水体重金属污染已成为当今世界上最严重的环境问题之一，不仅对水生植物、动物产生严重危害，并可能通过食物链影响到人类健康。据报道，水体中微量的重金属即可产生毒性效应，引起藻类生理代谢功能紊乱，减少细胞色素，抑制光合作用，导致细胞畸变，组织坏死，甚至使藻类中毒死亡^[1]。Piovar等^[2]研究指出，铜对四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）和共球藻（Trebouxia erici）的生长、叶绿素含量、可溶性蛋白等产生不利的影响。Magdalena等^[3]研究指出，真眼点藻（Eustigmatos sp.）在含有锌和铅的培养液中，生物量的比增长率和叶绿素含量随着金属浓度的上升以及暴露时间的延长而减少。刘静等^[4]指出高浓度的金属锰能抑制四尾栅藻的生长，导致生物量下降，叶绿素含量降低。Jozef等^[5]研究指出，生长在含镉培养液中的四尾栅藻，叶绿素含量、可溶性蛋白和可溶性酚含量下降。

镉是水体中污染最严重的元素之一，能破坏植物体光合器官和叶绿体结构^[6]，抑制叶绿素的生物合成^[7]。受镉离子胁迫的植物还表现出活性氧（Reactive oxygen species，ROS）积累、酶失活、DNA和蛋白质破坏以及膜脂过氧化伤害等症状^{[8, 9, 10, 11, 12]}。四尾栅藻是一种常见的绿藻，容易生长，被广泛应用到各学科各领域的研究中^{[13, 14]}。Fargaš ová^[15]研究了锰、钼、镍、铜（Ⅰ）和铜（Ⅱ）、钒单独和交互对四尾栅藻的影响。然而，目前关于镉对四尾栅藻生长影响的报道很少。

本文以四尾栅藻为材料，研究其在不同浓度镉离子胁迫下，细胞生长、色素、过氧化氢、超氧化物阴离子以及可溶性蛋白含量的变化，探索其对重金属镉的耐受性，旨在为进一步处理含重金属的废水提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料

实验所用四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）分离自西北农林科技大学北校区图书馆前的喷泉中。将该藻种接种至BG11培养基中并置于人工气候培养箱中，于（20±1）℃、光照4000 lx、光暗比12 h∶12 h条件下培养。 1.2 实验设计

实验所用重金属镉为CdSO₄·3H₂O。根据预实验结果和文献数据^[16]设置了6个镉浓度水平，分别为0、0.5、1、3、5、7 mg·L^-1，每个浓度设置3个平行。将生长至对数期的藻细胞4000 r·min^-1离心10 min，收获后接种至含有不同镉浓度的培养液中，接种密度为3×104 个·mL^-1。从接种后第2 d开始，隔天定时取样测定，共培养20 d。 1.3 藻细胞生长的测定

参考Cai等^[17]的方法进行测定：取对数生长期的藻细胞，稀释不同的倍数，然后用分光光度计分别测定不同稀释倍数下藻液的吸光值，并在显微镜下对藻细胞进行计数，绘制吸光值和藻细胞密度间的标准曲线。

每天定时取样，用分光光度计在450 nm下测定吸光值，利用标准曲线计算藻细胞密度。 1.4 色素提取及含量的测定

色素的提取采用二甲基亚砜法^[18]。取破碎后的藻液，加入二甲基亚砜，于65 ℃下黑暗放置1 h，取出后放至室温，离心15 min取上清液。然后利用分光光度计测定750 nm下的吸光值，确保测定值小于0.01。然后测量665、649、480 nm处的吸光值（A₆₆₅、A₆₄₉和A₄₈₀），利用Wellburn^[19]提出的公式计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。

C_a=12.19A₆₆₅-3.45A₆₄₉
C_b=21.99A₆₄₉-4.53A₆₆₅
C_x+c=（1000A₄₈₀-2.14C_a-70.16C_b）/220

过氧化氢的测定采用四氯化钛法^[20]。四氯化钛能和过氧化氢反应产生橙红色，在410 nm处有最大吸光值。取破碎后的藻液，加入50 mmol·L^-1 pH为6.0的磷酸缓冲液，6000 r·min^-1 离心15 min，取上清液3 mL，加入0.1%四氯化钛和20%硫酸的混合液（1∶1），混匀后再离心15 min，取上清液，用分光光度计在410 nm波长下测定吸光值。

过氧化氢的含量通过绘制的标准曲线确定。 1.6 超氧化物阴离子含量的测定

参照高俊风^[21]的α-萘胺显色法测定。NO₂^-可以和盐酸羟胺反应，产生的物质可以和α-萘胺发生显色反应，呈紫红色，在530 nm处有最大吸光值。

利用标准曲线可以得出相应的NO₂^-浓度，再根据下列反应方程式换算出超氧化物阴离子自由基的浓度：

NH₂OH+2O₂^-+H⁺=NO₂^-+H₂O₂+H₂O

采用Bradford^[22]的考马斯亮蓝G-250法测定。在提取的含有可溶性蛋白溶液中加入考马斯亮蓝，放置2 min后于1 h内在595 nm处比色测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白制作标准曲线，通过该曲线得到可溶性蛋白含量。 1.8 数据处理与分析

所有的处理设置三个重复，所有数据均以平均数±标准差（Mean±SD）表示，利用SPSS 17统计软件对实验结果进行单因素方差分析（ANOVA），并用LSD法对组间差异进行比较，以P≤0.05作为差异显著水平。 2 结果与分析 2.1 镉对四尾栅藻生长的影响

不同浓度的镉对四尾栅藻生长的影响见表 1。在培养的第2 d，镉对四尾栅藻生长的影响不显著（P>0.05）；培养第4 d，3 mg·L^-1镉开始出现抑制作用；第10 d，1 mg·L^-1镉开始出现抑制作用；第12 d，0.5 mg·L^-1镉开始出现抑制作用，且随着镉浓度的上升，抑制作用增强。在高浓度镉离子（3~7 mg·L^-1）作用下，四尾栅藻的生长受到较强抑制，即高浓度镉对四尾栅藻有较强的毒性，可以强烈抑制四尾栅藻的生长。虽然1 mg·L^-1的镉对其有抑制作用，但四尾栅藻还可以生长，即可以耐受1 mg·L^-1的镉。

表 1 不同镉浓度下四尾栅藻的细胞密度（×105·mL^-1）Table 1 Cell density of S. quadricanda under various Cd²⁺ concentrations（×105·mL^-1）

表选项

不同浓度的镉对四尾栅藻色素含量的影响见图 1。以培养第18 d取样分析为例，不同浓度的镉对叶绿素a的含量均有显著影响（P≤0.05），随着镉浓度的上升，叶绿素a的含量减少。与对照组相比，镉浓度为0.5 mg·L^-1时叶绿素a的含量降低了59.93%，镉浓度为3 mg·L^-1时其含量减幅高达81.38%。不同浓度的镉对叶绿素b的含量也有显著影响（P≤0.05），但与叶绿素a相比所受的影响较小，与对照组相比，镉浓度为0.5 mg·L^-1时其含量降低了29.03%，镉浓度为3 mg·L^-1时降低了53.56%。随着镉浓度的上升，类胡萝卜素的含量也有所减少，不同浓度的镉对类胡萝卜素含量的影响显著（P≤0.05）。与对照组相比，镉浓度为5 mg·L^-1时类胡萝卜素的含量降低了30.79%，镉浓度为7 mg·L^-1时降低了60.17%。

图中不同小写字母表示各处理间差异显著（P≤0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference（P≤0.05）between different treatments. The same below 图 1 培养18 d四尾栅藻的各种色素的含量（n=3）Figure 1 Effect of Cd2+ concentrations on pigments of S. quadricauda on 18 days（n=3）

图选项

在培养第18 d时，四尾栅藻可溶性蛋白的变化见图 2。在较低镉浓度范围内（0~1 mg·L^-1），随着镉浓度的上升，可溶性蛋白的含量逐渐增大，镉浓度上升到1 mg·L^-1时，可溶性蛋白含量达到最大，之后随着镉浓度的上升其含量逐渐减小，即在高浓度的镉溶液中，可溶性蛋白的产生受到抑制，且随着镉浓度的上升抑制作用逐渐增强。在镉浓度为3、5、7 mg·L^-1时，可溶性蛋白含量分别为对照组的91.95%、46.1%、34.54%。

图 2 培养18 d四尾栅藻的可溶性蛋白的含量（n=3）Figure 2 Effect of Cd2+ concentrations on soluble protein of S. quadricauda on 18 days（n=3）

图选项

在不同浓度的镉溶液中培养18 d，过氧化氢和超氧化物阴离子含量的变化见图 3。在一定浓度范围内（0~3 mg·L^-1），镉对过氧化氢含量的影响不显著（P>0.05）。当镉浓度升至5 mg·L^-1时，与对照组相比，过氧化氢含量增大了约48倍；在镉浓度为7 mg·L^-1时，过氧化氢含量与对照组相比增大了约131倍。超氧化物阴离子的变化趋势与过氧化氢的变化趋势相似，随着镉浓度的上升，超氧化物阴离子的含量逐渐增多，低浓度的镉（0~1 mg·L^-1）对超氧化物阴离子含量的影响不显著（P>0.05）。然而在镉浓度为5 mg·L^-1时，超氧化物阴离子含量开始明显增大，在镉浓度为7 mg·L^-1时，与对照组相比增大了约8倍。过量的过氧化氢可以抑制植物体内多种生理生化反应，最终影响植物体内代谢^[23]，而过量的超氧化物阴离子可以对细胞结构和功能产生破坏^[24]，因而高浓度镉下过氧化氢和超氧化物阴离子含量的显著增加说明高浓度镉对四尾栅藻有较强的毒性。

图 3 培养18 d四尾栅藻的过氧化氢和超氧化物阴离子的含量（n=3）Figure 3 Effects of Cd2+ concentrations on hydrogen peroxide and superoxide anion of S. quadricauda on 18 days（n=3）

图选项

镉离子是目前水体重金属污染的主要元素之一。镉具有较强的生物毒性，主要表现在干扰细胞的各种代谢过程，特别是能量代谢、膜运输和蛋白质合成，并可能直接或间接地干扰DNA的遗传控制和修复机制^[25]。从镉对四尾栅藻生长影响的研究中可以看到，高浓度的重金属镉（3~7 mg·L^-1）胁迫对四尾栅藻的生长产生显著的抑制作用（P≤0.05）。叶绿素含量是描述藻类生长的重要指标，叶绿素含量降低表明环境对其生长有阻碍作用，反之则有促进作用^[26]。在本研究中，各种色素含量均降低，表明镉对四尾栅藻的生长代谢活动产生了抑制作用。Jozef等^[24]研究指出四尾栅藻在铜胁迫下叶绿素a的含量减少，有学者研究镉对螺旋藻（Spirulina platensis）^[16]、普通小球藻（Chlorella vulgaris）和湛江等鞭金藻（Dicrateria zhanjiangensis）的生长^[27]以及轮藻（Chara fragilis）叶绿素含量^[28]的影响发现，经过镉处理其生长均受到抑制，叶绿素a含量均降低。本实验结果与已有的研究结果一致。

可溶性蛋白含量是衡量植物是否发生重金属胁迫的重要指标之一。在本研究中，可溶性蛋白含量在低浓度镉胁迫下升高，在镉浓度为1 mg·L^-1时可溶性蛋白的含量最高。随着镉浓度的上升，可溶性蛋白的含量降低。有研究表明，可溶性蛋白与细胞内多种代谢过程有关，重金属胁迫能诱导相关胁迫蛋白基因的表达，从而降低重金属的毒性，这是植物对环境胁迫的一种防卫机制^[29]；也有研究认为很可能是植物通过可溶蛋白含量的提高而抵抗镉毒害，例如镉能诱导产生镉结合蛋白，从而降低镉的毒性。细胞渗透浓度和功能蛋白的数量也会因可溶性蛋白含量的提高而增加，有助于维持细胞正常代谢，但高浓度镉对蛋白质的合成起破坏作用^[30]。徐勤松等^[31]在研究镉、铜和锌胁迫下黑藻（Hydrilla verticillata）活性氧的产生及抗氧化酶活性的变化中发现，镉和锌胁迫下可溶性蛋白含量先增后减，在铜胁迫下可溶性蛋白含量则一直减少。Piovár等^[2]就铜对四尾栅藻影响的研究也表明，可溶性蛋白含量虽然在低浓度下有上升的趋势，但总体还是减少的。有学者认为这是由于铜的毒性比镉和锌更强以及各金属对黑藻毒害的浓度效应不同^[30]。

过氧化氢是活性氧重要的代表之一，在正常情况下，植物体内过氧化氢的产生和清除过程基本保持一种精细的平衡状态。这样既保证了植物体内过氧化氢具有一定的生理功能，同时也将其对植物的伤害效应降到最低^[23]。许多生物和非生物胁迫均能导致植物产生过氧化氢，通过逆境下植物体内过氧化氢含量的变化，可以了解逆境环境对植物的毒害作用。而进入生物体内的一些分子氧，可经单电子还原成超氧化物阴离子，其在逆境条件下还原的几率更大。测定逆境条件下植物组织中超氧化物阴离子自由基的含量，可以间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱^[20]。本研究中，过氧化氢和超氧化物阴离子含量都随着镉浓度的上升而增加，在低浓度镉溶液中，过氧化氢和超氧化物阴离子含量均较少，而过氧化氢含量在5、7 mg·L^-1的镉浓度下、超氧化物阴离子含量在7 mg·L^-1的镉浓度下都显著增大，可见高浓度的重金属镉对四尾栅藻有较强的毒性，而四尾栅藻可以耐受低浓度的镉。Piovár等^[2]研究显示四尾栅藻在铜影响下，过氧化氢和超氧化物阴离子的含量随着铜含量的增大而增大；李建宏等^[32]研究显示椭圆小球藻在镉影响下，超氧化物阴离子含量随镉浓度的上升而增大；田丹等^[27]研究显示普通小球藻和湛江等鞭金藻在镉影响下，过氧化氢含量都随着镉含量的上升而增大。本实验结果与已知的研究结果一致。 4 结论

虽然重金属镉对四尾栅藻有一定的毒害作用，但在低浓度的镉（0~1 mg·L^-1）中，四尾栅藻可以产生抵抗镉毒性的一些物质（如可溶性蛋白），且低浓度镉对色素、过氧化氢、超氧化物阴离子含量的影响较小，四尾栅藻可以正常生长；四尾栅藻对低浓度重金属镉具有良好的耐受性，可以耐受浓度为1 mg·L^-1的镉。