近年来，兽药抗生素作为抗细菌性疾病和促生长制剂，在集约化养殖中应用范围不断扩大，使用量逐年增加。据估计，我国每年抗生素原料生产量约21万t，其中有9.7万t（46.1%）的抗生素用于畜牧养殖业，而四环素类抗生素在我国兽药抗生素中生产和使用比例均为最大^{[1, 2]}。而当四环素类抗生素药物随饲料进入动物消化道后，只有少部分代谢反应生成无活性的产物，有30%~90%以原形通过粪便和尿液排出体外，对周围环境和人体健康造成潜在的危害^{[3, 4]}。四环素类抗生素是我国畜禽粪便中经常检出的抗生素类群，不同研究人员在北京、山东、上海、浙江、江苏、吉林、陕西、宁夏等全国不同地域的畜禽养殖场粪便中检出四环素类[四环素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）和金霉素（Chlortetracycline，CTC）]残留^{[5, 6, 7]}。目前研究结果表明，施用未处理粪便的土壤，土壤中抗性大肠菌群、抗性细菌和部分抗性基因的数量均有所升高，而对人和动物致病菌的抗性有可能通过细菌间基因横向转移而获得^{[8, 9, 10, 11]}。

好氧堆肥对粪便中四环素类抗生素残留有较好的去除作用，而且不同的堆肥工艺对四环素去除也有影响。温度、初始含水率、时间对猪粪中TC、OTC和CTC生物降解均有影响^[12]。翻堆+机械通风能够快速提高猪粪堆肥的堆体温度，同时也能够提高OTC、CTC等去除效果^[13]。添加微生物菌剂也能促进四环素类抗生素的降解，BM菌剂（一种芽孢杆菌生物复合制剂）的添加能够促进四环素类抗生素（TC、OTC、CTC）降解^[14]；添加纤维素降解菌能够提高鸡粪堆肥中CTC和OTC的降解效果^{[15, 16, 17]}。目前研究多考察实验室水平堆肥过程中粪便的四环素类抗生素残留降解，针对抗性细菌的研究较少。本研究通过四环素抗性细菌选择性计数方法，综合考察了实际堆肥生产情况下，添加菌剂对鸡粪堆肥过程中四环素类抗生素、致病菌及抗性细菌的影响。

堆肥实验于2013年10月至2014年12月在北京市怀柔区宝山有机肥厂进行。该厂以怀柔地区养鸡场的鸡粪为主要原料，并加入一定比例的羊粪或牛粪生产有机肥。本实验完全按照该厂的生产方式进行。将12 m3鸡粪和6 m3羊粪混匀后，平均分成两堆，体积为3 m×2 m×1.5 m。实验组（CA）接种自制菌剂（接种量为0.3%），对照组（CK）不接种菌剂。待堆温升至50 ℃后每隔1 d翻堆一次，进入二次腐熟期后停止翻堆。前25 d为一次堆肥期，第25~50 d为二次堆肥期，第50~110 d是储藏期。自制菌剂主要菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis），两种发酵液按1∶1（V∶V）混合后，用草炭土进行吸附。原料混合后的基本性质见表 1。

表 1 堆肥原料基本性质 Table 1 Physical and chemical properties of manures for composting

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在堆肥的第1、8、17、47（二次堆肥）、110 d（储藏期），分3点取样各500 g后在匀质袋中混合均匀，在24 h内检测其总菌数及抗性细菌数，按四分法取样100 g于-80 ℃保藏用于抗生素检测，剩余样品风干后检测其他各项指标。

采用便携式温度计测定堆体温度，每次选取堆体的不同位置和深度共5个点测定并取平均值。采用烘干法测定物料含水率。用蒸馏水按1∶10（W∶V）稀释堆肥样品，200 r·min^-1条件下，摇床振荡混匀1 h，然后8000 r·min^-1离心，取上清测定pH及电导率。有机质、总氮、磷、钾和总养分的检测方法参照有机肥料标准NY 525—2002。

抗生素测定方法：取经冷冻干燥后的堆肥样品0.5 g，经超声萃取提取抗生素，通过固相萃取进一步纯化样品，后经超高压液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS/MS）检测^[7]。色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（50×2.1 mm，1.7 μm），柱温40 ℃；样品室温度10 ℃；样品进样体积5 μL；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇（A∶B=90∶10），流速为0.35 mL·min^-1。质谱条件（表 2）：电喷雾电离离子源（ESI）；毛细管电压ESI+3.5 kV，ESI-3.0 kV；氮气流量700 L·h-1；雾化气温度400 ℃；离子源温度150 ℃；锥孔气流速30 L·h-1；碰撞气流速0.15 mL·min^-1；扫描模式为多反应监测扫描模式（Multi reaction monitor，MRM）。在1 g粪便样品中添加100 μg·kg^-1的混合标准溶液，每个添加样取4个平行，按上述方法，TC、OTC和CTC的加标回收率分别为（110.8±9.97）、（81.9±8.63）、（97.5±6.75）μg·kg^-1。

表 2 四环素类抗生素的质谱检测条件 Table 2 MRM parameters for antibiotics

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微生物计数方法：参照GB 20287—2006，取新鲜堆肥样品10 g加入100 mL无菌水中，在旋转式摇床上200 r·min^-1充分振荡30 min，静置20 min，用无菌移液器分别吸取5 mL上述母液，加入45 mL无菌水中，按1∶10进行系列稀释，每个样品取3个连续的适宜稀释度，吸取不同稀释度的悬液0.1 mL，加入对应选择培养基，并涂匀培养，每个梯度设两个重复。总菌数（Total Bacteria Counts，TBC）使用营养琼脂培养基28 ℃培养48 h，大肠菌群采用伊红美兰琼脂（EMB）37 ℃培养24 h，沙门氏菌采用硫酸铋琼脂37 ℃培养24 h，四环素抗性菌计数分别在对应培养基中添加终浓度为16 mg·L^-1的TC^[18]。

由于堆肥时间在秋冬季节，除起始5 d外，环境温度在10～15 ℃间小幅变动，堆肥前期由于降雨影响，使堆肥升温过程有反复，实验组在10 d内温度上升到60 ℃以上，并维持到第23 d，第25 d后进入二次堆肥期，第47 d后温度降低到50 ℃以下（图 1未显示）。在同样的基质及实验条件下，添加菌剂的实验组温度整体高于对照组（P<0.05），且其高温期温度也明显高于对照，说明0.3%的该型菌剂添加量能够促进堆肥升温及提高实际堆肥温度。

图 1 堆肥温度变化 Figure 1 Dynamics of manure temperature during composting

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堆肥过程中，物料理化性质的变化如表 3所示。肥料的含水率是考察堆肥腐熟程度的指标之一，本实验中堆肥含水率随着堆肥过程的延长而逐渐下降。由于实验组堆体的温度一直高于对照组，更有利于水份的蒸发，在整个高温期含水率都略低于对照组。另一方面，由于家禽的消化道短，饲料中大量的蛋白质会未经充分的消化而排出体外，鸡粪中蛋白质较牛粪和猪粪要高，以鸡粪为原料的堆肥过程会在蛋白质降解过程中释放氨，使堆体的pH升高。本实验中由于菌剂中含有蛋白降解功能的芽孢杆菌，使实验组的pH较对照组变化大（5.86～8.66）。细菌总数整体的变化趋势是随着温度的持续升高逐渐减小，至储藏期后有缓慢的回升。

表 3 堆肥物料性质 Table 3 Characteristics of composting materials

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堆肥起始阶段，原料中含有四环素和土霉素两种抗生素，均未检测到金霉素。随着堆肥温度的升高和时间的延长，两种抗生素均呈现不同程度的降解（图 2）。四环素的降解在实验组与对照组的区别不大，都在17 d后降解至检测限以下。土霉素在实验组的堆肥中降解效果明显，从起始的76 μg·kg^-1，经过47 d浓度降解至检测限以下（13.3 μg·kg^-1）。这与Osman Arikan等^[19] 在牛粪中添加稻草等辅料堆肥效果相类似，表明提高堆体温度有利于土霉素的降解。而土霉素在对照组堆肥中降解效果并不明显，至110 d仍保持在70 μg·kg^-1左右，与原料中的初始浓度无显著性差异（P>0.05）。这与张树清等^[14] 在鸡粪堆肥中添加BM菌剂（一种芽孢杆菌复合菌剂）的效果相似，该研究也证实四环素的降解率大于土霉素，且添加菌剂堆体的降解率也高于对照组，说明堆肥菌剂的添加有利于四环素和土霉素的降解。

图 2 堆肥中抗生素浓度变化 Figure 2 Extractable concentrations of TC and OTC during 110-day experiment

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经检测可知，堆肥原料鸡粪中含有沙门氏菌（Salmonella）和大肠菌群（coliform），而且两种病原菌中都含有一定比例的四环素抗性菌，原料鸡粪中沙门氏菌为5.4 lg CFU·g-1，抗四环素沙门氏菌为4.52 lg CFU·g-1，占总沙门氏菌的16.7%（图 3）。大肠菌群数量为6.5 lg CFU·g-1，抗四环素的大肠菌群数量为6.16 lg CFU·g-1，占总大肠菌群的45.46%（图 4），与Cortney Mille等^[20]检测美国有机肥中大肠菌群结果近似（1～6 lg CFU·g-1）。沙门氏菌无论在对照组还是实验组，在堆肥第8 d就检测不出，而大肠菌群能持续检出，直到二次堆肥末期（第47 d）。随着堆肥进程，两个堆体中四环素抗性的大肠菌群数量和相对比例均出现下降，说明堆肥高温既能杀灭大肠菌群，也能消除四环素抗性的大肠菌群。

图 3 堆肥中沙门氏菌变化 Figure 3 Dynamics of Salmonella population in two composting treatments

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图 4 堆肥中大肠菌群变化 Figure 4 Dynamics of coliform population in two composting treatments

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总菌数的变化如图 5所示。堆肥初期，菌数随着堆肥温度升高而迅速减少，此时由于实验组添加菌剂使堆温高于对照组，微生物减少速度也高于对照组，与荧光定量PCR计算的堆肥未培养细菌的绝对数量变化结果相类似^[21]。经过二次堆肥后（第47 d），实验组菌数减少，而对照组菌数明显增加，说明对照组中温微生物利用高温阶段未降解的有机物迅速繁殖。在四环素抗性细菌方面，实验组中四环素抗性细菌出现先下降再缓慢上升的趋势（图 6），而对照组四环素抗性细菌一直处于下降趋势，两者原料和成品肥料间的抗性细菌数量总体呈现下降趋势（图 7），分别相差1.41 lg CFU·g-1（实验组）和1.608 lg CFU·g-1（对照组），而抗性菌所占比例分别为4.00%（实验组）和1.17%（对照组），均高于原料的0.40%（实验组）和0.39%（对照组）。虽然升温有利于抗生素的消减，但含有四环素抗性细菌对高温具有更好的耐受性，从而导致实验组第19 d时四环素抗性菌的比例得到明显提高（1.3%至9.6%），而高温期过后，四环素抗性细菌竞争不过没有抗性质粒的细菌，所以虽然抗性细菌的数量得到回升，但所占比例大幅下降（4.0%）。四环素抗性细菌的这种先升高再降低的现象，与Selvam等^[21]研究堆肥中四环素抗性基因变化规律类似。以上结果说明，堆肥成品与初始原料相比，其中的四环素抗性细菌比例呈增长趋势，与废水处理中出水与进水的四环素抗性细菌比例变化情况相类似^[18]。

图 5 堆肥过程中细菌总数变化 Figure 5 Dynamics of total bacterial population in two composting treatments

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图 6 堆肥过程中四环素抗性细菌总数变化 Figure 6 Dynamics of total TC-resistant bacterial population in two composting treatments

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图 7 堆肥过程中四环素抗性细菌比例变化 Figure 7 Proportion of TC-resistant bacteria to total bacteria in two composting treatments

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畜禽养殖粪便堆肥化处理有利于消减养殖业对环境的抗生素污染，而四环素抗性基因在堆肥中变化规律有待进一步研究，并且因为有机肥最终由农田、果园等土壤所消纳，所以有必要进一步研究四环素抗性细菌及其抗性基因在种植过程中的迁移规律。

（1）菌剂的添加有利于堆肥升温，并且能够提高土霉素在堆肥中的降解效率。

（2）经过二次堆肥能够有效杀灭致病菌（沙门氏菌和大肠菌群），并且能够消减四环素抗性的致病菌。

（3）堆肥处理能够有效消减四环素抗性菌的绝对数量，添加菌剂可能导致后期抗性细菌数量的增长。

（4）堆肥过程中，抗性细菌比例呈现先增加后下降的趋势，堆肥成品中的四环素抗性菌比例高于原料。