氟喹诺酮类(FQs)抗生素是一类由人工合成的广谱类抗菌药,具有广谱抗革兰氏细菌活性和动物口服吸收效果好等特性,目前使用较多的是第三代产品,包括诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、洛美沙星(Lomefloxacin,LOM)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、沙拉沙星(Sarafloxaxcin,SAR)、培氟沙星(Pefloxacin)和依诺沙星(Enoxacin)等^[1],但用药量的40%~90%^[2]往往以母体或代谢物的形式随畜禽粪便排出体外.在对我国8个省、市、自治区规模化养殖畜禽粪便调查发现,环丙沙星、恩诺沙星是主要抗生素污染物,在猪粪中含量分别为33.98、33.26 mg·kg^-1,在牛粪中含量分别为29.59、46.70 mg·kg^{-1 [3]}.Kumar 等^[4]发现粪便中的抗生素浓度达200 mg·kg^-1.可见,抗生素在粪便中的残留不容忽视,这些有残留抗生素的粪便,将是构成抗生素面源污染的主要原因之一^[5].

如何有效去除禽畜粪便中抗生素是近年来环境科学研究的一个热点.高温堆肥法作为处理有机固体废物(包括畜禽粪便、污水、污泥和城市生活垃圾等),使之无害化、资源化的一种有效手段,在国内外被广泛地研究和应用^[6].近年来在对禽畜粪便堆肥去除抗生素研究中多集中在四环素类^{[7, 8]},而对FQs鲜有报道.已有研究证实畜禽粪便好氧堆肥中添加微生物菌剂的可行性及有效性^{[9, 10, 11]},而利用耐高温外源微生物辅助去除畜禽粪中FQs的研究尚未见报道,本文研究了高温堆肥去除鸡粪中FQs的效果,并探讨了外源添加耐高温菌对鸡粪中FQs去除效果的影响. 1 材料与方法 1.1 堆肥材料及外源添加菌

试验所用的新鲜鸡粪取自北京市郊区某养鸡场,添加锯末以调节鸡粪的碳氮比和保持其良好通风^[12],锯末取自某木材加工厂.堆肥原材料性质见表 1.

表 1 堆肥材料基本理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of composting materials

表选项

FQs标准品:诺氟沙星(NOR,纯度≥99.91%)、环丙沙星(CIP,纯度≥99.91%)、洛美沙星(LOM,纯度≥99.91%)、恩诺沙星(ENR,纯度≥99.91%)购自农业部环境保护科研监测所;沙拉沙星(SAR,纯度≥90.7%)购自中国药品生物制品检定所.这5种抗生素原药购自湖北恒绿源医药公司(纯度均>90%).甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸为优级纯;乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、HCl、NaOH等为分析纯;试验用水为超纯水.

试验接种的菌剂为前期实验中从腐熟剂筛选得到的一株耐高温菌种.其细胞为球形,能产纤维素酶和蛋白酶,在选择性培养基中,其纤维素酶活为20.79 U·mL,蛋白酶酶活为18.52 U·mL,细菌在55 ℃仍保持较高的活性.菌种培养条件为选择性培养基:KH₂PO₄ 0.5 g、NaCl 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、MgCl₂ 0.5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、NH₄NO₃ 1.0 g、K₂HPO₄ 1.5 g,最适生长pH值为7. 1.2 试验设计

高温堆肥试验采用实验室模拟的方式进行,将取回的鸡粪分成5等份,每份分别加入相应量的锯末、水和FQs,混合均匀,然后分为3等份,装入3个桶中(重复3次).试验设置2组方案共5个处理,具体如下: 1.2.1 方案Ⅰ:抗生素不同添加量降解试验

处理1:鸡粪+锯末(T0,对照);处理2:鸡粪+锯末+15 mg·kg^-1喹诺酮类抗生素(T15);处理3:鸡粪+锯末+30 mg·kg^-1喹诺酮类抗生素(T30);处理4:鸡粪+锯末+60 mg·kg^-1喹诺酮类抗生素(T60). 1.2.2 方案Ⅱ:外源添加耐高温菌的抗生素降解试验

处理1:鸡粪+锯末+15 mg·kg^-1喹诺酮类抗生素(T15,同方案Ⅰ中处理2)

处理2:鸡粪+锯末+15 mg·kg^-1喹诺酮类抗生素+5%高温菌种(T15+B). 1.3 试验操作方法

将取回的新鲜鸡粪混合均匀,分成5份,每份质量约为54 kg,其中4份添加FQs标准储备液(用甲醇溶解配置,FQs加标量分别为15、30、60 mg·kg^-1),1份为T0处理,FQs的含量为鸡粪本底值.混匀后置于阴凉处24 h.每份处理中加入锯末7 kg混合均匀,其C/N 约为19.91∶1,加蒸馏水6.85 L(含水率为60%).液体微生物菌剂按5%(V/W)的比例添加,物料混合均匀后,分别装填在塑料桶内(其规格为高1 m、直径0.8 m),置于(30±5) ℃温室中,通风状况良好,实行人工翻堆供氧^[13],试验周期为42 d. 1.4 测定项目方法

每日14:00监测上层、中层、下层堆体温度,以平均值作为当天堆体温度,同时记录环境温度.在堆肥开始后第0、2、6、10、14、19、25、42 d分上、中、下层取约200 g样品,样品混合均匀,用保鲜袋密封,-20 ℃保存以备分析测定.

样品冷冻干燥,采用Mcllvaine-Na₂EDTA 缓冲液∶乙腈(1∶1,V∶V,pH=2)提取,HLB固相柱净化,甲醇洗脱,Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪测定.色谱条件为:WATERS Xterra RP18色谱柱(250 mm×4.6 μm,5 μm);柱温35 ℃;荧光检测器检测波长为激发波长280 nm,发射波长450 nm;进样体积为20 μL;流速为0.8 mL·min^-1;二元梯度泵,流动相A为乙腈,流动相B为0.7%磷酸溶液.梯度洗脱程序:0～20 min,10% A;20～35 min,(10%～25%) A;35～45 min,40% A;45～55 min,10% A^[14].含水率采用105 ℃烘干法测定;pH采用无CO₂水提取(鸡粪∶水=1∶10,W∶V),pH计(DELTA 320)测定; 总氮采用凯氏定氮法测定;总有机碳采用有机碳测定仪(Multi N/C 31000)测定. 1.5 数据处理

不同堆肥时期,堆体中FQs类抗生素含量用一级方程式进行拟合:

C_t=C₀e^-kt

根据公式t_1/2=0.693/k计算堆肥过程中抗生素的半衰期(t_1/2,d).数据统计检验采用SPSS 16.0软件处理. 2 结果与讨论 2.1 堆肥过程物料基本理化性质的变化

温度是反映堆肥进程与腐熟度的一个重要指标^[15],它不仅直接影响微生物的数量与活动,并进一步影响有机质的分解速率和腐殖化进程.堆肥过程中的温度变化如图 1所示.堆肥初期,物料中易分解的有机质在好氧微生物的作用下迅速分解,C/N比降低并释放热能,各堆肥温度均上升至50 ℃以上.T15+B处理堆体第3 d温度升到54.8 ℃,且高温(>50 ℃)持续时间较长;T60处理于堆肥第6 d达到50 ℃以上.各堆体第14 d 时温度开始低于50 ℃,此后堆肥温度自然降低,并没有出现增温现象,到第26 d堆肥发酵基本结束,达到腐熟、稳定期.整个堆肥过程中各处理pH 值均维持在7.27~8.25 之间,含水率维持在50%~67.67% 之间^{[16, 17]},有利于保持微生物最佳活性,加速堆肥腐熟.堆肥后期,堆体不再吸引蚊蝇,臭味消失,堆肥产品呈现疏松的团粒结构.

图 1 堆肥过程堆体温度的变化 Figure 1 Changes of temperature during composting

图选项

不同添加量下,堆体鸡粪中抗生素的含量变化如图 2所示.不同处理堆体FQs的去除率均有不同程度的降低,各处理去除率介于48.4%~77.1%之间.FQs在堆肥初期(0~14 d)去除率明显,以T15处理去除率最高,NOR、CIP、LOM、ENR、SAS去除率分别为57.27%、53.25%、38.94%、58.48%、58.49%;堆肥后期(19~42 d),NOR、CIP、LOM、ENR、SAS去除率分别为14.24%、3.02%、15.50%、7.04%、4.09%.在T30、T60处理中,NOR、CIP、LOM、ENR、SAR在堆肥初期去除率分别为48.50%、39.62%、30.10%、40.92%、44.10%和41.44%、39.18%、28.43%、35.37%、35.60%,堆肥后期分别为23.93%、23.37%、20.82%、19.60%、24.53%和23.71%、19.47%、19.96%、22.89%、25.88%.

图 2 不同添加浓度氟喹诺酮类抗生素在堆肥中的去除效果 Figure 2 Removal efficiency of FQs at different spiked concentrations during composting

图选项

Selvam等^[18]研究了高温堆肥对CIP的去除效果,发现CIP初始含量为1 mg·kg^-1和10 mg·kg^-1时,经过56 d的堆肥,CIP的去除率分别为69%和82.9%,且CIP的去除主要发生在前21 d.甄宝勤等^[19]对NOR热稳定性研究发现,由于诺氟沙星分子C-N键能较弱,当温度升高时首先断裂,脱去乙基,随后侧链哌嗪环破裂和羧基断裂脱去.堆肥过程中嗜温菌和嗜热菌是降解有机物的主要微生物,温度升高将提高嗜温菌和嗜热菌的生物活性,促进抗生素的生物降解^[20].由此可以反映堆肥初期对FQs的高去除率.堆肥中有机质可以提高堆体温度,也可提供额外的降解酶键合点位^[12],而锯末充当了堆肥中一个有机质的来源和补充,这也可能是抗生素最终降解率高的原因之一.尽管高温堆肥不能实现鸡粪中残留抗生素的完全去除,随着堆肥时间的延长,不管FQs添加浓度的高与低,FQs在各组堆肥处理中均发生了降解,说明高温堆肥对去除鸡粪中FQs的效果明显,但不同抗生素之间的去除效果有所差别.这可能是由于抗生素的生物降解反应活化能所决定的,活化能高的物质,热稳定性好,分解速度慢,分解率低^{[21, 22]}.5种FQs的降解速率快慢不同,也与它们的分子结构有关^[11]:诺氟沙星相对分子量较小,结构相对简单,易被微生物分解;环丙沙星和恩诺沙星含有环丙基官能团,提高了侧链哌嗪环的活性^{[19, 20, 23, 24]};洛美沙星在同一苯环上含有两个F原子,结构较为稳定,降解率低.各处理堆体FQs降解均可用一级动力学方程进行拟合(表 2),相关系数介于0.644 7～0.958 4之间.在整个堆肥过程中,不同堆肥处理FQs的降解速率顺序为T60>T30>T15.

表 2 堆肥中氟喹诺酮类抗生素的降解速率和半衰期 Table 2 Degradation rates and half-life time of FQs during composting

表选项

外源添加耐高温菌种堆肥处理试验结果如图 3.不添加高温菌种(T15)和添加高温菌种(T15+B)的堆肥处理中氟喹诺酮类抗生素的降解效果不同,相比而言,T15+B的去除效果比T15好,T15+B处理对NOR、CIP、LOM、ENR、SAR的去除率分别为76.41%、60.3%、60.43%、73.09%和65.84%,比未添加菌种的去除率分别提高了4.89%、4%、5.98%、7.15%、3.26%,其降解去除率由大到小的顺序为NOR>ENR>SAR>CIP>LOM.这源于本微生物菌系是在55 ℃条件下分离筛选出来的,据研究发现,对有机物的分解效率,耐高温微生物要高于中温微生物^[25],因此它们可提高抗生素的去除效果.对堆肥处理过程中的5种抗生素添加菌种和未添加菌种最终浓度含量变化进行t检验,NOR和LOM差异性显着(P<0.05),说明接种复合菌种对堆肥中NOR和LOM类抗生素的降解有显着促进作用.CIP、ENR、SAR差异性不显着(P>0.05),可能是由于抗生素在堆肥过程中浓度降低,并非完全是微生物降解的结果,存在有机物吸附、堆肥温度及抗生素自降解等非生物因素影响^{[26, 27]}.在添加外源菌种处理试验中,T30菌种处理对5种抗生素NOR、CIP、LOM、ENR、SAR的去除率分别为83.14%、76.9%、59.10%、73.09%和65.84%,添加菌种和未添加菌种抗生素含量变化进行t检验,差异性均不显着.可见,该菌种对高浓度抗生素去除率的影响不显着,可能是由于高浓度抗生素影响到菌种的活性所致.

图 3 外源耐高温菌种对氟喹诺酮类抗生素在堆肥中的去除效果 Figure 3 Removal efficiency of FQs after inoculating high temperature resistant bacteria during composting

图选项

(1)高温堆肥适用于鸡粪中氟喹诺酮类抗生素的去除.氟喹诺酮类抗生素在堆肥中降解可用一级动力学方程进行拟合,不同初始浓度的FQs的降解速率顺序为T60>T30>T15.

(2)与正常堆肥体系相对比,外源添加菌种提高了氟喹诺酮类抗生素的去除,尤其对NOR和LOM的去除作用显着.堆肥过程中抗生素的浓度降低,是微生物降解和其他非生物因素影响共同作用的结果.

(3)高温堆肥未能实现畜禽粪便中残留氟喹诺酮类抗生素的高效去除(90%以上),还有待于堆肥过程和外源添加菌种的进一步优化研究.