近年来，研究者对单一污染物的环境行为及其生物效应进行了详细的研究，并取得了相应的研究成果。而事实上，在自然界中绝对意义的单一污染是不存在的，环境污染物往往以混合形式共同存在，单一污染物的研究虽具有一定的参考意义，但难以适用于环境中多元混合污染物的生态毒理效应的诊断和风险评价，因此混合物联合毒性效应的研究具有重要的理论意义和应用价值，从而越来越受到关注^[1].

腈、醛类化合物是环境中常见的污染物，它们是常见的化工生产原料和中间体，在环境介质中分布广泛。在染料废水中曾同时检测到腈类、醛类化合物的浓度分别为0.307 6、0.188 8 mg·L^-1[2].腈醛化合物多数具有过量毒性，属于反应型毒物，容易产生严重的环境危害^[3].如丙烯腈属于高毒性物质，具有潜在的三致毒性，对接触人群会造成严重威胁^{[4, 5]}.建筑装修材料等引起的居室甲醛污染近年来在国内外十分普遍，甲醛会刺激人呼吸道和眼部，并具有遗传毒性以及致癌作用，危害人类的健康^[6].

Chen等^{[7, 8, 9]}率先研究了部分腈醛二元混合物的联合毒性效应，发现这两类化合物会产生相加、拮抗等不同的联合毒性效应，并提出按单一化合物剂量-效应曲线斜率来定性预测联合毒性效应的方法。Lin等^[10]通过对腈醛二元等毒性比混合物对发光菌联合毒性的研究，初步探讨了腈醛混合物对发光菌的联合毒性作用机制，并利用腈化合物有效碳电荷（C^*）和醛化合物取代基常数（σ）为描述符，分别构建了不同腈醛二元等毒比联合毒性效应的QSAR模型。那么对于非等毒性比腈醛混合物联合毒性作用是否也可以同样构建QSAR模型来预测？

本文选取腈、醛化合物为研究对象，以明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）为模式生物，以15 min发光抑制为测定终点，测定了10种腈醛化合物的单一急性毒性和55组二元非等毒性比腈醛混合体系对发光菌的联合毒性效应，建立预测二元非等毒性比腈醛混合物联合毒性效应的QSAR模型，为环境介质中腈醛的联合生态风险评价和修复提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

腈类化合物和醛类化合物购自国药试剂和Sigma-Aldrich 化学制品有限公司（St.Louis,MO,USA）,化合物纯度均为分析纯以上。毒性测定采用二甲基亚砜（DMSO）为助溶剂，体系中DMSO的浓度不超过0.1%.明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）冻干粉（T3变种）购自中科院南京土壤研究所。

所用仪器和软件：BHP 9507化学发光免疫分析仪，精密电子天平，电子pH计，超净工作台，全自动新型生化培养箱，恒温培养振荡器，高压蒸汽灭菌器，超声波清洗器，恒温鼓风干燥箱，Gaussian 09软件以及IBM SPSS 18.0软件等。 1.2 实验方法 1.2.1 培养基的配制 1.2.1.1 液体培养基配制

分别取30.0 g氯化钠、5.0 g酵母浸膏、5.0 g胰蛋白胨、3.0 g甘油、1.0 g磷酸二氢钾以及5.0 g磷酸氢二钠溶于1000 mL纯水中，加热至溶液澄清透明。冷却后，用1 mol·L^-1 NaOH或HCl调pH至7.0左右，分装至三角瓶中，每瓶约5 mL,用橡皮塞封口，经121℃高压灭菌20 min,冷却后于4℃冰箱保存备用。 1.2.1.2 固体培养基配制

在上述液体培养基配方基础上加入15~20 g琼脂粉，电炉加热使培养基溶解至透明状，趁热分装于试管中（体积约为试管容积的1/3）,橡皮塞封口，经121℃高压蒸汽灭菌20 min,取出冷却制成斜面备用。 1.2.2 菌液配制

在固体斜面上转接培养复苏后的菌种，取出第三代斜面，用接种环挑取一接种环大小的菌种接入含5 mL液体培养基的锥形瓶中，20℃恒温振荡培养12~15 h至对数生长期。取处于对数生长期的菌液0.2 mL,加入到20 mL的3% NaCl溶液中，磁力搅拌40 min后用于毒性测试。 1.2.3 急性毒性测定方法

1.2.3.1 单一毒性测定方法

（1）取待测化合物用适量DMSO配制成浓度较高的标准溶液，实验时用3% NaCl溶液稀释，取0.8 mL加入待测比色管中。同时取0.8 mL的3% NaCl作为空白样。

（2）在上述样品中加入工作菌液0.2 mL.振荡摇匀、染毒暴露15 min,以1 mL 3% NaCl溶液作为对照，采用BHP 9507发光仪测定发光强度。以上样品每次做至少7个浓度梯度，每个浓度点至少3个平行测定样。

（3）测定后计算抑制率，以系列浓度的对数与发光抑制率为横、纵坐标，采用Probit模型进行回归，得到剂量-效应曲线。然后采用内插法计算出50%抑制时的效应浓度EC₅₀. 1.2.3.2 二元非等毒性比混合体系联合毒性测定方法

按照对数梯度设置一系列非等毒性比（如1∶1.8、1∶10、1∶32、1∶56等）,根据单一毒性测定得到EC₅₀,配制非等毒性比的二元混合溶液，按照对数梯度稀释样品，然后按照毒性测定方法测定系列样品混合溶液的急性毒性，以稀释度为横坐标，发光抑制率为纵坐标，应用Probit模型绘制剂量-效应曲线。然后计算出该二元非等毒性比混合体系产生50%抑制时的浓度。根据下列公式计算即可得到二元非等毒性比混合体系的联合毒性效应值TU_sum:

其中C_A和C_B 是计算所得混合物产生50%抑制时各组分在混合体系中的浓度，EC_50-A和EC_50-B 是单一化合物产生50%抑制时的浓度。根据Broderius的研究^[11],0.80≤TU_sum≤1.20时表示联合毒性效应为相加效应，TU_sum < 0.80时为协同效应，TU_sum > 1.20表示拮抗效应。 1.3 数据处理

利用Gaussian 09软件计算得到腈化合物的有效碳电荷；采用IBM SPSS 18.0软件进行数据分析和线性回归，相关系数r、标准误差SE、Fisher值（F）和显着水平P被用来评价拟合模型的质量^{[12, 13, 14]}. 2 结果与讨论 2.1 腈醛类化合物的单一急性毒性

在测定腈醛混合体系对明亮发光杆菌的联合毒性效应之前，首先以该发光菌为研究对象，测定了5种腈类化合物和5种醛类化合物对该发光菌的单一急性毒性，结果如表 1和表 2所示。腈类化合物在生物体酶的作用下水解成自由氰离子，而氰离子对生物体产生的毒性远大于腈化合物非水解状态下的基本毒性^[15].醛类化合物的单一毒性主要由于它可以作为亲电试剂在生物体中发生希夫碱反应，从而产生毒性^[16].根据单一化合物对生物体的毒性作用过程以及前期的研究^[17],利用与氰基相连的碳原子电荷C^*描述腈化合物的毒性，用取代基常数σ来描述醛化合物的毒性，分别建立腈、醛类化合物对发光菌的单一毒性QSAR模型方程如下：

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其中EC_50-A是腈类化合物的半最大效应浓度，C^*是腈化合物上与氰基相连的碳电荷；EC_50-B是醛类化合物半最大效应浓度，σ是醛化合物的Hammett取代基常数。从方程（1）和（2）的相关性系数来看，r²均在0.85以上，这表明C^*和σ都是与腈醛化合物毒性有关的描述符。

表 1 5种腈类化合物单一毒性测定结果 Table 1 Single toxicity of five cyanogenic chemicals

表选项

表 2 5种醛类化合物单一毒性测定结果 Table 2 Single toxicity of five aldehyde compounds

表选项

在单一毒性实验结果的基础上，测定了55组二元非等毒性比腈醛混合物对发光菌的联合毒性，结果如表 3所示，腈醛混合物对发光菌的急性联合毒性主要呈现两种效应：协同作用和相加作用。

表 3 非等毒性比组成的腈醛二元联合毒性 Table 3 Joint toxicity of binary mixture at non-equal toxicity ratios

表选项

研究者前期探究^{[10, 19]}提出腈醛混合物等毒性比时的联合毒性效应取决于其胞内化学反应。腈化合物进入细胞内部，在生物体酶催化作用下水解生成氰离子和其他水解产物，胞内氰离子与同时进入胞内的醛化合物结合发生反应，并生成碳负离子中间体。基于这个毒性机制，学者进而提出利用有效碳电荷（C^*）和取代基常数（σ）来描述二元等毒性比腈醛混合物中各组分对体系联合毒性的贡献^[20].

而在本实验中，对于非等毒性比的腈醛混合体系，其联合毒性效应不仅取决于组分的胞内化学反应，而且应与浓度（即毒性比）有关。因此我们同样利用有效碳电荷（C^*）和取代基常数（σ）分别描述各组分的化学反应贡献，同时再利用各组分的浓度C_A/∑C_i和C_B /∑C_i分别表示腈、醛化合物的表观浓度，建立QSAR预测模型如下：

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从方程（3）的相关系数来看，建立的模型具有显着相关性（r²=0.882）,这表明C^*、σ和C_i /∑C_i都是有效的描述符。由此可见，二元非等毒性比腈醛混合体系对发光菌的急性联合毒性不仅与有效原子电荷和取代基常数有关，而且与各组分的浓度也有密切的关系。 3 结论

（1）从腈类化合物对发光菌的单一毒性QSAR模型可发现，与氰基相连的碳原子电荷C^*的有效核电荷数越大，该化合物的毒性越大。腈类在生物体酶的作用下水解成自由氰离子，其毒性远大于腈化合物非水解状态下的毒性，说明可以利用与氰基相连的碳原子电荷C^*的有效核电荷数来预测腈化合物的毒性。

（2）从醛类化合物对发光菌的单一毒性QSAR模型来看，取代基常数σ越大，该化合物的毒性越大。醛化合物作为亲电试剂与生物体中半胱氨酸的氨基（ε-NH₂）发生席夫碱反应，引起生物机能改变而产生毒性作用，说明可以利用取代基常数σ来预测醛化合物的毒性。

（3）非等毒性比腈醛混合物的联合毒性不仅与各组分的反应性有关，也与各组分的浓度（即毒性比）有关，其联合毒性效应（TU或者EC_50mix）与化合物的比例之间呈现U型或者倒U型，而且存在顶点效应，即在毒性比（1∶1）附近呈现相加作用。

（4）以有效碳电荷和取代基常数为描述符构建的QSAR模型定量描述了丙二腈与不同芳香醛混合对明亮发光杆菌的联合毒性，从化合物相互作用的角度反映了腈、醛混合物对发光菌的联合毒性作用。