转基因技术在农业领域发挥了举足轻重的作用，转基因技术的兴起，改变了依靠农药和除草剂保证作物产量和品质的传统模式。据报道，2013年全球有27个国家种植转基因作物，种植面积超过1.75亿hm²，其中中国种植了420万hm²的转Bt抗虫棉，占到棉花总种植面积的90%^[1]。随着转基因技术的飞速发展和人们对作物品种的多样性需求，我国已成功培育出具有各种优良性状和经济价值的转基因棉花品种。如将与棉花产量相关的RRm²（RNA recognition motif 2）基因导入我国主栽棉花品种Gossypium hirsutum中，获得的转RRm²基因高产棉新材料^[2]，将天麻抗真菌蛋白（Gastrodia antifungal protein/GAFP）基因导入棉花植株获得的能够显著抑制棉花黄萎病菌和枯萎病菌的转GAFP基因抗病棉^[3]，将与乙烯合成密切相关的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase/ACO）基因导入棉花植株获得的转ACO2基因优质棉^[4]。这些转基因材料的获得在棉花高产、抗病及优质品种培育方面具有极大的应用价值。近几年，国内外学者越来越关注转基因作物的环境安全，尤其是新型转基因棉花的环境安全性研究，这将有助于更好地保护人类的健康和生态环境的安全，保障转基因生物的健康发展。

土壤是物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物作为土壤中参与各种生化反应过程必不可少的一部分，在表征土壤健康和维持土壤生态系统平衡中扮演着重要的角色^[5]。土壤中微生物的种类繁多，数量巨大，土壤微小的变化都可能会引起微生物群落的改变。有研究表明，转基因抗虫作物的残体及根系中的毒素蛋白在土壤中不易被降解，对土壤中的生物尤其是以分解植物残体和降解毒素为主要活动的微生物可能产生不利的影响^{[6, 7]}。土壤细菌是土壤微生物的主要组成部分，是土壤中最活跃的生物分子，参与了土壤物质循环、能量转化及有机物质分解和养分释放的过程，被公认为是土壤生态系统变化的提示信号，所以，土壤细菌是最适于研究转基因作物种植对土壤生态环境影响的微生物。目前，非抗虫转基因棉花作为有重要应用前景和效益的棉花品种，其对土壤细菌群落多样性影响的研究报道较少。因此，本研究利用PCR-DGGE技术，以转RRm²基因高产棉、转GA FP基因抗病棉、转ACO2基因优质棉和常规棉为研究材料，探究它们种植后对土壤细菌群落多样性的影响，旨在为非抗虫转基因棉花种植后的土壤环境安全评价提供理论基础。

试验地位于天津市武清区梅厂镇周庄村（39°21′N，117°12′E），海拔6.3 m。地处华北平原东北部，地势平缓，属暖温带湿润气候。供试土壤为潮土，部分基本理化性质如下：全磷含量0.79 g·kg^-1，全氮含量0.63 g·kg^-1，有机质含量18.00 g·kg^-1，pH8.24。

本试验所使用的三种转基因棉花材料及非转基因材料均由中国农业科学院棉花研究所提供。非转基因常规棉品种为“中棉所12”；转RRm²基因高产棉是将甘蓝型油菜（Brassica napus）中的可提高双子叶植物产量并改善品质的RRm²基因转入“中棉所12”而获得的新型转RRm²基因棉花^[2]；转GAFP基因抗病棉是将GAFP基因转入新疆陆地棉栽培品种（系）中获得的新材料，GAFP基因是从我国传统中药天麻（Gastrodiaelata BI.）中分离得到的一种编码具有广谱抗真菌活性的蛋白质的基因，它所编码的蛋白质对许多植物真菌病的致病菌具有很强的抑制作用^[3]；转ACO2基因优质棉中的ACO2基因是ACC氧化酶基因家族（ACO1、ACO2和ACO₃）中的一个，ACO是乙烯合成途径中的最后一个酶，也称为乙烯形成酶（EFE），在棉花纤维发育过程中，ACO基因在纤维快速伸长期大量表达，具有显著的纤维表达特异性^[4]。

4种棉花种植面积均为300 m²（20 m×15 m），覆膜种植，每个品种间种植宽度为5 m的玉米保护行。氮肥200 kg·hm^-2，钾肥100 kg·hm^-2，磷肥60 kg·hm^-2。其中氮肥基施60%，追施40%。磷钾肥全部作基肥施用，其他田间管理按常规进行，不施农药。

2013年5月4日播种，在棉花吐絮期（2013年9月22日）采集土壤样品。采集时，去除表面杂草和枯枝落叶，分别在随机划分的3个区域内各选取3株棉花，用直径3 cm的土钻在距离主根2 cm位置取20 cm深土样，并将每个采样区的样品分别混合置于冰盒中带回实验室，采集土样一部分置于-20 ℃冰箱用于土壤细菌群落多样性分析，一部分经过风干、研磨、过筛用于土壤理化性质的测定。

（1）土壤总DNA提取

采用MoBio公司的Ultraclean soil DNA isolation kit（MoBio laboratories，Solana Beach，CA，USA）试剂盒，按照操作说明提取，用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测。

（2）PCR扩增

提取的土壤总DNA使用细菌16S rDNA V3可变区通用引物341f-GC和534r。每个样品3个重复，按照使用说明书，反应体系为50 μL，PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增后产物用于DGGE分析。

（3）DGGE检测

PCR产物采用Bio-Rad公司的DcodeTM通用突变检测系统（Bio-Rad，USA）按照操作说明进行检测。浓度为8%聚丙烯酰胺，变性梯度为40%~60%，60 ℃预热，将20 μL PCR产物与10 μL 6×loading buffer混合后用微量进样器加入胶孔中，在60 ℃ 100 V恒定电压下电泳14 h。电泳完毕后用SYBRR^®Green1（1∶10 000）染色30 min，然后用Gel Dox XR凝胶成像系统（Bio-Rad）进行观察与拍照。

采用Quantity One图像处理软件对DGGE图谱中条带进行数字化处理，然后在紫外灯下对图谱的特异条带和优势条带进行割胶，用341f和534r引物进行扩增。PCR产物用WizadR SV Gel and PCR Clean-Up system试剂盒（Progema，USA）纯化后与载体pGEM-T Easy Vector（Progema，USA）连接，T7、SP6为引物测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将阳性的克隆子在NCBI数据库中进行比对分析。

采用Excel 2007和SPSS 17.0（Duncan′s test）对试验数据进行分析，采用Quantity One 4.6.2软件进行数字化处理并进行聚类分析。各样品用香农-维纳指数（Shannon-Wiener index，H）、均匀度（Evenness index，E_H）和丰富度（Richness，S）^[8]评价细菌多样性的变化，其计算公式如下：

H=-∑P_ilnP_i

E_H=H/lnS

公式中：H代表香农-威纳指数；P_i代表第i条带占总强度的比值；E_H代表均匀度指数；S代表条带数量或丰富度。

由图 1和图 2可以看出，Ultraclean soil DNA isolation kit（MoBio laboratories，Solana Beach，CA，USA）试剂盒提取的4种棉花土壤基因组总DNA较好，通过16S rDNA V3区通用引物进行PCR扩增反应，得到产物长度约为230 bp的片段，PCR产物用于PCR-DGGE分析。

1~3：常规棉；4~6：转基因高产棉；7~9：转基因抗病棉；10~12：转基因优质棉。下同 1~3：Conventional cotton；4~6：High-yield transgenic cotton；7~9：Disease-resistant transgenic cotton；10~12：High-quality transgenic cotton. The same below 图 1 部分样品基因组DNA提取图 Figure 1 Picture of genomic DNA extraction of some samples

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图 2 部分样品16S rDNA基因PCR扩增图 Figure 2 Picture of 16S rDNA gene PCR amplification of some samples

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DGGE图谱能够直观地反映不同土壤细菌16S rDNA的多样性，也可在分子水平上反映出不同土壤细菌种群结构的多样性。在DGGE图谱中，不同位置的条带代表不同的细菌类群，一般认为，条带的亮度反映出不同细菌类群的相对量的多少，亮度高的被认为是优势菌群。不同泳道同一横向位置的不同条带一般被认为是同一细菌类群。由图 3可见，4种棉花土壤样品DGGE图谱的电泳条带数目、强度和迁移率均无显著差异。另外，对4种不同土壤样品细菌群落结构相似性进行聚类分析，结果如图 4所示。3种转基因棉与常规棉在67%的相似性水平上聚为一类。一般不同条带相似度高于60%的两个群体就具有较好的相似性。由此看出，3种转基因棉与常规棉土壤细菌群落结构差异不显著。

图 3 不同土壤样品DGGE图谱 Figure 3 DGGE profile of different soil samples

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图 4 UPGMA群落结构相似性聚类分析 Figure 4 Cluster analysis of bacterial community structure similarity by UPGMA

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H、E_H和S是细菌丰富度和均匀度的综合性指标。根据每个样品条带的信息，对4种棉花种植土壤样品的细菌多样性指数进行了分析，结果发现，与常规棉相比，转基因高产棉以及其他两种转基因棉种植并未对土壤细菌H、E_H和S造成显著影响（表 1）。

表 1 不同棉花品种土壤细菌多样性指数 Table 1 Shannon-Wiener index，richness and evenness of soil microbial diversity under different cotton varieties

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图 5 以16S rDNA同源性为基础的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

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转基因作物外源蛋白可通过根系分泌物、花粉传播和秸秆还田等方式进入土壤，给土壤环境及人类健康带来潜在影响，土壤微生物由于其特殊的角色，对土壤健康的指示作用不可替代^[9]。俞明正等^[10]利用PCR-DGGE技术研究不同生育期的转TaDREB4基因抗旱小麦种植对土壤微生物群落多样性的影响发现，在同一生育期，转TaDREB4基因抗旱小麦与其受体的香农多样性指数、均匀度指数差异不显著。最近利用稀释平板法对转AmGS抗寒基因红叶石楠的研究发现，转AmGS基因红叶石楠根际土壤与对照组相比，细菌的种类和数量没有发生明显变化^[11]。之前的研究也未发现转基因大豆种植对土壤线虫群落造成显著影响^[12]，对于以微生物为主要食物来源的土壤线虫来说，这表明转基因作物的种植可能未通过食物链对土壤线虫产生间接的影响，即转基因作物的种植未对土壤微生物群落产生影响。但也有研究报道，转基因作物的种植对土壤微生物多样性有影响。Castaldini等^[13]在温室条件下利用DGGE技术对转Bt基因玉米（Bt11和Bt176）的研究发现，转基因玉米和非转基因玉米根际土壤微生物群落存在显著差异。Baumgarte等^[14]的研究发现，土壤微生物群落结构的变化主要受到各种环境因素的影响，转基因作物自身的影响较小。本研究表明，与常规棉相比，3种转基因棉种植均未对土壤细菌H、E_H和S造成显著影响，且4种棉花土壤细菌群落相似性较高，这一结果与Li等^[15]、Hu等^[16]和Saxena等^[17]的研究结果一致。可见，土壤细菌群落结构多样性并没有因为转基因棉花的种植产生明显的变化^[18]。

通过对DGGE指纹图谱的优势条带进行割胶回收测序，结果显示，这些同源序列分别属于拟杆菌门（Bacteroidetes）的黄杆菌纲（Flavobacteria）、噬弧菌属（Bacteriovorax）、Segetibacter，变形菌门（Proteobacteria）的α-变形菌纲（alpha proteobacterium）、地杆菌属（Geobacter），厚壁菌门（Firmicutes）的Paenisporosarcina，酸杆菌门（Acidobacterias）的酸杆菌属（Acidobacterium），其中拟杆菌门和变形菌门为优势菌群。而大部分属于拟杆菌门和α-变形菌纲的类群广泛分布于农田土壤中^[19]，有很强的适应性，且具有解磷作用^{[20, 21]}，从DGGE指纹图谱上可以看出，拟杆菌门的黄杆菌纲和变形菌门的α-变形菌纲在4种棉花所代表的条带上亮度较高，说明这些菌株在4种棉花种植土壤中比较丰富，可能对棉花的土壤磷素吸收有着重要作用。系统发育树显示，所有比对微生物均为不可培养微生物类群，这些不可培养的微生物无法直接判断其准确的生理特性和其存在于生态环境中的意义^[22]，也就无法具体分析转基因棉花种植对土壤细菌遗传多样性的影响。因此，要全面地研究转基因棉花种植对土壤细菌群落多样性的影响，关键是要了解微生物各个菌群在土壤中的生态意义。

影响微生物群落多样性的因素很多，作物和土壤类型、土壤养分因子、作物根系分泌物和农业管理等都会影响微生物的活力^[23]，且往往一种因素的变化，会使其他因素产生变化，最终影响到与此相关的微生物。因此，要了解转基因棉花种植对土壤细菌群落多样性的影响，需综合各种影响因素进行分析，并对转基因棉花进行长期监测。本试验是在短期内对非抗虫转基因棉的影响进行分析，长期种植后，非抗虫转基因棉花是否会对土壤细菌群落多样性产生影响还有待进一步研究。

与常规棉“中棉所12”相比，3种转基因棉的种植并未对土壤细菌H、E_H和S造成显著影响。两类棉花土壤细菌的群落结构相似性较高，且土壤细菌主要类群属于拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门，其中拟杆菌门和变形菌门为优势菌群。总之，非抗虫转基因棉的种植对土壤细菌群落多样性没有产生显著影响。