随着社会与经济的发展，人类加大矿产开采、金属冶炼、废水排放等生产活动，导致日益严重的土壤重金属污染问题^[1]。重金属的生物毒性强、污染土壤养分含量低等因素限制了绝大多数植物在重金属污染土壤上的生长^[2]，导致其植被自然恢复困难，植被的自然演替过程缓慢，成为环境污染治理的重大难题^{[3, 4]}。种植生长快速、能生物固氮、提高土壤氮素养分含量的豆科植物，能够促进重金属污染土壤上的植被重建，这成为重金属污染治理的重要举措之一^{[5, 6]} 。

重金属污染胁迫条件下，土壤微生物对豆科植物生长和耐性有重要的作用，已有研究尤其关注了根瘤菌^{[7, 8, 9]}、丛枝菌根真菌（AMF）^{[10, 11, 12]}等有益微生物类群的生态功能。然而，除根瘤菌、AMF等有益微生物类群外，重金属污染土壤中还存在大量的其他微生物，它们经长期适应与进化，对重金属有很强的耐受性，这些土壤微生物对植物生长与重金属耐性的影响^{[13, 14]} 引起研究人员的广泛关注。以原状土壤为对照，采用高温灭菌杀死土壤微生物和施杀真菌剂抑制土壤真菌的试验方法，分析完全或部分抑制土壤微生物后，植物生长生理的变化，可间接反映土壤微生物的生态功能^[15]，初步获悉土壤微生物在植物耐受环境胁迫中的作用^[16]。

本研究采集云南会泽铅锌矿周边农田原状土壤，采用高温灭菌杀死土壤中的微生物，定期连续施用杀真菌剂（苯菌灵）抑制土壤真菌，测定豆科植物——紫花苜蓿的株高、生物量、光合色素、丙二醛（MDA）、非蛋白巯基（NP-SH）、总抗氧化力（T-AOC）、重金属（Pb、Zn、Cd和Cu）含量、土壤有效态重金属含量等指标，研究土壤灭菌和施苯菌灵对紫花苜蓿生长、抗氧化生理和重金属累积的影响，分析重金属污染土壤中的微生物对植物耐受重金属的重要性，为促进污染土壤的植被重建提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 供试土壤与植物

供试土壤为云南省会泽县者海镇铅锌冶炼厂周边重金属污染的农田土壤。土壤基本性质：土壤pH值为6.91，有机质含量为28.7 g·kg^-1，全N、全P和全K含量分别为2.2、2.5、6.5 g·kg^-1，碱解N、速效P和速效K含量分别为72.6、38.5、147.8 mg·kg^-1。土壤Pb、Zn、Cd和Cu全量分别为684.8、371.7、6.3、118.3 mg·kg^-1。

供试植物为紫花苜蓿（Medicago sativa L.，简称苜蓿），由云南农业大学动物科学技术学院草业科学实验室提供种子。挑选大小一致且籽粒饱满的种子，用10% H₂O₂进行表面消毒10 min，再用蒸馏水冲洗多次，然后置于放有湿润滤纸的培养皿中，于25 ℃恒温培养箱中催芽3 d，种子露白后播种。 1.2 试验处理

试验设原状土壤、土壤灭菌、施加苯菌灵3个处理，每个处理重复3次。土壤灭菌采用高压蒸汽灭菌法，121 ℃维持2 h；灭菌土在室内敞开放置7 d后，用于盆栽试验。参照常河等^[17]的方法，苯菌灵采用灌溉的方法施加，施用浓度为0.4 g·kg^-1，苜蓿出苗后的第7 d开始浇灌，每7 d浇灌50 mL苯菌灵溶液，试验期间浇灌11次；原状土壤和土壤灭菌处理浇灌同等体积的蒸馏水。

试验于2012 年5 月至7月在云南农业大学试验农场大棚内进行。每盆装土3.0 kg，播种苜蓿种子10颗，出苗7 d 后间苗至6株。实验过程中不施肥，采用自然光照，期间根据盆栽土壤水分状况浇灌蒸馏水，以保持盆栽土壤湿润。 1.3 植株收获与指标测定

苜蓿生长2个月后，常规方法测定株高。采用80%丙酮提取、分光光度法测定叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量^[18]。采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，分光光度法测定叶片可溶性蛋白、丙二醛（MDA）和非蛋白巯基（NP-SH）的含量，以及总抗氧化力（T-AOC）。

收获时将苜蓿地上和地下部分开，先用自来水冲洗，然后用蒸馏水漂洗干净，晾干，选取部分根样采用碱解离、酸性品红染色，方格交叉法测定菌根侵染率^[19]。其余部分经烘干（75 ℃，72 h），称重获得生物量。

由于苜蓿生物量较小，为了保证指标测定所需的样品量，试验将每盆苜蓿植株的地上部和地下部分别混合成1个样，并将植株样品磨碎。称取0.5 g磨碎的植株，硝酸-高氯酸（4∶1）湿法消解，过滤后将滤液定容到50 mL，采用火焰原子吸收分光光度法测定植株Pb、Zn、Cd和Cu的含量^[20]。以0.5 g的石英砂做空白试验，以含Cd、Pb的国家标准物质紫菜（GBW08521）验证方法的准确度。

植物收获后，取盆中上部0.5~10 cm的土壤，采用DTPA（二乙基三胺五乙酸）-TEA（三乙醇胺）法提取有效态Pb、Zn、Cd和Cu，火焰原子吸收分光光度法测定含量^[20]。 1.4 数据处理与统计分析

实验数据运用Microsoft Excel对数据进行处理，计算平均值。用SPSS 22.0数据软件进行统计分析，用LSD法检验各处理平均值在0.05水平的差异性。 2 结果与分析 2.1 土壤灭菌和施苯菌灵对苜蓿菌根侵染、叶绿素含量与生长的影响

通过根系染色、显微镜检观察，原状土壤苜蓿根系AMF菌根侵染率高（43.3%），施苯菌灵处理有极轻微的侵染（2.4%），土壤灭菌处理苜蓿根系未发现AMF的侵染。此外，原状土壤和施苯菌灵处理苜蓿根系形成根瘤，土壤灭菌处理的根系没有根瘤形成。

与原状土壤相比，土壤灭菌处理苜蓿的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均显著下降（P＜0.05），分别下降了27%、23%和30%；施苯菌灵处理叶绿素b含量增加了18%，叶绿素a和类胡萝卜素的含量没有显著变化（表 1）。

表 1 苜蓿叶片光合色素的含量（mg·g^-1） Table 1 Contents of photosynthetic pigments in leaves of alfalfa（mg·g^-1 ）

表选项

与原状土壤相比，土壤灭菌处理苜蓿的株高降低了45%，地上部和地下部生物量分别减少了74%和85%（P＜0.05）；施苯菌灵处理的苜蓿株高、地上部和地下部生物量均有所下降，但差异不显著（图 1）。这表明重金属污染胁迫条件下，土壤中的微生物对苜蓿生长有明显的促进作用。

图中处理间标注的不同小写字母表示差异显著（P < 0.05），下同 Different letters above columns in dicate significeant differences at P < 0.05 lecel. Same as below 图 1 土壤灭菌和施苯菌灵对苜蓿生长的影响 Figure 1 Effects of soil sterilization and benomyl application on growth of alfalfa

图选项

与原状土壤相比，施苯菌灵处理苜蓿的MDA和NP-SH含量没有显著变化，土壤灭菌处理的苜蓿MDA含量增加44%，NP-SH含量减少54%（P＜0.05）；而T-AOC在各处理间差异不显著（图 2）。这表明缺少土壤微生物会降低苜蓿体内巯基的合成，加大重金属对植物的氧化伤害。

图 2 土壤灭菌和施苯菌灵对苜蓿抗氧化生理的影响 Figure 2 Effects of soil sterilization and benomyl application on antioxidant physiological indexes of alfalfa

图选项

与原状土壤相比，土壤灭菌处理的苜蓿地上部（表 2）Cd含量显著增加（P＜0.05），增幅达22%。施苯菌灵和土壤灭菌处理的苜蓿地下部（表 3）Pb含量分别增加8%和10%，Zn含量分别下降35%和30%（P＜0.05）。

表 2 苜蓿地上部重金属的含量与累积量 Table 2 Contents and accumulation of heavy metals in aboveground part of alfalfa

表选项

植物对重金属的累积量为重金属含量与植物生物量的乘积，由于土壤灭菌导致植物地上部和地下部生物量大幅下降，其对重金属的累积量也均显著减少（P＜0.05）。土壤灭菌处理苜蓿地上部（表 2）Pb、Zn、Cd和Cu的累积量分别下降72%、76%、68%和76%，地下部（表 3）Pb、Zn、Cd和Cu的累积量分别下降84%、90%、86%和81%，植株对所测得的各重金属总累积量分别下降74%、73%、68%和76%。施苯菌灵处理中重金属的含量与累积量均与原状土壤处理间没有显著差异。

表 3 苜蓿地下部重金属的含量与累积量 Table 3 Contents and accumulation of heavy metals in belowground part of alfalfa

表选项

土壤灭菌和施苯菌灵处理的苜蓿盆栽土壤有效态Pb的含量分别增加96%和93%（P＜0.05）；土壤有效态Zn、Cd和Cu的含量分别为139.4~163.8、3.4~3.5、28.4~38.4 mg·kg^-1，处理间没有显著差异（表 4）。

表 4 盆栽土壤有效态重金属含量（mg·kg^-1） Table 4 Contents of available heavy metals in pot soli(mg·kg^-1)

表选项

高温灭菌法会改变土壤的理化性质（pH值、阳离子含量、团聚体等）^{[21, 22]}和某些元素（锰、磷等）的可溶态含量^[23]。高温灭菌对土壤理化性质的影响与土壤有机质、粘粒含量等因素关系密切，因土壤种类不同而存在巨大差异^[24]。苯菌灵能够有效抑制土壤中AMF对植物的侵染，但连续施用苯菌灵也会影响土壤的理化性质，降低土壤的pH值和增加土壤氧化还原能力^[25]。然而，高温灭菌和施苯菌灵这两种方法具有操作简单、成本低等优点，因而经常被采用，主要在室内用于植物-土壤微生物、菌根生理生态功能的试验研究^[15]。

本研究中，土壤灭菌和施苯菌灵处理的土壤有效态Pb含量显著增加。这可能由于污染农田土壤中有效态（可交换态和水溶态）Pb含量低，潜在可利用态（碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态）Pb含量高^[26]，高温灭菌和连续施用苯菌灵导致农田土壤pH值下降，促进土壤中潜在可利用态Pb向有效态转化。土壤中不同种类重金属的性质和存在状态存在差异，Zn、Cd等元素有效态含量占全量的比例较高，土壤pH值变化对这些元素有效态含量的影响可能较小。土壤是一个复杂的多物质体系，高温灭菌和施苯菌灵导致的土壤性质变化还有待进一步研究。 3.2 土壤微生物对植物耐受重金属的影响与机理

试验发现，高温灭菌杀死土壤微生物的处理显著降低了苜蓿对重金属的耐性，导致苜蓿MDA含量增加，光合色素、巯基含量和生长下降，而施杀真菌剂抑制土壤真菌的处理对苜蓿的生长与耐性生理的影响不显著。这表明土壤微生物，尤其是土壤细菌对苜蓿耐受重金属有重要的作用。已有研究表明，重金属胁迫条件下，土壤细菌能够显著改善植物的抗逆生理，促进植物的生长，是其增强植物重金属耐性的重要机理之一。如美洲黑杨接种一株植物根际促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）Agrobacterium radiobacter，使得植株叶绿素和可溶性糖含量增加，过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性增强，MDA的含量下降，提高了植物对砷的耐受性^[27]。Cu胁迫下，接种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）可显著降低白羽扇豆体内MDA和巯基的含量，增加大豆体内MDA和巯基的含量，但都减轻Cu对这2种豆科植物生长的毒害效应^[9]。Pb胁迫下，接种四株耐Pb的土壤细菌可增强兵豆（Lens culinaris）的SOD和过氧化物酶的活性，有助于宿主植物耐受Pb胁迫^[28]。

土壤微生物能够改善植物的营养，这也是其增强植物重金属耐性的重要机理之一。Burd等^[29] 报道超量分泌铁载体的克吕沃尔菌（Kluyvera ascorbata）突变体SUD 165/26菌株，通过改善番茄、油菜和印度芥菜的铁素营养，减轻Ni、Pb和Zn对这些植物的生长抑制效应。Cuo等^[30]发现一株耐Cd的PGPR可改善大豆[Glycine max（L.） Merr.]的Fe和Mg的营养，Yang等^[31]研究发现假单胞菌（Pseudomonas sp.）DGS6菌株可改善玉米和太阳花P和Fe的营养。这些细菌均增强了植物对重金属的耐性。值得注意的是，土壤中的根瘤菌，通过共生固氮、分泌植物生长促进物质、激活抗逆生理等方式，促进豆科植物的生长，对于豆科植物耐受养分贫瘠和重金属污染胁迫起着重要的作用^[8]。例如，黄羽扇豆（Lupinus luteus L.）接种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）750菌株后形成固氮根瘤，植物氮含量显著增加^[32]。本研究中土壤灭菌消除了根瘤菌，苜蓿不能形成固氮根瘤，可能是导致苜蓿生长显著下降、重金属毒害作用加重的重要原因之一。

此外，土壤微生物分泌的吲哚乙酸等植物生长促进物质^[8]，也能显著改善植物在重金属污染土壤中的生长。例如，耐Pb的土壤细菌分泌吲哚乙酸和铁载体，显著促进兵豆在Pb胁迫下的生长^[28]。Cu胁迫下，假单胞菌（Pseudomonas sp.）TLC 6-6.5-4菌株通过分泌吲哚乙酸和溶磷作用，显著增加玉米和太阳花的生物量^[33]。伯克氏菌（Burkholderia sp.）D54菌株分泌吲哚乙酸、铁载体、ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶等物质，显著增加东南景天（Sedum alfredii）的生物量^[34]。假单胞菌DGS6菌株分泌吲哚乙酸和ACC脱氨酶，也被认为是促进玉米和太阳花生长的原因所在^[31]。 3.3 土壤微生物对植物累积重金属的影响与机理

土壤微生物通过改变植物的生物量，影响植物对重金属的累积量。植物的重金属累积量是重金属含量乘以植物生物量，土壤灭菌极显著降低苜蓿的生物量，因而导致苜蓿对重金属的累积量极显著减少，间接说明土壤微生物通过增加植物的生物量来增加植物的重金属累积量。如Wu等^[35] 发现接种植物促生细菌对印度芥菜地上部Pb和Cd的含量没有显著影响，但增加了印度芥菜地上部生物量，从而显著增加印度芥菜对Pb和Cd的累积量。有研究表明，假单胞菌TLC 6-6.5-4菌株^[33]和DGS6菌株^[31]会增加玉米和太阳花的生物量，伯克氏菌D54菌株会增加东南景天的生物量^[34]，均导致植物对重金属的累积量显著增加。然而，也有研究报道接种微生物虽然增加了植物的生物量，却减少了植物对重金属的累积量。Dary等^[32]报道了混合接种慢生根瘤菌、假单胞菌和Ochrobactrum cytisi后，黄羽扇豆植株地上部和地下部的生物量增加，但Pb、Cd和Cu的累积量均下降。蚕豆（Vicia faba）接种4种PGPR的混合菌剂，根系生物量增加26%，而Cu的累积量降低35%^[36]。

此外，土壤微生物通过分泌有机酸、铁载体、生物表面活性剂、胞外多糖和糖蛋白等物质，增加或降低土壤重金属的生物有效性^[37]，也是其影响植物对重金属累积量的重要机理。试验发现，土壤灭菌和施苯菌灵处理的土壤有效态Pb含量显著增加，其他重金属有效态含量没有显著变化。这一方面与重金属的自身化学特性和土壤环境化学行为有关，另一方面可能是由于重金属污染土壤中的微生物菌体具有吸附作用，尤其是与植物共生的AMF菌丝对重金属离子具有很强的吸附固持作用^[38]；或通过土壤微生物的溶磷作用，增加土壤有效态磷含量，进而间接通过磷素钝化重金属离子活性^[39]，降低土壤重金属离子的生物有效性。土壤灭菌和施苯菌灵抑制真菌的处理消除了菌体对Pb离子的钝化作用，因而导致土壤Pb的生物有效性增加。

目前，对重金属污染土壤的生物修复已引起国内外的广泛重视。该试验从土壤灭菌和杀真菌剂抑制真菌两方面，探讨消除土壤微生物和抑制土壤真菌对苜蓿耐受和累积重金属的影响，初步揭示了土壤微生物，尤其是土壤细菌在苜蓿重金属耐性和吸收积累方面的作用。重金属污染土壤严重抑制植物的生长，采用豆科植物进行植被重建是重金属污染土壤治理的研究热点之一^{[6, 8]}。然而，因重金属的生物毒性，豆科植物存在生长受抑制的问题，极大限制了植被重建的效率。在重金属严重污染的土壤中，存在种类丰富、数量巨大的微生物。这些土壤微生物在胁迫条件下，经长期的适应与进化，不仅具有很强的重金属耐性，而且具有重要的生态学功能，显著影响植物的生长及其对重金属的耐性^[40]。因此，利用土壤中有益的微生物，尤其是能够与豆科植物共生的根瘤菌和AMF及促进植物生长的PGPR，促进植物的生长、增强豆科植物对重金属的耐性、强化重金属污染土壤的植被重建，具有重要的实践意义。 4 结论

土壤灭菌显著降低苜蓿光合色素含量和植株的生长，明显降低苜蓿对重金属的耐性与累积能力，施用苯菌灵对苜蓿生长、抗氧化生理及重金属累积的影响均不显著，间接验证了土壤细菌对豆科植物耐受重金属有重要作用。因此，利用豆科植物进行重金属污染土壤的植被重建，应考虑如何利用土壤细菌的有益作用，促进植物的生长，强化植被重建的效果。