油水淹地土壤多年不能正常生长作物,急需对土壤进行修复.生物修复方法因具有费用低、原位降解污染物、无二次污染等优点受到广泛关注^{[1, 2]},其原理是在土壤微生物的代谢作用中将石油烃作为反应物,把有机污染物降解为无害无机物(H₂O和CO₂)^[3],石油污染土壤的生物修复已成为环境研究的热点.在国外,Gogoi等^[4]在印度的Borhola油田进行了石油污染土壤生物修复的实验室和场地试验,Gomez等^[5]在加拿大进行了寒冷条件下石油污染土壤的异位生物修复试验,Suja等^[6]在马来西亚通过实验室和场地试验探究了提高石油污染土壤修复性能的因素,这些研究都取得了较好的效果;在国内,赵硕伟等^[7]在实验室条件下研究了复合菌群对石油的降解效果,黄廷林等^[8]研究了实验室条件下生物菌剂的投加量、投加方式及环境温度对石油污染土壤的修复作用,韩慧龙等^[9]研究了真菌-细菌微生物菌剂对中原油田不同类型石油污染土壤的小试和中试原位修复,发现其对不同石油类物质均有较好的降解能力,胥九兵等^[10]进行了胜利油田周围污染土壤的修复试验,经过2个月土壤中石油的降解率达到67.7%.多数石油污染土壤的修复都关注于单独的石油污染的修复,关于油水淹地这种油盐复合污染土壤的修复还未见研究报道,而且石油污染的修复研究大多停留在实验室阶段,田间试验由于面临较为恶劣的环境条件其研究相对较少.

微生物分泌的表面活性物质是降解石油污染物的主要机制之一,它可以促进微生物对土壤中烃类化合物的可利用性^[11].本研究将从油水淹地污染土壤中筛选出的产表面活性剂降解菌和高效石油降解菌构建成石油高效降解菌群,接种到载体秸秆上,制备成固体生物菌剂,进行不同石油含量油水淹地污染土壤的室内培养试验和田间试验,探究该生物菌剂的修复情况,为大规模的油水淹地污染土壤的修复提供理论依据并奠定基础. 1 材料与方法 1.1 生物菌剂的制备 1.1.1 菌种筛选及高效降解菌群的构建

从油水淹地污染土壤中筛选出石油降解菌26株,包括细菌22株,放线菌1株,真菌3株,编号为H-1到H-26,其中H-6为产表面活性剂石油降解菌,H-1、H-6、H-17、H-18、H-19、H-20、H-23对石油具有较强降解能力,以H-6为中心,另从H-1、H-17、H-18、H-19、H-20、H-23中任选3个菌株构建20个石油降解菌群,最终得到石油降解率最高的石油降解菌群C5(H-1、H-6、H-18、H-19),H-1、H-6、H-18、H-19均为细菌,具有协同降解石油的作用^[12]. 1.1.2 菌剂制备及菌剂特性

菌剂载体:粉碎的玉米秸秆,颗粒度0.5~2 mm. 制备过程及命名:以石油高效降解菌群C5的最佳接种量[H-1(15%)、H-6(15%)、H-18(20%)、H-19(10%)]接种各菌株于培养液中,30 ℃、160 r·min^-1振荡,培养24 h得到种子培养液.将种子培养液按1∶1∶1∶1的体积比混合,混合后的液体菌剂接种到载体秸秆上,完成固体菌剂的制备.将该菌剂命名为MA菌剂.

菌剂特性:含水率为40%,存在特殊难闻气味,经过多次反复测得固体生物菌剂中细菌的数量范围为10⁹~10¹¹ cfu·g^-1;以菌剂中细菌数量小于10⁸ cfu·g^-1作为菌剂失效的标准,室温25 ℃有效期为35 d,常温20 ℃有效期为42 d. 1.2 MA菌剂对油水淹地污染土壤的修复效果试验

包括MA菌剂对不同石油含量污染土壤的室内培养修复试验和田间修复试验. 1.2.1 供试土壤

培养试验:采自吉林省松原市宁江区新城乡联合村、长虹村和八家子村(吉林油田)3个采样点油水淹地污染土壤表层,除杂、自然风干、磨细过20目筛后混匀备用.

田间试验:位于吉林省松原市宁江区新城乡联合村,选取两个油水淹地场地(场地1和场地2),场地1和场地2相距10 m,均在2009年6月被油田废水淹灌10个月,临近井场现已废弃,井场周围受污染严重,无农作物生长.场地1和场地2面积分别为300 m²和1800 m².所有供试土壤类型都为淡黑钙土,质地为壤土,理化性质见表 1.

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Primary physic-chemical properties of tested soils

表选项

原油样品取自吉林油田分公司扶余采油厂,密度0.92 g·cm^-3,原油样品中饱和烃、芳香烃、沥青胶质及其他非烃化合物质量分数分别为58.8%、21.5%、5.1%和14.6%.

土壤中原油的加入采用逐级混匀法,按所需石油含量计算土壤和石油的用量,把土壤分成若干份,取一份加入所计算的全部原油,混匀后再逐级加入其他份土壤并混匀. 1.2.3 试验设计

培养试验:不同石油含量污染土壤的室内培养修复试验,设6个添加菌剂的修复处理(按照石油含量由小到大依次编号为A、B、C、D、E、F),6个相应不添加菌剂的对照处理(编号为A-CK、B-CK、C-CK、D-CK、F-CK),每个处理3次重复.供试土壤中加入原油,使石油含量为1 、5 、10 、15 、20 、30 g·kg^-1,按照编号在塑料杯(直径为8 cm,高度为10 cm)中加入200 g污染土壤,修复处理加入MA菌剂1.5 g,不加入菌剂的为对照处理CK.浇水使土壤含水率为20%,搅拌均匀,称重以便后期补水,根据失水量每3 d补水并搅拌一次.将装有污染土壤的塑料杯在25 ℃人工气候箱内培养60 d取出,进行细菌数量、微生物量碳、石油含量、pH、电导率和盐分组成测定.

田间试验:试验开始于2013年4月20日,场地1和场地2均设置CK、添加改碱剂(AA)、添加菌剂(MA)、添加改碱剂和菌剂(AA+MA)4个处理,每个处理3次重复,将磷酸氢二胺和撒可富复合肥均匀撒于场地1和场地2地表,翻耕后将AA改碱剂和MA菌剂撒于地表,然后在表层土壤(0~20 cm)处用铁锹混匀,MA、AA+MA处理菌剂的施用量为0.75 kg·m^-2,AA、AA+MA处理改碱剂的施用量为0.2 kg·m^-2.于1年后的2014年4月28日在场地1和场地2土壤表层取样,进行土壤性质的测定. 1.3 测试与计算方法

土壤中石油含量采用超声-紫外法^[13]测定;采用PHS-3C pH计测定土壤的pH值,DDS-307电导率仪测定土壤的电导率.重铬酸钾容量法测定土壤有机质;双指示剂中和法测定CO₃^2-和HCO₃^-;AgNO₃滴定法测定Cl^-;EDTA间接滴定法测定SO₄^2-;EDTA络合滴定法测定Ca²⁺和Mg²⁺;火焰光度法测定K⁺和Na^+[14].全盐量采用离子加和法,钠吸附比(SAR)和总碱度(TA)分别采用公式Na⁺/和HCO₃^-+CO₃^2-进行计算.土壤中细菌、真菌及放线菌数量和菌剂中细菌数目的测定采用稀释平板法^[15];微生物量碳的测定采用氯仿熏蒸浸提法. 1.4 数据处理与分析

运用Microsoft Excel 2003处理数据.用DPS V7.05系统软件分析数据,用LSD(Least significant difference test)进行样本平均数的差异显着性比较. 2 结果与分析 2.1 施用MA菌剂对土壤中石油含量的影响

培养试验:试验结束时石油含量为1、5、10、15、20、30 g·kg^-1的污染土壤,石油含量分别下降到0.23、1.46、3.35、5.86、9.17、19.88 g·kg^-1,石油降解率分别为76.84%、70.78%、66.53%、60.97%、54.15%、33.13%(图 1),初始石油含量越高石油降解率越低;同一初始石油含量的添加菌剂与相应未添加菌剂的CK土壤相比,石油降解率差异显着,石油含量越高,这种差异越明显.

同一浓度处理土壤的不同小写字母表示在5%水平上差异显着.下同 Different letters in same treatments indicate significant difference at 5% level. The same below 图 1 培养试验结束时土壤中石油的降解率 Figure 1 Oil degradation rates in soil at the end of incubation experiment

图选项

田间试验:由图 2可知,添加菌剂的AA+MA和MA处理与未添加菌剂的AA和CK处理的土壤中石油降解率存在显着差异.在场地1中,AA+MA和MA处理的土壤中石油降解率为31.81%和32.63%,而AA和CK处理的土壤中石油降解率仅为13.07%和13.35%;在场地2中,AA+MA和MA处理的土壤中石油降解率为23.93%和24.70%,而AA和CK处理的土壤中石油降解率仅为8.95%和9.24%.

AA:改碱剂处理;MA:菌剂处理;AA+MA:改碱剂+菌剂处理.下同 AA:Improved alkali agent;MA:Microbial agent;CK:Control. The same below 图 2 田间试验不同处理土壤中石油的降解率 Figure 2 Oil degradation rates of soil in field experiment

图选项

培养试验:由于土壤有机质测定方法的局限性,加入石油后土壤中有机质含量也随着石油含量的增加而有所升高,如图 3所示.添加菌剂后有机质含量降低,初始石油含量为20、30 g·kg^-1的污染土壤的有机质含量显着低于CK处理;初始石油含量为1、5、10、15 g·kg^-1的污染土壤的有机质含量与CK相比差异不显着,但均略低于相应CK处理.

图 3 培养试验结束时土壤中有机质含量的变化 Figure 3 Changes of soil organic matter content at the end of incubation experiment

图选项

田间试验:图 4 为田间试验土壤中有机质含量的变化.不同处理间有机质含量的差异并不显着,但AA+MA和MA处理的土壤有机质含量均略低于AA和CK处理,场地1中CK、AA、MA、AA+MA的有机质含量降幅分别为0.21、0.23、0.36、0.38 g·kg^-1,场地2中CK、AA、MA、AA+MA的有机质含量降幅分别为0.38、0.40、0.87、0.83 g·kg^-1.

图 4 田间试验不同处理土壤中有机质含量的变化 Figure 4 Changes of soil organic matter content in field experiment

图选项

培养试验:初始石油含量为1、5、10、15、20、30 g·kg^-1各处理,添加菌剂后pH(图 5A)由最初供试土壤的8.44分别降低为7.88、7.95、8.01、8.08、8.13、8.17,与相应CK处理差异显着;电导率(图 5B)由最初的0.626 mS·cm^-1分别降低为0.473、0.485、0.499、0.506、0.511、0.528 mS·cm^-1,与相应CK处理差异显着;全盐量(图 5C)由最初的21.87 g·kg^-1分别降低为19.49、19.55、19.65、19.79、19.92、20.05 cmol·kg^-1,与相应CK处理差异显着.

图 5 培养试验结束时土壤pH、电导率和全盐量的变化 Figure 5 Soil pH,electrical conductivity and salt contents at the end of incubation experiment

图选项

田间试验:同一场地不同处理土壤的pH和电导率都有所降低,但存在着较大的差异,AA+MA处理的pH和电导率降低的最为明显,AA+MA处理土壤的pH由最初的8.67和9.43降低为8.00和8.66(图 6A),电导率由最初的0.661和0.822 mS·cm^-1降低为0.439和0.550 mS·cm^-1(图 6B).所有处理土壤中的全盐量都降低(图 6C),场地1中CK、AA、MA和AA+MA处理的土壤全盐量分别降低为21.85、20.09、21.34、19.32 cmol·kg^-1,场地2中CK、AA、MA和AA+MA处理的土壤全盐量分别降低为25.97、24.27、25.38、23.21 cmol·kg^-1,场地1和场地2不同处理土壤中全盐量降低幅度存在AA+MA>AA>MA>CK的规律,AA+MA处理的全盐量降低得最为显着.

图 6 田间试验不同处理土壤pH、电导率和全盐量的变化 Figure 6 Soil pH,electrical conductivity and salt contents in field experiment

图选项

培养试验:土壤可溶性盐离子含量和全盐量的变化见表 2.对于阳离子,所有处理土壤中Na⁺含量均降低,添加菌剂处理土壤中Na⁺降低值显着高于相应CK处理,土壤中初始石油含量越高,Na⁺降幅越小;不同石油含量的污染土壤中,虽然K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量因石油含量的差异呈现不同的变化趋势,但添加菌剂处理土壤中的K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量都高于相应CK处理.对于阴离子,不同石油含量的污染土壤中所有处理的CO₃^2-、HCO₃^-、Cl^-和SO₄^2-含量均降低,且添加菌剂处理的降幅显着高于相应CK处理,土壤中初始石油含量越高,CO₃^2-、HCO₃^-、Cl^-和SO₄^2-的降幅越小.由图 7可知,不同石油含量污染土壤中,添加菌剂处理的SAR和TA的值都显着低于相应CK处理.

表 2 培养试验添加菌剂对不同石油含量污染土壤中可溶性盐离子组成的影响 Table 2 Contents of soluble salt ions in oil-contaminated soil in incubation experiment

表选项

图 7 培养试验结束时土壤SAR和TA的变化 Figure 7 Soil SAR and TA at the end of incubation experiment

图选项

田间试验:表 3所示为田间试验不同处理土壤中水溶性盐离子组成的变化.对于阳离子,AA、MA和AA+MA处理土壤中,Na⁺含量降幅显着高于CK处理,存在着AA+MA>MA>AA>CK的规律,AA+MA处理土壤中Na⁺含量的降幅差异最为显着;K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的含量均有所升高,与CK处理差异显着,且AA+MA处理差异最为显着.对于阴离子,不同处理土壤中的CO₃^2-、HCO₃^-、Cl^-、SO₄^2-含量均降低,降幅也都存在AA+MA> AA>MA>CK的变化规律,差异性显着.由图 8可知,2个场地的AA、MA、AA+MA处理的SAR和TA都显着低于CK处理,AA+MA处理的差异最为显着,虽然AA处理和MA处理的SAR值在同一差异水平,但MA处理的SAR要略低于AA处理.

表 3 田间试验不同处理土壤中水溶性盐离子组成 Table 3 Contents of soil soluble salt ions in field experiment

表选项

图 8 田间试验不同处理土壤SAR和TA的变化 Figure 8 Changes of soil SAR and TA in field experiment

图选项

培养试验:如图 9所示,初始石油含量为1、5、10、15、20、30 g·kg^-1的污染土壤添加菌剂后,细菌数量分别为1.06×10⁹、1.12×10⁹、1.13×10⁹、1.09×10⁹、9.32×10⁸、8.46×10⁸ cfu·g^-1,微生物量碳的含量分别为151.1、148.1、146.8、144.9、139.4、135.2 mg·kg^-1,不同石油含量的污染土壤添加菌剂后细菌数量和微生物量碳含量都显着高于相应CK处理.

图 9 培养试验结束时土壤中细菌数量和微生物量碳含量 Figure 9 Bacterial population and microbial biomass carbon of soil at the end of incubation experiment

图选项

田间试验:不同处理土壤中微生物数量和微生物量碳的含量见表 4.施用菌剂后细菌、真菌、放线菌的数量和微生物量碳的含量都有所增加,MA和AA+MA处理的细菌均显着高于无菌剂添加的CK和AA处理.对于放线菌和真菌,虽然不同处理间的差异并非一概十分显着,却都存在着AA+MA>MA>AA>CK的规律.就微生物量碳而言,与微生物数量的变化基本一致，不同处理间差异较为显著，也遵循着AA+MA>MA>AA>CI的变化规律。

表 4 田间试验不同处理对土壤中微生物的影响 Table 4 Microbial population and microbial biomass carbon of soil in field experiment

表选项

石油会破坏土壤结构、降低渗透性，其高分子化合物会在植物根系形成粘膜，致使根系腐烂^[16]而阻碍 植物生长。微生物降解是修复石油污染土壤有效、经 济、环保的方法，是去除石油烃类有机污染物的主要 机制^{[17, 18]}，石油降解率是菌剂对石油污染土壤修复效 果最直接的检验，培养试验中添加菌剂后，不同石油 含量污染土壤的石油降解率存在显著差异，石油含量 越高石油的降解率越低，这种规律也存在于CK处理 中;同一初始石油含量的污染土壤，添加菌剂后的石 油降解率与CK处理有显著差异，石油含量越高，添加 菌剂和未添加菌剂处理石油降解率的差异越显著;对 于田间试验，添加菌剂的AA+MA和MA处理的石油 降解率显著高于未添加菌剂的AA和CK处理。这表 明，MA菌剂可降低油水淹地污染土壤中的石油含量。

石油污染使土壤中有机质含量升高，但这部分有 机质不能被生物正常吸收利用^[19]。培养试验中，添加 菌剂后初始石油含量为1,5,10,15 g·kg^-1，的污染土 壤中有机质含量与CK处理差异并不显著，初始石油 含量20,30 g·kg^-1，的污染土壤中有机质含量与CK处 理差异显著。这可能是因为较低石油含量的污染土壤 中石油降解使有机质含量降低的同时，秸秆的加人增 加了有机质的含量，而较高初始石油含量的污染土壤 中石油的减少使有机质含量降低的值高于秸秆使有 机质含量升高的值。田间试验中，2个场地不同处理 间有机质含量差异不显著，在微生物的作用下，土壤 中石油烃的降解使部分有机质含量降低的同时，秸秆 使有机质含量增加，微生物菌剂也通过自身的生命 活动产生多种酶从而使有机质含量增加。这与李北齐 等^[20]的研究结果一致，宋海燕等^[21]也认为微生物产生 的过氧化氢酶、过氧化物酶、脉酶等均能促进土壤有 机质的合成。

3.2 MA菌剂对油水淹地污染土壤中盐碱性质的影响

培养试验和田间试验添加菌剂处理土壤的pH 降幅显著低于相应CK处理，ke能的原因:一是菌剂 中的细菌降解石油的过程中产生了有机酸^[22]二是菌 剂中细菌的代谢过程对碱性盐有所消耗。添加菌剂 后，土壤中的K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量都高于相应CK处理， C0₃^2- ,HCO₃^- ,Cl^-和S0₄^2-含量都低于相应CK处理;土壤 中石油含量越高，C0₃^2- ,HCO₃^- ,Cl^-和S0₄^2-的降幅越小， 可能是因为石油含量增加会使土壤中菌剂的活性受 阻。培养试验和田间试验添加菌剂后SAR和TA的值 都低于相应CK处理，田间试验中AA+MA处理SAR 和TA的值显著低于其他处理，由AA处理和MA处 理的SAR值可知，MA菌剂的加人对SAR值的降低 有较大贡献。

培养试验和田间试验添加菌剂后土壤全盐量均 明显下降，与相应CK处理差异显著，田间试验中 AA+MA处理的全盐量降低得最为明显，菌剂在盐碱 土中能通过自身生命活动产生多种酶，这些酶会对盐 碱土中的盐离子含量产生影响。盐碱土中常见的嗜盐 菌为盐球菌属和盐细菌属^[23]，由于油水淹地土壤具有盐碱性，从中筛选出来的石油降解微生物也具有一定 的嗜盐性质，由加人菌剂后土壤中全盐量的下降刚- 知，MA菌剂中的细菌属于嗜盐菌属。 3.3 MA菌剂对油水淹地污染土壤中微生物的影响

土壤微生物对土壤肥力及植物养分转化等多个 方面都具有重要作用^{[24, 25]}，微生物的活动在石油污染 物的降解过程中起着主要作用^[10]，土壤微生物量碳只 占土壤总碳量的1 %~4%^[15]，却是评价微生物量的参 数指标，是土壤有机库的活性部分。培养试验中，添加 菌剂使不同石油含量污染土壤中的细菌数量和微生 物量碳增多，且显著高于CK处理，田间试验中，2个 场地有菌剂加人的MA和AA+MA处理中的细菌数 量都显著高于相应的CK处理，菌剂的加人不但没有 使真菌和放线菌的数量降低，反而刺激了真菌和放线 菌的生长。这可能是由于菌剂的加人降低了土壤中有 害盐分的组成，减轻了对真菌和放线菌的抑制。 4 结论

(1)由培养试验可知，MA菌剂对不同石油含量 (1,5,10,15,20,30 g·kg^-1)的油水淹地污染土壤中的 石油都具有较好的降解效果，在试验范围内石油含量 越高，添加MA菌剂处理与未添加菌剂处理土壤的石 油降解率差异越显著，降解效果越明显。

(2)MA菌剂对石油具有较好的降解效果，菌剂 中的细菌显现了嗜盐菌的特征，有效降低了土壤的 pH、电导率、全盐量、SAR和TA等盐碱性指标值。

(3)MA菌剂的加人对土壤中微生物的活动具有 积极的作用，使土壤中的细菌数量和微生物量碳增加 的同时，放线菌和真菌的数量也有所提高。