厌氧土壤或沉积物中Fe（Ⅲ）还原过程主要是由微生物介导的生物化学过程。具有Fe（Ⅲ）还原功能的微生物能够以Fe（Ⅲ）作为电子受体，并从有机物的代谢或Fe（Ⅲ）还原过程中获得能量维持生长。Fe（Ⅲ）还原研究具有重要的地学与环境学意义，与碳循环、多种金属元素和非金属元素的转化紧密相关，并在污染环境的生物修复、微生物电池研究中发挥重要作用^{[1, 2]}。目前已在水体、淹水土壤及沉积物等各种厌氧环境中鉴定出不同类型的Fe（Ⅲ）还原微生物^{[3, 4]}，其中专性Fe（Ⅲ）还原菌可依靠铁呼吸获得能量^{[5, 6]}，而兼性Fe（Ⅲ）还原微生物则能够以糖类代谢过程中得到的发酵产物（如甲酸、乙酸、丙酮酸和H₂等）为电子供体还原Fe（Ⅲ）^[3]。从沼泽土壤中分离得到的一株专性Fe（Ⅲ）还原菌Pseudomonas能够在消耗H₂的同时还原Fe（Ⅲ），并且还原Fe（Ⅲ）的速率是消耗H₂速率的两倍^[7]。继Pseudomonas sp.和Shewanella putrefaciens^[8]被发现能够以H₂作为电子供体还原Fe（Ⅲ）后，Frank^{[9, 10]}又从海底沉积物中分离出菌株BrY和菌株PCA，能够氧化H₂或乙酸盐来还原Fe（Ⅲ）。Yi等^[4]的研究发现，在添加葡萄糖、丙酮酸盐和乳酸盐的水稻土富集培养体系中，具有发酵功能的Clostridium和Bacllius等微生物是土壤中Fe（Ⅲ）还原微生物的优势种群。黎慧娟等^[11]向水稻土富集培养体系中添加H₂后，能够促进体系的Fe（Ⅲ）还原过程。这些研究表明微生物发酵产氢与Fe（Ⅲ）还原过程存在一定的关联性。然而，有关碳源浓度对发酵型微生物的产氢过程与Fe（Ⅲ）还原过程的影响、产氢过程与Fe（Ⅲ）还原过程的关系以及Fe（Ⅲ）还原过程消耗电子在微生物厌氧电子传递链中所占比例的研究鲜有报道。因此，本试验通过向Fe（Ⅲ）还原微生物的纯培养体系中添加不同浓度的葡萄糖作为唯一电子供体，测定体系中Fe（Ⅱ）和H₂的累积量及pH值随培养时间的变化，比较微生物Fe（Ⅲ）还原过程和产氢过程对不同葡萄糖浓度的响应；同时通过计算微生物发酵产氢和Fe（Ⅲ）还原消耗的电子占体系添加葡萄糖提供电子的比例，阐明Fe（Ⅲ）还原过程在微生物生长代谢过程中对体系碳源电子消耗的贡献，为揭示微生物产氢与Fe（Ⅲ）还原的关系，以及发酵型Fe（Ⅲ）还原微生物依赖H₂还原Fe（Ⅲ）的机理提供依据。

供试的Fe（Ⅲ）还原菌为本实验室从水稻土中分离获得，具有较强Fe（Ⅲ）还原能力（编号JX1-25），菌株为G^-，杆状。菌落形态为：菌落较小，白色，无隆起，规则圆，边缘光滑，有光泽，表面光滑，不透明。对菌株做16S rDNA序列分析，将所得到的序列与EzTaxon Server 2.1数据库中已测定的原核微生物16S rDNA序列进行比对，发现菌株JX1-25与Clostridium beijerinckii NCIMB 8052[CP000721]的相似度达99.66%。

菌株通过5% PTYG液体培养基扩繁，3500 r·min^-1离心10 min获得菌落沉淀，用无菌水稀释制备接种用菌液。5% PTYG液体培养基经121 ℃高温灭菌35 min，成分为：蛋白胨0.25 g·L^-1、胰蛋白胨0.25 g·L^-1、酵母浸粉0.50 g·L^-1、葡萄糖0.50 g·L^-1、MgSO4·7H₂O 0.60 g·L^-1、CaCl₂·2H₂O 0.07 g·L^-1。用1 mol·L^-1 NaOH调节pH至6.5~7.0。

试验共设置6个葡萄糖浓度水平，分别用G1、G2、G3、G4、G5、G6表示，培养体系中添加葡萄糖的最终浓度分别为0.25、0.5、2、4、8、16 mmol·L^-1。试验采用厌氧恒温培养方法，分别向经121 ℃高温灭菌的10 mL血清瓶中加入1 mL不同浓度葡萄糖溶液、1 mL人工合成的Fe（OH）₃悬液（2.13 g·L^-1）、1 mL NH4Cl溶液（5 g·L^-1）、1 mL磷酸缓冲液（0.025 mol·L^-1）和1 mL微生物接种液。充氮除氧，用橡胶盖和铝盖密封，30 ℃避光培养，定期采样测定Fe（Ⅱ）及体系pH值。同时，另将上述培养体系添加至灭菌后的25 mL血清瓶中，充氮除氧后密封，30 ℃避光培养，定期测定培养体系H₂分压。

氢气分压测定采用气相色谱法：柱填充物为TDX-01分子筛（60~80目），柱长2 m，内径2 mm，柱温40 ℃，进样口温度120 ℃，检测器为TCD，检测器温度120 ℃，载气（N2）流量0.3 kg·cm^-2。标准气体购于北京华元气体化工有限公司，浓度为1990 μL/L。

体系Fe（Ⅱ）浓度测定采用邻菲罗啉比色法：采样时将样品充分摇匀，用自动加样枪吸取1 mL悬液置于含4 mL 0.50 mol·L^-1盐酸溶液的带盖聚乙烯管中，于30 ℃恒温浸提24 h，重复3份。测定时，于3500 r·min^-1离心10 min后取1 mL上清液至50 mL容量瓶，用5 mL 1 mol·L^-1 NaAc调控pH值，加入5 mL 1 mg·mL^-1邻菲罗啉显色，定容后于510 nm测定吸光度，计算Fe（Ⅱ）浓度。

体系pH值测定采用玻璃电极电位法。 1.4 数据统计分析

采用Excel及Origin 8.0进行数据处理及作图，同时用描述微生物生长动力学的Logistic方程对不同处理Fe（Ⅲ）还原过程中Fe（Ⅱ）累积浓度随时间的变化进行拟合。Logistic方程的表达式为：

C_t=a/（1+be^-ct） 式中：t为培养时间；C_t为培养时间t时体系的Fe（Ⅱ）浓度；a、b、c均为参数。

通过方程拟合，可求出Fe（Ⅲ）还原的最大潜势，[即Fe（Ⅱ）最大累积量，数值等于参数a]、Fe（Ⅲ）最大还原速率（V_max，数值等于0.25ac）和最大还原速率对应的时间（T_Vmax，数值为lnb/c）。采用典范对应分析（Canonial correspondence analysis，CCA）^{[12, 13]}分析异化铁还原过程与产氢过程的关系。排序参数包括Fe（Ⅲ）还原过程动力学参数（a、V_max、T_Vmax）、培养过程中体系最低pH值（pH_max）及对应时间（pH_max-T）、氢气分压峰值（ppH_2max）及对应时间（ppH_2max-T）共7个参数。CCA排序采用软件CANOCO4.5完成。

纯培养体系中Fe（Ⅲ）还原菌JX1-25利用不同浓度葡萄糖时，Fe（Ⅱ）浓度随培养时间的变化如图 1所示。菌株JX1-25能较好地利用葡萄糖还原Fe（Ⅲ），体系的Fe（Ⅱ）浓度随着所添加的葡萄糖浓度的升高而升高。添加低浓度葡萄糖的处理G1、G2，在培养的30 d内Fe（Ⅲ）还原几乎没有发生，其他四个处理在第10 d后表现出明显差异，且在培养10~15 d期间差异最为显著。Fe（Ⅲ）还原速率随着葡萄糖浓度增高而增快，至培养结束时，G4、G5、G6处理最终Fe（Ⅱ）含量分别达到431.83、432.03、433.35 mg·L^-1，与初始添加的Fe（Ⅲ）量（425.71 mg·L^-1）基本接近，Fe（Ⅲ）基本完全还原；而G1、G2和G3的最终Fe（Ⅱ）浓度仅为26.74、56.74、229.27 mg·L^-1，表明碳源不足时对Fe（Ⅲ）还原过程影响显著。

图 1 添加不同浓度葡萄糖时菌株JX1-25纯培养体系中Fe（Ⅱ）浓度的变化 Figure 1 Changes of Fe（Ⅱ） concentrations during pure culture of strain JX1-25 with different concentrations of glucose

图选项

用Logistic方程对Fe（Ⅲ）还原过程中Fe（Ⅱ）累积浓度随培养时间的变化进行拟合，拟合参数如表 1所示。相关系数（r）在0.976~0.999之间，说明菌株JX1-25利用不同浓度的葡萄糖还原Fe（Ⅲ）的过程可以用Logistic方程较好地拟合。a与添加碳源浓度关系密切，G1、G2、G3与G4、G5、G6处理间差异显著；V_max随着体系葡萄糖浓度增高而增大，不同处理间差异明显；不同处理中T_Vmax及最终Fe（Ⅲ）还原率也表现为随葡萄糖浓度的增高而增高，当葡萄糖浓度增加到G4处理时其还原率已趋于100%，此时葡萄糖浓度不再是制约因素，表明体系葡萄糖浓度为4 mmol·L^-1时已能够很好地满足体系Fe（Ⅲ）还原过程的需求。

表 1 菌株JX1-25纯培养条件下利用不同浓度葡萄糖的Fe（Ⅲ）还原动力学拟合参数 Table 1 Kinetic parameters of Fe（Ⅲ） reduction during pure culture of strain JX1-25 with different concentrations of glucose

表选项

菌株JX1-25厌氧培养过程中体系的pH变化如图 2所示。G1和G2处理中pH基本维持在7.0左右，而其他处理则明显表现出pH值在培养前5 d中迅速降低的趋势，并且随着葡萄糖浓度增加，pH值降幅增大，G5和G6处理中pH可降低至4.2左右；随着培养时间的延长，pH可缓慢上升。添加葡萄糖后pH值的降低通常与葡萄糖发酵过程产生的有机酸有关，由于添加的葡萄糖在厌氧培养的前期发酵产酸过程剧烈，导致培养体系pH值明显下降。在培养10 d后，pH值上升表明体系对H+的消耗量增大。

图 2 添加不同浓度葡萄糖时菌株JX1-25纯培养体系pH值的变化 Figure 2 Changes of pH values during pure culture of strain JX1-25 with different concentrations of glucose

图选项

菌株JX1-25以葡萄糖作为碳源时体系氢气分压随培养时间的变化如图 3所示，氢气分压呈先增后降的趋势。G1、G2处理在整个培养过程中只能检测到很低的氢气分压，G3~G6处理在培养5 d后氢气分压开始迅速增加，至培养10 d左右体系中氢气分压达到峰值，随后快速下降，在培养20 d时氢气分压降至检出限以下（未检出）。葡萄糖浓度对产氢速率及氢气分压有显著影响，表现为产氢速率及氢气分压随葡萄糖浓度的增加而增大，体系中的ppH_2max分别为：0.31、0.005、2.54、5.88、10.12、16.62 kPa。比较产氢过程与体系的pH值变化趋势可以看出，pH_max-T与氢气分压开始迅速增加的时间相对应，而氢气分压开始下降时体系的pH值开始回升。

图 3 添加不同浓度葡萄糖时菌株JX1-25纯培养体系中氢气分压的变化 Figure 3 Changes of hydrogen partial pressure during pure culture of strain JX1-25 with different concentrations of glucose

图选项

采用CCA对本试验中6个处理和7个相关参数进行关联分析（图 4），图中箭头分别表示参数a、V_max、T_Vmax、pH_max、pH_max-T、ppH_2max、ppH_2max-T，空心圆表示6个不同浓度葡萄糖处理G1、G2、G3、G4、G5、G6。前两个排序轴的特征值分别为0.069和0.006，共同解释了不同葡萄糖浓度处理分布特征的96.2%；两个环境排序轴的相关系数为0，表明排序结果可靠，能够较好地反应异化铁还原过程与产氢过程中变量因子与不同葡萄糖浓度的关系。与CCA排序图中第一排序轴相关系数较高的是Fe（Ⅱ）还原潜势a（r=0.979），说明第一排序轴从左至右表示涉及Fe（Ⅲ）还原过程的强度增加，反映的是不同浓度葡萄糖添加条件下Fe（Ⅲ）还原能力的变化；与第二排序轴相关性较高的有T_Vmax（r=0.776）、V_max（r=0.541）、ppH_2max（r=0.576）、ppH_2max-T（r=0.629）、pH_max（r=0.759）及pH_max-T（r=0.849），说明第二排序轴自下而上反映了不同葡萄糖浓度添加条件下微生物Fe（Ⅲ）还原与产酸及产氢过程的强度增加。

图 4 菌株JX1-25利用不同浓度葡萄糖时Fe（Ⅲ）还原及产氢过程参数的二维排序图 Figure 4 Biplot of canonial correspondence analysis（CCA） for hydrogen production and Fe（Ⅲ） reduction processes at different concentrations of glucose

图选项

葡萄糖作为体系唯一碳源对微生物生长代谢有重要的影响。CCA分析发现，不同浓度葡萄糖的添加导致了各体系pH值的不同、Fe（Ⅲ）还原过程及产氢过程的差异，从而形成不同的微生物生境，故添加不同浓度葡萄糖对微生物活动总体特征呈现较大差异。Fe（Ⅲ）还原潜势与氢气分压峰值、pH最低值的相关系数分别为0.785**、-0.715**，最大还原速率与氢气分压峰值的相关系数为0.996**，显示出产氢过程与Fe（Ⅲ）还原过程的联系，说明随着葡萄糖发酵，微生物脱氢释放了大量H+，加速了微生物对Fe（Ⅲ）的利用能力，氢气的产生对Fe（Ⅲ）还原过程有促进作用。贾蓉等^[14]也得出类似结论。有大量文献报道了氢气对Fe（Ⅲ）还原过程的影响，如Lovley等^[15]发现在水底沉积物中添加H₂能够明显刺激Fe（Ⅲ）还原作用，在沉积物中Fe（Ⅲ）为主要的末端电子受体，容易利用所添加的H₂，并且Fe（Ⅲ）还原微生物对氢分子的亲和力远大于产甲烷微生物。

微生物发酵产氢需要在一定的条件下进行，本试验条件下，JX1-25培养前5 d体系中仅能检测到很低的氢气分压。其原因可能是微生物生长有一段适应期，产生氢气量少于消耗量，另一方面可能是因为未达到诱导产氢的条件。CCA分析发现，氢气分压峰值与pH最低值之间存在极显著的负相关关系（r= -0.916**）。任南琪等^[16]研究表明，发酵产氢一般是在酸性条件下进行的，在糖酵解途径中产生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氢离子（NADH+H⁺）通过NAD+/NADH的平衡调节产氢，形成氧化性NAD⁺。发酵微生物产氢代谢过程中，产酸类型与体系氧化还原电位（Eh）有关，王勇等^[17]研究表明，丁酸型发酵过程中Eh在-350~-420 mV之间，而乙醇型发酵过程中Eh在-180~-260 mV之间变化。通过调解体系pH值可以调节电势差，如氢气分压高达50 662.5 Pa时，pH小于4.7可使NADH+H⁺转化为氢，如果氢分压为10 132.5 Pa，pH值只要小于6.6即可。培养体系pH也会影响产氢过程的进行，李建昌等^[18]研究发现，在启动产氢时pH值不宜低于4.5，正常产氢时pH值应控制在4.5~5.5的范围。由此可以解释本试验中培养初期氢气分压低而当体系pH值降至最低时产氢速率达到最大的现象。同时，在培养20 d后体系pH值高于5.5时，体系氢气分压逐渐降低，一方面是由于pH对产氢过程的抑制，另一方面是由于Fe（Ⅲ）还原对氢气的消耗。

Lovley等^[19]研究发现，以葡萄糖为唯一碳源，添加Fe（OH）₃的厌氧体系中，微生物利用葡萄糖无氧呼吸的ΔG值（-76 kJ·e^-1）低于葡萄糖发酵反应的自由能（-57 kJ·e^-1）。这从热力学角度证实Fe（Ⅲ）的添加能够改变碳源的代谢途径，使微生物获得更多的能量支持生长。也有研究发现，虽然兼性Fe（Ⅲ）还原微生物从有机物代谢过程中仅可将少于5%的电子传递给Fe（Ⅲ），但可以累积大量的Fe（Ⅱ）^[20]。本试验培养体系中葡萄糖为唯一的电子供体，Fe（Ⅲ）还原及产氢过程所需的电子均来源于葡萄糖，理论上1 mol葡萄糖能提供24 mol电子，故用测得的Fe（Ⅱ）累积量与氢气累积量可计算出微生物Fe（Ⅲ）还原过程与产氢过程消耗的电子占体系葡萄糖所能提供总电子的比例（图 5）。Fe（Ⅲ）还原过程所利用的电子仅占体系葡萄糖所含电子的2.02%~9.69%，产氢过程占13.74%~19.45%，其中葡萄糖浓度为4 mmol·L^-1时产氢过程的电子消耗比例最高，达（19.45±2.39）%。这说明本试验中，体系碳源浓度为4 mmol·L^-1是体系最优产氢浓度，结合葡萄糖浓度为4 mmol·L^-1时已趋于100%的Fe（Ⅲ）还原率，可以确定在本试验中最适宜碳源浓度为4 mmol·L^-1。当葡萄糖浓度为0.5 mmol·L^-1时试验体系中几乎检测不到氢气分压，产氢量比0.25 mmol·L^-1的处理少，可能是在低浓度的葡萄糖条件下葡萄糖的代谢仅用作维持微生物自身生长，当浓度达到一定值时由于Fe（OH）₃的存在使得微生物代谢葡萄糖的途径发生了改变。王玉波^[21]的研究表明，从热力学角度上低底物浓度发酵产氢过程更有利于乙酸生成，然而计算实际葡萄糖代谢过程中电子等效体平衡，发现底物浓度过低时，体系被用于产能反应NAD+还原的电子等效体增多，产乙醇与丁酸增高，产乙酸产氢随之降低。微生物会根据环境条件自行调节其代谢途径以维持细胞正常代谢，不同的代谢途径对应着不同的液相末端产物及不同的氢产量。Lehours等^[22]研究发现，纯培养体系葡萄糖为50 mmol时，添加Fe（Ⅲ）能促进发酵型微生物BS2对葡萄糖的代谢，氢气的碳源利用率由未添加Fe（Ⅲ）的30%增至65%，Fe（Ⅲ）的添加对葡萄糖代谢过程中电子流的传递有重要影响。微生物发酵产氢过程是个复杂的生物过程，本试验条件下不同浓度葡萄糖代谢过程中电子流向问题及Fe（OH）₃存在的影响有待进一步研究和探讨。

图 5 不同浓度葡萄糖体系中菌株JX1-25产氢和铁还原过程消耗的电子占体系葡萄糖提供电子的比例 Figure 5 Electron consumption percentages of hydrogen production and Fe（Ⅲ） reduction during pure culture of strain JX1-25 with different concentrations of glucose

图选项

从水稻土中分离得到的菌株JX1-25可以高效利用葡萄糖作为电子供体进行发酵产氢和Fe（Ⅲ）还原，碳源浓度对菌株JX1-25产氢和Fe（Ⅲ）还原过程有重要影响。Fe（Ⅲ）还原潜势、Fe（Ⅲ）还原反应最大速率及体系氢气分压随着葡萄糖浓度的升高而增大，培养体系pH值随着葡萄糖浓度升高而降低。Fe（Ⅲ）还原过程消耗电子占体系葡萄糖能提供总电子的比例达2.02%~9.69%；产氢过程的电子消耗比例为13.74%~19.45%；葡萄糖浓度为4 mmol·L^-1时已能够很好地满足体系Fe（Ⅲ）还原过程的需求。CCA分析表明菌株JX1-25 Fe（Ⅲ）还原过程与产氢过程存在一定的相关性。