操作说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽S转移酶(GSH)及丙二醛(MDA)。

ROS测定方法参照文献^[7]并有所改进。受精120 hpf后，每个暴露浓度取出40条幼鱼置离心管中，用PBS(pH 7.4)进行清洗后，去除多余水分，加入预冷的匀浆介质用手提式电动匀浆器将离心管置于冰水浴中进行充分匀浆。每个浓度3个平行样品，于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。蛋白浓度采用GE公司(2-D Quant Kit)试剂盒进行测定。ROS的测定采用荧光探针2，7-dichlorofluorescin dictate(DCF-DA)进行。取20 μL上清液，加到96孔板中，室温条件下孵育5 min，然后加入100 μL PBS(pH 7.4)和8.3 μL的DCFH-DA储备液(溶于DMSO中，10 mg·mL-1)，37 ℃在暗处孵育30 min，用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535 nm处测定吸光度，最后的结果是吸光度/蛋白浓度，表示为DCF·mg-1protein。

DNA损伤的测定方法参照文献^[8]并进行了优化。挑选10个胚胎(24 hpf)用PBS漂洗两次，并在室温下用胰酶消化10 min，在显微镜下观察细胞悬液消化完全。移液枪吸取琼脂糖，加上洁净的盖玻片，置冰袋冷却，迅速将细胞悬浮液与低熔点琼脂糖的混合液滴到第一层胶上，待琼脂固化；待第2层琼脂糖凝固后，再滴加琼脂糖，并迅速盖上盖玻片，将载玻片浸入新配制的4 ℃裂解液中，再将载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，使电泳仪的电压为25 V(恒压)，电流为300 mA，电泳15 min。电泳结束后取出玻片用蒸馏水冲洗3次，将载玻片淹没于0.4 mol·L^-1 Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中15 min，再将载玻片浸埋1 h，晾干或室温下过夜。各实验组的载玻片经染色剂处理15 min后，迅速置于BX53荧光显微镜下观察，最后应用CASP软件对DNA迁移的各种参数进行测量。

RNA的抽提参考文献^[6]的方法。简单说，首先用Trizol进行RNA的提取，为了消除内源性DNA的污染，粗提物的总RNA用RNase的DNI进行消化并纯化。测定样品在260 nm与280 nm下的吸光度值，可以用A260/280的比值和1%的琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的纯度。cDNA的合成依据RNA、随机引物以及 M-MLV逆转录试剂盒进行。完成转录后的cDNA放入-80 ℃冰箱保存。荧光定量PCR(qT-PCR)根据Takara 公司的 SYBR GREEN Real-time PCR Master Mix 进行实时测定，每个基因的表达情况做3个重复，每个重复3个平行样，使用β-actin作为内参。所有数据均转化为实验组与对照组的变化倍数以做统计分析，运用公式2-ΔΔCt计算目的基因差异的表达倍数，公式为：

△△Ct=(Ct_目的基因- Ct_管家基因)_实验组-(Ct_目的基因- Ct_管家基因)对照组

2^-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。氧化应激基因主要测定Sod1、Ucp-2、Gstp2、Nqo1。

本实验测定的基因及引物序列如下：β-actin forward：CGGGTGGAGTTTGACACTT，reverse：CTCCCTGA TGCTGGGTCGTC；Sod1 forward：GGCCAACGATAGT TTAGA，reverse：CCAGCGTTGCCAGTTTTTAG；Ucp-2 forward：TGGCTAACCCACTGATGTA，reverse：CAATG GTCCGATATGCGTC；Gstp2 forward：CACTCCACATAC TTCGCTATAC，reverse：TTTGTCCGCCGCAGGAT CTT； Nqo1 forward：CACAGGATTGCCTTCAGC，reverse：CGTGTATGCAGGA GACCAGA。

采用Kolmogorov-Smirnov检验数据分布形式。通过Levene′s检验法分析数据的方差同质性。采用SPSS 17.0 软件( SPSS，Chicago，USA)ANOVA进行方差分析，Turkey法进行实验组与对照组间的比较，p < 0.05即有显著性差异。所有数据都用平均值±标准误差(SEM)来表示。

SOD、CAT、GSH的活性与MDA水平的变化如图 1所示。BDE-47暴露后，SOD的活性随着暴露浓度的升高而增加，其中10 μg·L^-1和50 μg·L^-1的BDE-47显著诱导了SOD的活性(p < 0.05，图 1a)。1、5、10 μg·L^-1暴露组胚胎CAT的活性增加，但与对照组没有显著差异，只有50 μg·L^-1的BDE-47使CAT的活性显著增加(p < 0.05，图 1b)。除1 μg·L^-1外，其余浓度暴露组斑马鱼胚胎的MDA水平显著性增加(p < 0.05)，并且呈现剂量效应关系(图 1c)。与对照组相比，GSH活性在每个暴露组均有明显的降低，其中5、10、50 μg·L^-1暴露组GSH活性显著降低(p < 0.05，图 1d)。

实验数据以平均值依标准误差表示(mean依SEM),每个浓度3个平行样;*p < 0.05,**p < 0.01与***p < 0.001表示暴露组和溶剂组之间的差异。下同Data are mean依SEMof three replicates.*p < 0.05,**p < 0.01,and***p < 0.001 indicate significant differences between exposure and control groups.The same as below 图 1 BDE-47 对120 hpf斑马鱼幼鱼SOD、CAT、MDA 与GSH水平的影响 Figure 1 Effect of BDE-47 on SOD, CAT, MDA, and GSH of zebrafish larvae at 120 hpf

图选项

由图 2(a)可见，所有暴露组ROS水平均显著高于对照组。与对照组相比，随着暴露浓度由5 μg·L^-1增加至50 μg·L^-1，ROS水平由1.62倍显著上调至2.49倍(p < 0.01)。同时，在本试验研究的浓度范围内，MDA与ROS表现出良好的相关性，其R₂=0.90。

图 2 BDE-47 对120 hpf 斑马鱼胚胎ROS 水平的影响（a）和ROS 与MDA 之间的相关性（b） Figure 2 ROS level（a）and correlation between ROS and MDA（b）of zebrafisheggs at 120 hpf under exposure to BDE-47

图选项

如图 3所示，与对照组相比，随着暴露浓度的增加，Sod1基因表达呈现降低趋势，但与对照组之间不存在显著差异。Ucp-2表达与暴露浓度呈现明显的浓度剂量关系，其中10 μg·L^-1与50 μg·L^-1暴露组Ucp-2表达分别显著上调至对照组的3.89倍与4.12倍(p < 0.01)。随着BDE-47暴露浓度的增加，Gstp2与Nqo1表达呈现下调趋势，50 μg·L^-1暴露组Gstp2与Nqo1表达分别显著下调至对照组的0.62倍与0.55倍(p < 0.01)。

图 3 BDE-47 对120 hpf斑马鱼胚胎Sod1、Ucp-2、Gstp2与Nqo1 基因表达的影响 Figure 3 Effect of BDE-47 exposure on gene expression of zebrafish eggs at 120 hpf

图选项

由图 4(a)可见，随着BDE-47暴露浓度的增加，Olive尾矩的值有所增加，当BDE-47浓度为5、10、50 μg·L^-1时，尾矩值增加更为显著，说明高浓度BDE-47处理组对斑马鱼胚胎细胞DNA有损伤作用。由图 4(b)可见，暴露组Olive尾矩的值与ROS呈正相关(R₂=0.93)，说明ROS的产生是诱发DNA损伤的导火索。

图 4 BDE-47暴露对胚胎DNA 损伤程度（Olive 尾距值）的影响（a）和ROS 与尾距值之间的相关性（b） Figure 4 DNA damage（a）and correlation between DNA damage and ROS（b）of zebrafish embryos under exposure to BDE-47

图选项

本研究的目的是从氧化应激与DNA损伤的角度探讨BDE-47对斑马鱼胚胎的致毒机理。研究表明，50 μg·L^-1 BDE-47急性暴露能够显著诱导ROS 的产生，抗氧化酶SOD、CAT活性及MDA水平显著提高，并使GSH的浓度显著降低，产生的ROS与MDA之间存在相关性，同时与氧化应激相关的功能基因Ucp-2、 Gstp2与Nqo1的相对表达量也发生了不同程度的改变。

ROS是生理性氧的代谢物，是广泛存在于生物体内的活性物质。在一般情况下，线粒体是大多数细胞产生ROS的来源。正常情况下，组织细胞内ROS浓度在抗氧化系统的调控下保持在生理水平，即其产生和消除处于平衡状态。当生物体遭受外源刺激时，ROS大量产生时机体会通过改变细胞内 SOD、CAT等抗氧化酶的活性或其基因表达量的途径发生氧化应激，以提高机体清除ROS的能力，减少氧化损害^[6]。本研究结果显示，BDE-47暴露后，胚胎/幼鱼ROS的水平显著增加且与暴露浓度呈现浓度依赖关系，表明BDE-47能够诱导胚胎产生ROS。其他研究者也阐述了类似结论，Shaoo等^[10]发现BDE-47暴露后，虹鳟鱼(Oncorrhynchus mykiss)肝脏细胞RTL-W1内ROS水平显著增加；Jin等^[11]发现性腺细胞RTG-2内ROS水平也显著增加。Han等^[12]的近期研究也显示，BDE-47的外源刺激能够导致水生生物体内ROS含量增加。

SOD是普遍存在于水产动物体内的机体防御过氧化损害系统的关键酶之一，它是超氧阴离子自由基最有效的清除剂，可以通过催化歧化反应来清除体内过量的O₂^-·，将其分解为H₂O₂和O₂，保护细胞免受活性氧自由基氧化损伤^[6]。CAT是生物体H₂O₂和过氧化物清除剂，为防止外源刺激使机体产生的自由基O₂^-·、OH、H₂O₂后引起的DNA断裂、脂质过氧化、酶蛋白失活等，CAT能够将H₂O₂及其他过氧化物转变为无毒性产物^[9]。本实验结果显示，SOD与CAT活性较对照组增加且存在浓度效应依赖关系，50 μg·L^-1 BDE-47 能够显著诱导SOD与CAT活性(p < 0.05)。这是因为斑马鱼胚胎受到高浓度BDE-47 的胁迫而产生大量的ROS，为了清除多余的ROS使机体免于遭受氧化损伤，胚胎自身的抗氧化系统启动，激活体内的SOD及CAT用以清除由ROS产生的O₂^-·^[13]。Albin等^[14]研究发现，BDE-99能够显著抑制鼠肝脏中SOD活性，在最高剂量暴露组CAT的活性降低而在肾脏中SOD和CAT的活性都随暴露剂量的增加而降低。这说明，受到外来物质刺激后，生物体内SOD和CAT活性的变化存在物种的特异性与组织的特异性。

GSH是生物体内重要的非酶抗氧化剂，是一种生物功能比较特殊的氨基酸衍生物，属于含有巯基的小分子肽类物质。在外源物质的刺激下，GSH会被诱导，有效地清除生理性的或病理性的氧自由基，同时还作为必需的辅助因子参与GSH相关酶调控氧化应激的状态^[13]。当GSH逐渐减少至耗尽时，将导致机体产生中毒效应。本实验结果显示，随着BDE-47暴露浓度的增加，GSH水平呈降低趋势且10 μg·L^-1和50 μg·L^-1 BDE-47显著降低胚胎GSH水平(p < 0.01)，表明BDE-47能够刺激胚胎产生大量的ROS，导致细胞内氧自由基的含量增加。机体启动自身的抗氧化防御系统后，为了维持机体内氧自由基与抗氧化防御系统之间动态的平衡，GSH被消耗用于清除机体内多余的氧自由基，因而GSH的含量下降。Wang 等^[15]研究的BDE-47对小鼠的氧化应激与本实验得到了一致性的结论。生物体的生物膜中含有多种不饱和脂肪酸，当生物体受到外来刺激，体内自由基含量增加时，不饱和脂肪酸将在自由基攻击下形成脂质过氧化产物即MDA，其含量常常反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损害的程度。对于鱼类模型而言，脂质过氧化物常常作为环境污染物如重金属、多环芳烃(PAHs)及多氯联苯(PCBs)等毒性效应的敏感指示物。在本实验中，随着BDE-47暴露浓度的增加，胚胎内MDA水平显著增加(p < 0.05)，且MDA与胚胎内ROS的水平具正相关性(R₂=0.90)，说明BDE-47暴露产生的氧自由基攻击机体内的不饱和脂肪酸，进而形成了MDA。基于抗氧化系统GSH含量及MDA的变化，BDE-47可以诱导斑马鱼胚胎/幼鱼产生氧化应激。吉贵祥等^[16]研究也得到了相似的结论，2.0 mg·L^-1BDE-47 短期暴露导致斑马鱼体内SOD显著升高，MDA含量与BDE-47暴露浓度呈正相关，同时0.5 mg·L^-1 BDE-47能诱导细胞凋亡。本研究除了从斑马鱼生化指标的变化体现其氧化损伤外，同时从分子生物学的角度出发，分析了与氧化应激相关的目标基因的表达，从分子层面揭示氧化应激产生的可能机制。范灿鹏等^[17]研究的BDE-47对剑尾鱼抗氧化系统的影响与本文略有不同，他们除了选择GST、MDA与CAT作为分析指标外，还考查了BDE-47暴露对剑尾鱼脱乙基酶(EROD)活性的影响，结果显示BDE-47暴露能显著诱导剑尾鱼肝脏EROD活性，鉴于EROD与MDA活性响应敏感且变化稳定，可将二者作为BDE-47暴露的生物标记物，因此，后续将考虑研究低浓度全生命周期暴露BDE-47对斑马鱼EROD活性的影响及性别差异性。

为了进一步从分子生物学的角度揭示BDE-47产生氧化应激的机制，本实验选取Sod1、Ucp-2、Gstp2及Nqo1作为目标基因。由本实验结果可见，BDE-47暴露后，Sod1与对照组不存在显著差异，与抗氧化酶SOD呈现了不同的变化趋势。研究结果表明，在本试验条件下，抗氧化酶与生物体中酶的活性相关，它们不受抗氧化蛋白基因的调控。产生这种现象的原因可能是因为mRNA是生物体细胞活性的即时反应，而蛋白则是受mRNA翻译后进行调节的，影响蛋白表达的复杂因素是造成抗氧化酶编码基因Sod1与抗氧化蛋白SOD呈现不同趋势的根本原因。本课题组前期的实验显示纳米氧化锌能显著诱导斑马鱼胚胎Ucp-2基因的表达^[18]，与本研究得到一致性的结论，后续实验重点研究将Ucp-2作为持久性有毒物质(PTS)引发氧化应激评估的目的基因的可行性。Chen等^[19]采用食物暴露的方式发现BDE-47能够抑制斑马鱼幼鱼的体重与体长，并且显著降低细胞色素P450(CYP1A1)基因的表达。研究显示，PBDEs能够与机体内的芳香烃受体(AhR)、雄激素受体(AR)、孕酮受体(ER)相结合，从而造成内分泌干扰效应，而CYP1A1是芳香烃受体(AhR)最为典型的目标基因^[20]。Chen等研究结果从另一个角度证实了BDE-47的生物毒性效应。

SCGE是近年发展起来的一种研究DNA损伤的快速方法。本实验应用SCGE技术检测到BDE-47对斑马鱼胚胎细胞DNA均有显著的损伤作用。与本研究结论相似，吴伟等^[21]研究结果显示BDE-47对鲫鱼组织产生DNA损伤，具有遗传毒性；许超群等^[22]发现BDE-47暴露导致菲律宾蛤仔组织抗氧化酶活性受到显著抑制，DNA 损伤显著。与上述研究不同，本实验着重分析了ROS与Olive尾矩值的相关性，由ROS与Olive尾矩值呈现的显著正相关分析得到BDE-47诱发斑马鱼胚胎细胞DNA损伤的主要原因是：外界BDE-47的刺激诱发使胚胎体内自由基含量增加，抗氧化系统首先启动以抵御增加的自由基，但仍有部分自由基与 DNA发生反应，导致 DNA 链断裂和损伤。综上所述，抗氧化酶活力和组织 DNA 损伤可作为 BDE-47 污染评价的生物标志物。

(1)BDE-47能够显著诱导ROS，并引起抗氧化指标(SOD、 CAT、MDA和GSH)产生不同程度的变化，表明BDE-47诱导斑马鱼胚胎产生氧化应激效应。

(2)BDE-47暴露后Sod1基因表达没有显著变化；50 μg·L^-1暴露组Ucp-2表达显著上调(p < 0.01)，Gstp2与Nqo1表达显著下调(p < 0.05)。

(3)BDE-47暴露诱导胚胎细胞DNA产生损伤作用，ROS的产生是诱发DNA损伤的导火索。