螺旋藻（Spirulina）是一种光合自养型蓝藻，因其含有丰富的蛋白质、多种维生素、碳水化合物、藻多糖、不饱和脂肪酸和微量元素等物质^{[1, 2]},被联合国粮农组织誉为21世纪最优秀的食品^[3].螺旋藻作为一种高蛋白的绿色天然保健品，其品质近年来也成为国内外关注的热点之一。2012年国家食品药品监督管理局发现市场上某些品牌的螺旋藻保健品存在铅和砷超标的情况^[4].类似地，Richmond等^[5]报道了来源于墨西哥和乍得的两株螺旋藻，其砷含量分别为2.9 、1.8 mg·kg^-1,超过了巴西国家卫生监测机构（ANVISA）和目前世界最大的食用螺旋藻农场Earthrise Farms对螺旋藻中砷的最大限量1.0 mg·kg^{-1 [5, 6]}.

砷是普遍存在于土壤、矿物、水体和生物体内的类金属元素，其在地壳中的丰度在所有元素中排列第20位。由于其毒性被列为Ⅰ类致癌物^[7],长期接触砷污染会导致细胞凋亡，还能诱发肝癌、皮肤癌、肺癌等疾病^[8].在自然水体中，砷主要以砷酸盐[As（Ⅴ）]和亚砷酸盐[As（Ⅲ）]的形态存在^[9].随着我国经济社会的快速发展，矿山开采、金属冶炼、农药施用等工农业活动的不合理排放，造成了大量含砷化合物进入环境并随河流进入水体。近年来，砷大范围扩散到地表、地下水及饮用水中，已有报道表明，受污染的地下水中砷含量高达5000 μg·L^-1[10].如果养殖水体遭受砷污染，将对螺旋藻保健品的品质安全产生严重威胁。王志忠等^[11]研究发现鄂尔多斯碱湖钝顶螺旋藻粉中的砷主要来源于螺旋藻的养殖用水，且在养殖过程中随着养殖用水和原料的添加，藻体富集的砷越来越多。

在原核生物中，As（Ⅲ）通过水通道被吸收或细胞膜渗透进入细胞^[12],As（Ⅴ）的吸收则是通过磷酸盐通道进入细胞，然后被砷酸盐还原酶还原成As（Ⅲ）外排或储存在液泡中，As（Ⅲ）可在甲基转移酶的作用下转化成毒性较小的有机砷，从而达到砷解毒的作用^[13].磷作为螺旋藻的必需元素之一，与砷同族，化学性质相似，两者会竞争与细胞结合的同一位点，从而调控砷酸盐对细胞的毒性效应^[14].研究表明^{[15, 16]},胞外的磷浓度对微藻砷的富集有至关重要的作用，增加磷的浓度会抑制藻类对砷的吸收和积累。李宝洁^[15]发现，小球藻（Chlorella vulgaris）在1、10、30 μmol·L^-1砷处理下，细胞中总砷含量随着磷浓度的降低呈现增加趋势；Wang等^[16]研究表明，莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）在缺磷条件下细胞内积累的砷含量最高，在正常磷营养时积累最少。因此，随着螺旋藻培养时间的延长，培养基中的磷酸盐含量降低，可能会促进螺旋藻对砷的吸收，增加螺旋藻砷污染风险。

目前国内外对螺旋藻砷污染的研究主要集中在藻体、藻粉砷含量的检测，以及利用藻体去除水体中的砷等方面。王亚等^[17]、陈辉等^[18]和Morais等^[6]利用原子荧光光谱法、原子吸收光谱法等不同方法检测了螺旋藻中砷含量。此外，Doshi等^[19]利用螺旋藻活藻和死藻富集去除水体中的As（Ⅴ）,富集量分别高达525 mg·g^-1和402 mg·g^-1.但是，螺旋藻对砷的转化以及培养基中磷营养水平对螺旋藻砷代谢的影响仍鲜有报道。本试验以钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）为研究对象，通过设置不同As（Ⅴ）和磷浓度处理，测定螺旋藻吸附和吸收的砷，研究磷浓度对螺旋藻As（Ⅴ）积累和形态转化的影响，并分析磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）降低藻体砷富集的效果，以期为螺旋藻工业化生产中砷污染的控制提供理论依据和实践指导。 1 材料与方法 1.1 藻种及培养条件

钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库，本实验室保种、培养。采用Zarrouk培养基（pH9.0,121℃高压蒸汽灭菌30 min）^[20],培养温度（30±1）℃，光照强度为3500~4000 lx,光照明暗比12 h∶12 h,培养期间每天定时摇匀3次。 1.2 实验设计 1.2.1 不同浓度As（Ⅴ）处理下螺旋藻对砷的富集

将生长至对数期的螺旋藻接种于1 L锥形瓶中，接种初始OD_560nm约为0.2,之后取200 mL藻液于500 mL锥形瓶中，分别加入100、200、300、400、500、600 μL的100 mg·L^-1 As（Ⅴ）母液（以Na₃AsO₄·12H₂O配制）,藻液最终As（Ⅴ）浓度分别为50、100、150、200、250、300 μg·L^-1.每个处理设置6个平行，并以不加砷的藻液作为空白对照。处理7 d后用快速滤纸过滤收获藻体，在收获时3个平行直接用Beta 1-8 LD plus冷冻干燥机进行干燥，以测定其富集的总砷含量；另外3个平行用0.1 mol·L^-1 PBS（pH=7.0）清洗（每次5 mL冲洗3次）,去除藻细胞表面吸附的砷^[21],再经冷冻干燥后测定藻内吸收的砷含量及其形态，富集的总砷含量减去胞内吸收的砷即为螺旋藻表面吸附的砷含量。本研究预实验结果表明，PBS不会对藻细胞的完整性产生影响。 1.2.2 磷浓度对螺旋藻As（Ⅴ）吸附、吸收、转化的影响

螺旋藻生长至对数期，过滤收集藻体，用无磷培养液冲洗3遍，接种于无磷培养基中饥饿处理1 d,再接种于4种不同磷供应水平（预实验结果表明，本试验选用的4种磷浓度不会对螺旋藻生长产生影响）的培养基中：P_正、1/10 P_正、1/25 P_正、1/50 P_正（正常Zarrouk培养基中K₂HPO₄含量为0.5 g·L^-1,即88.9 mg P·L^-1）.适应2 d后从同一瓶藻液中分别取200 mL藻液于500 mL锥形瓶中，加入60 μL 1000 mg·L^-1 As（Ⅴ）母液，使不同磷浓度水平藻液的最终As（Ⅴ）浓度均为300 μg·L^-1,处理7 d后用快速滤纸过滤收获藻体，其余步骤同1.2.1. 1.3 生物量测定

螺旋藻经As（V）处理7 d后，用快速滤纸过滤收集藻体，并冷冻干燥24 h.滤纸和藻体的质量与过滤前滤纸的质量之差即为螺旋藻的生物量。同时将未过滤藻液的滤纸同批次冷冻干燥，避免滤纸水分造成的误差。 1.4 藻体总砷的测定

将冷冻干燥后的螺旋藻样磨碎，称量约0.05 g样品于25 mL玻璃消煮管中，加入2 mL 体积比为4∶1的HNO₃∶HClO₄混合酸，静置过夜^[17].采用Lab Tech ED54型智能样品消解仪（莱伯泰科有限公司）电热消解至溶液澄清透明，打开消煮管塞进行赶酸至消煮管内剩下0.2 mL左右液体时，取出消煮管静置冷却。用去离子水润洗移至10 mL容量瓶中，加0.5 mL浓盐酸（优级纯）和2 mL 5%硫脲+5%抗坏血酸混合溶液后定容。采用氢化物发生-双道原子荧光光度计（HG-AFS,北京吉天仪器有限公司）测定其总砷含量，以同批次藻样相同步骤加标消解进行加标回收，回收率为93.24%~107.27%. 1.5 砷形态提取及测定

准确称取0.05 g干样于10 mL离心管中，加入3 mL 0.28 mol·L^-1 HNO₃进行提取，90℃超声10 min后14 000×g离心10 min,重复提取3次^[22],上清液合并后定容至10 mL.定容后的样品用0.22 μm滤膜过滤，滤液过阴离子交换柱（Hamilton PRP-X100）,采用高效液相-氢化物发生-原子荧光（HPLC-HG-AFS,北京吉天仪器有限公司）测定螺旋藻中砷的形态。同时设置As（Ⅲ）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、As（V）的加标回收实验，砷形态提取率为94.73%~134.23%.检测条件^[17]:流动相为17.5 mmol·L^-1磷酸氢二铵（pH=6.1）,等度洗脱；进样体积100 μL;载流为5%盐酸；还原剂为1.5%硼氢化钾+0.5%氢氧化钾；屏蔽气为700 mL·min^-1;载气为Ar,600 mL·min^-1;光电倍增管电压为270 V;灯电流为100 mA. 1.6 数据处理

用Excel 2010和SPSS 20统计分析软件进行数据处理与分析，用SigmaPlot12.5 作图。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey检验进行差异显着性分析（P < 0.05）. 2 结果与分析 2.1 As（Ⅴ）对螺旋藻生物量的影响

由螺旋藻干重的结果可知（表 1）,200 mL藻液在无砷处理时生物量为237.2 mg,加入不同浓度As（Ⅴ）处理后，与对照相比螺旋藻的生物量均有所下降。但单因素方差分析结果表明，在本实验设置的As（Ⅴ）处理范围内，螺旋藻生物量之间的差异均不显着（P > 0.05）.由此说明培养基中As（Ⅴ）浓度在0~300 μg·L^-1时，螺旋藻的生长趋势未受到影响。

表 1 Cd胁迫下外源Spd、Spm、Put对玉米幼苗生长的影响 Table 1 Effects of external Spd,Spm and Put on maize growth under Cd stresses

表选项

螺旋藻在不同浓度As（Ⅴ）处理7 d后，藻体对砷的富集量随着As（Ⅴ）浓度的升高呈增加趋势（表 1）.与无砷处理的螺旋藻空白对照相比，50~300 μg·L^-1 As（Ⅴ）处理能显着提高螺旋藻对砷的富集（P < 0.05）.当As（Ⅴ）处理浓度为150 μg·L^-1时，螺旋藻富集的总砷含量为1.006 mg·kg^-1,且砷形态全部为As（Ⅴ）,超过我国GB 16740-1997保健（功能）食品砷的限量（1.0 mg·kg^-1）^[23].当培养基中As（Ⅴ）浓度为300 μg·L^-1时，藻体富集的总砷含量最高（1.569 mg·kg^-1）,砷形态也均为As（Ⅴ）.

从螺旋藻吸收的砷含量可以看出（表 1）,在50~100 μg·L^-1 As（Ⅴ）处理时，藻细胞几乎不吸收As（Ⅴ）;当As（Ⅴ）浓度增加到150 μg·L^-1时，藻细胞内检测到少量的砷，含量为0.009 mg·kg^-1;当As（Ⅴ）处理浓度达到300 μg·L^-1时，藻体吸收的砷含量显着增加至0.076 mg·kg^-1（P < 0.05）,经检测存在形态均为As（Ⅴ）.随着As（Ⅴ）处理水平的提高，螺旋藻细胞表面吸附的砷由0.235 mg·kg^-1显着增至1.493 mg·kg^-1,吸附的砷所占比例均在95%以上。该结果表明，在本研究条件下，螺旋藻对砷的富集可能以吸附为主，只有少量的砷被藻体吸收（< 4.84%）. 2.2.2 磷浓度对螺旋藻砷富集的影响

从图 1可知，在300 μg·L^-1 As（Ⅴ）处理条件下，随着培养基中磷浓度的降低，螺旋藻富集的砷含量逐渐增加。在正常磷条件下，螺旋藻富集的砷含量为1.766 mg·kg^-1;当磷浓度降低至1/25、1/50 P_正时，螺旋藻积累的总砷含量分别显着增加至2.624、2.822 mg·kg^-1,表明培养基中磷的浓度对螺旋藻砷富集有重要影响。这主要是由于在培养基磷浓度为1/25、1/50 P_正条件下，藻体吸收的砷含量增加所致（图 2）.螺旋藻胞内总砷含量随培养基中磷浓度的降低而增加，当磷浓度降低至1/10P_正时，藻体吸收的砷含量显着增加到0.433 mg·kg^-1,约为P_正条件下藻体吸收砷含量的2倍；当磷处理浓度为1/25、1/50 P_正时，胞内砷含量分别显着增加至1.369、1.457 mg·kg^-1（P < 0.05）.该结果表明，降低培养基磷浓度会促进藻体对砷的吸收。藻体表面吸附的砷含量随着培养基中磷浓度的增加整体呈增加趋势，但在三个低磷水平下（1/10、1/25、1/50 P_正）藻细胞表面吸附的砷之间差异不显着（P > 0.05）,在正常磷供应条件下吸附的砷含量显着增至1.684 mg·kg^-1（P < 0.05）.

图 1 不同磷浓度处理对螺旋藻砷富集的影响 Figure 1 Effect of different P treatments on arsenic enrichment in Spirulina

图选项

图 2 不同磷处理对螺旋藻砷吸附、吸收的影响 Figure 2 Effects of different P treatments on arsenic adsorption and absorption by Spirulina

图选项

在4种不同磷供应水平下，螺旋藻胞内砷形态均以As（Ⅴ）为主（图 3）,所占比例为56.12%~100%.在培养基磷浓度为P_正和1/10P_正时，藻细胞内只有As（Ⅴ）一种砷形态；当磷浓度降低为正常磷的1/25时，胞内As（Ⅲ）含量仅0.045 mg·kg^-1,且在培养基中未检测到As（Ⅲ）形态；然而当磷浓度降低至1/50 P_正时，螺旋藻吸收的砷增加，且部分转化成0.135 mg·kg^-1 As（Ⅲ）和0.544 mg·kg^-1 DMA,同时在培养液中检测到As（Ⅲ）的存在，含量为1.69 μg·L^-1.该实验结果表明，培养基中磷浓度的降低会促进螺旋藻对As（Ⅴ）的吸收、还原、甲基化和As（Ⅲ）的外排。

图 3 不同磷处理对螺旋藻胞内砷形态的影响 Figure 3 Content of arsenic species in Spirulina under different P treatments

图选项

水生生物在适应砷污染水体的过程中，形成了一定的砷代谢机制。As（Ⅴ）可以通过磷酸盐转运通道进入浮游植物细胞，被砷酸盐还原酶还原成As（Ⅲ）^[24],As（Ⅲ）与胞内的谷胱甘肽（GSH）或植物络合素（PC）螯合储存在液泡中，或者直接通过膜蛋白排出^[25],也可以甲基化形成毒性较小的非挥发性甲基砷化物再排出胞外^[15].磷和砷为同族元素，由于两者的化学性质相似，它们通过同一通道进入生物体内。因此，环境中的磷对藻类As（Ⅴ）的积累以及胞内砷形态的转化有着至关重要的作用。

本试验结果表明，不同浓度As（Ⅴ）对螺旋藻干重没有产生显着影响。王志忠等^[26]研究结果也发现，螺旋藻培养液中砷浓度在0~0.32 mg·L^-1,随着砷浓度的增加，螺旋藻的生长没有显着变化。这可能是因为磷和As（Ⅴ）均通过磷酸盐通道进入细胞，而培养基中磷酸盐浓度较高（88.9 mg·L^-1）,与As（Ⅴ）竞争同一通道，导致As（Ⅴ）较难进入藻体造成胁迫，绝大部分的砷都吸附在藻体表面。王静^[24]研究发现，在缺磷条件下，100 μg·L^-1和1、10 mg·L^-1As（Ⅴ）处理铜绿微囊藻20 d,未对其生长趋势产生影响，主要是由于胞内存在多磷酸体，多磷酸体是重金属结合位点，能富集多种重金属；20 d后胞内磷酸体消耗殆尽，释放磷酸盐的同时释放其结合的重金属离子，表现出As（V）的毒性。但在本研究中，螺旋藻体内是否也存在相似作用机理仍需要进一步探索。

螺旋藻细胞壁表面积较大，含有24%~74%的藻类多糖，能提供许多与金属离子结合的活性基团，如羧基、氨基、羟基、醛基、酰胺基等^{[27, 28]}.有研究表明，螺旋藻培养基中砷浓度越高（0~0.32 mg·L^-1）,藻粉砷含量越高^[26].Doshi等^[19]研究发现，螺旋藻富集的砷含量随As（Ⅴ）处理浓度的升高而增加，当As（Ⅴ）初始浓度从996 mg·L^-1升高到4510 mg·L^-1时，藻体富集的砷含量由176 mg·g^-1升至475 mg·g^-1.本试验结果显示，当培养基中As（Ⅴ）处理浓度从50 μg·L^-1增至300 μg·L^-1时，藻体富集的总砷含量增加了约6倍；且当培养基中As（Ⅴ）浓度为150 μg·L^-1时，藻体富集的砷含量已超过国家标准限量值。因此，在螺旋藻的生产养殖过程中，应及时监测水体中的砷浓度。

螺旋藻对As（Ⅴ）的吸收和累积与培养基中的磷酸盐密切相关^[29].有研究发现，增加磷浓度可以抑制小球藻对砷的吸收和积累^[15].而在本实验中，螺旋藻的Zarrouk培养基中磷浓度为88.9 mg·L^-1,导致螺旋藻在As（Ⅴ）浓度低于100 μg·L^-1时吸收砷较少。随着砷处理浓度提高，藻体吸收的砷随之增加，但含量均远低于国家标准，藻体仍将大部分的砷吸附在细胞表面。通过PBS洗脱可以去除藻体95%以上的砷，清洗效率是王志忠等^[11]利用蒸馏水清洗减少藻粉砷含量方法的2倍。此外，降低培养基中磷浓度有利于藻类对砷的吸收。Zhang等^[30]研究发现，集胞藻（Synechocystis）在低磷（5 μmol·L^-1）条件下培养6 d,藻细胞内总砷浓度迅速增至7.9 mmol·L^-1,约为正常磷（230 μmol·L^-1）营养时藻内砷浓度（0.7~0.9 mmol·L^-1）的10倍。铜绿微囊藻在10 mg·L^-1As（Ⅴ）处理下，在不含磷酸盐培养基中积累的砷含量达到最大值19.75 μg·g^-1,当磷酸盐含量为10 mg·L^-1时藻细胞对As（Ⅴ）的吸收量最小^[24].本研究中，在正常磷培养基中，螺旋藻吸收的总砷为0.202 mg·kg^-1;当磷浓度降低为1/25、1/50 P_正时，藻体吸收的砷分别显着增加到1.369、1.457 mg·kg^-1,证明了胞外磷浓度的降低会促进螺旋藻藻体吸收砷，且在1/25 P_正低磷供应水平下，螺旋藻胞内的砷全为无机砷。其含量已超过国家保健（功能）食品中砷的限量标准，该部分砷被藻细胞吸收进入体内较难去除。因此，在螺旋藻养殖生产的过程中，应当注意培养基中磷含量的监测，及时添加磷酸盐，防止培养液中磷浓度过低导致的螺旋藻砷含量超标。

研究表明低磷不仅能显着影响藻体对砷的吸收，还能影响其细胞内砷的代谢。当As（Ⅴ）处理浓度为50 μg·L^-1时，杜氏盐藻（Dunaliella tertiolecta）在3 mg·L^-1高磷条件下体内99.7%的砷为As（Ⅴ）,磷浓度降低到0.12 mg·L^-1后，促进体内As（Ⅴ）的还原，As（Ⅲ）比例升高至26%,未检测到体内As向DMA、MMA等其他砷形态的转化^[29].然而本研究的结果与前人报道有所不同：300 μg·L^-1 As（Ⅴ）处理螺旋藻7 d后，正常磷条件下螺旋藻胞内全为As（Ⅴ）;1/25 P_正条件下胞内仅3.28%的砷转化为As（Ⅲ）;而1/50 P_正条件下，细胞内9.24%的砷转化为As（Ⅲ）并外排到培养基中（1.69 μg·L^-1）,37.35%的砷转化为DMA储存在体内。Hellweger等^[31]提出，当环境中缺乏磷时，藻内砷代谢以甲基化为主。Qin等^[32]研究也表明，红藻Cyanidioshyzon sp. 5508在As（Ⅴ）吸收增加后，迅速还原成As（Ⅲ）,随后转化为三甲基砷化物（TMAO）和二甲基砷[DMAs（Ⅴ）].据此推测，培养基磷浓度的降低促进了螺旋藻细胞对As（Ⅴ）吸收、还原和外排，且当磷浓度降至1.778 mg·L^-1（1/50 P_正）时，胞内As（Ⅴ）的代谢主要是转化为毒性较弱的DMA,从而降低砷酸盐的毒性。 4 结论

在本试验As（Ⅴ）处理浓度范围内（0~300 μg·L^-1）,螺旋藻的生长几乎不受影响，生物量差异不显着（P > 0.05）.此外，正常磷条件下，螺旋藻富集的总砷含量随着As（Ⅴ）处理浓度的增加显着增加，且砷形态均为As（Ⅴ）.当培养基中As（Ⅴ）浓度为150 μg·L^-1处理7 d后，螺旋藻富集的总砷含量超过了国家标准限量值，在一定程度上造成了螺旋藻保健品的砷污染。

培养环境中磷浓度的降低有助于螺旋藻对砷的吸收、还原、甲基化和外排。正常磷营养条件下，通过PBS清洗可以明显降低螺旋藻胞外对砷的吸附，从而减少螺旋藻的砷污染。