锑（Sb）是一种有毒致癌元素 ^{[1, 2]},同时也是一种具有长距离传输特点的全球性污染物^{[3, 4]}.随着现代工业的发展，锑的需求量急剧增加，释放到环境中的锑大部分在陆地生态系统中富集和传递，并通过食物链在人体内积累，最终影响蛋白质及糖的代谢，损害肝脏、心脏、呼吸和神经系统 ^[5].因此，锑污染已引起国际科学界的高度关注^[6].我国是世界上锑矿资源最为丰富的国家，世界锑年产量中约80%来自中国，采矿和冶炼活动、燃煤、及锑产品的广泛应用使我们国家面临着严重的锑污染威胁 ^{[7, 8]}.我国《重金属污染综合防治“十二五”规划》中把锑列为主要控制污染物之一。

锑并不是植物必需的营养元素，但植物均能稳定吸收溶解态的锑^[9].目前对于锑的环境行为特别是锑在土壤-植物系统中的迁移转化机制仍不明确，植物吸收和转运锑的机理仍停留在推断和假设阶段。目前的研究多集中于植物自身对锑的吸收方面，大量报道表明植物体似乎没有专门的吸收系统参与锑的吸收，锑的吸收可能利用了必需元素或者生物的分子吸收系统^[10].近年来，部分学者开始关注微生物对锑的地球化学行为的影响，初步的研究表明微生物在锑的生物地球化学循环过程中起到了重要的作用^{[11, 12]},但目前还没有发现哪种微生物能够与锑在土壤-植物系统中的迁移转化行为联系起来。

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）是一类能与绝大部分植物的根系形成互惠共生体的微生物 ^[13],它的菌丝具有直接联系土壤和植物根系的桥梁作用。AM真菌可以通过菌丝的直接参与或通过影响植物生理生态的间接效应两方面来影响植物对重金属的吸收及转运 ^[14].在重金属污染条件下，AM真菌能够帮助宿主植物减少对重金属的吸收来避免伤害，或是通过促进宿主植物提高对重金属的耐受性来适应重金属的胁迫^{[15, 16]}.通过分室培养技术发现，砷的富集植物蜈蚣草接种AM真菌后，植株叶和根中的砷含量显着增加 ^[17].AM真菌还可以通过影响宿主植物体内某些酶或激素的活性，进而提高植物对重金属的抗性^[18].AM真菌的这些生物学功能被认为在植物修复重金属污染土壤方面可以发挥重要作用。

锑和砷属于同族元素且具有相似的化学性质。Yu 等^[19]发现AM真菌会定殖在砷污染土壤上，而且能够通过缓解氧化胁迫来提高植物对砷的抗性。更重要的是，AM真菌有可能直接介导了植物对砷的吸收^[20].我们最近的调查显示锑矿区锑污染土壤上生长的大部分优势植物都形成了菌根^[21],Borovicka 等^[22]也在野外发现菌根植物能够富集大量的锑。因此我们推测AM真菌在植物吸收积累锑以及抗锑胁迫方面也可能具有重要作用。然而，目前还没有直接的报道和证据表明AM真菌在这方面所扮演的角色。本研究在前期发现的基础上，利用温室接种和非接种对比实验，从植物的生长、锑的吸收和抗氧化系统三方面来探讨AM真菌在植物吸收积累锑以及抗锑胁迫中可能发挥的作用。旨在从微生物的角度探讨植物对锑的吸收和转运，同时也可以为AM真菌-植物联合应用于锑污染土壤修复提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 培养基质

土壤采自北京市朝阳区中国环境科学研究院梨园内未受污染的表层土壤，土壤基本理化性质见表 1.土壤过2 mm筛，经120℃、2 h高压蒸汽灭菌处理，风干备用。土壤的基本理化性质测定参照《土壤农业化学分析方法》^[23]:pH采用电极法测定，采用5∶1的水土比振荡5 min,静置30 min,取上清液用pH计测定；有机质采用外加热重铬酸钾容量法测定；全氮利用浓硫酸及少量的混合催化剂在强热处理下将土壤中的含氮化合物分解，使氮素转变为铵离子，加入氢氧化钠使pH超过10时，铵离子转换为NH₃逸出，蒸馏并用硼酸吸收，然后用酸标准溶液滴定后计算出氮量；有效磷的测定，碳酸氢钠溶液（pH=8.5）提取土壤有效磷，碳酸氢根可和土壤溶液中的钙离子形成碳酸钙沉淀，钙离子活度的降低会使得某些活度较大的Ca-P被浸提出来，然后用钼锑抗比色法测定；速效钾通过1 mol·L^-1 NH₄OAc（pH=7）萃取后用原子吸收分光光度计测量。土壤中锑采用混合酸消解（HNO₃∶HClO₄∶HF=3∶1∶1）后用ICP-MS测定。

土壤中锑的添加浓度为0、500、1000 mg·kg^-1,以KSb（OH）₆配好浓度添加到土壤中。添加化学试剂搅拌均匀后，土壤湿度用去离子水调节到田间持水率。土壤装入塑料盆中放置在温室中平衡15 d,每隔3 d混匀一次。

表 1 土壤的基本理化性质 Table 1 The basic physical chemistry properties of the soil

表选项

紫花苜蓿种子购自北京正道种子公司。苜蓿种子以10%H₂O₂表面消毒，再用去离子水洗净后于温室下催芽过夜，备播种。当苜蓿幼苗长到2 cm高时，将其移到花盆中。 1.3 菌根接种剂

摩西柄囊霉Funneliformis mosseas（BGC BJ05A 和 BGC NM03D）和根内球囊霉Glomus versiforme（BGC GD01C）都购买自北京市农林科学研究院植物营养与资源研究所。三种接种剂均为含有寄主植物根段、相应菌根真菌孢子及根外菌丝体的根际土壤。 1.4 温室实验

实验设0、500、1000 mg·kg^-1 3 个施锑水平。各施锑水平下均设接种菌根真菌处理（三种丛枝菌根真菌混接）和不接种处理。实验重复3 次，共18 盆。所有实验土壤均施加N（NH₄NO₃） 300 mg·kg^-1、P（KH₂PO₄）50 mg·kg^-1 和K（K₂SO₄） 200 mg·kg^-1作为基础养分，保障植物的正常生长。

采用容积3 L左右的塑料花盆作为培养容器，每盆装土2.5 kg,接种剂量为30 g（每种菌剂各10 g）.先装入2.0 kg土，然后将接种剂层铺在表层，再装入余下土壤，接种剂距土表约2~3 cm.对于不接种处理，以等量经灭菌的培养菌种所用沙土代替接种剂装盆。装盆全部完成之后浇水，使土壤含水量达到15%（干重）待水分渗透均匀。每盆移入3株育好苗的紫花苜蓿。整个实验过程中浇水均为去离子水，称重法维持15%土壤含水量。

实验设置在中国环境科学研究院温室内，温室内温度控制在22~30℃，每天用补光灯保持光照时间在14 h.植物生长4个月后收获。 1.5 样品分析和测定

植物样品地上和地下部分分开收获，先用自来水，然后用去离子水清洗干净。称取叶片0.3 g用于抗氧化酶活性的测定，然后将其他样品置于烘箱中在70℃下经过48 h烘干，测定样品地上和地下部分的干物重（生物量）.烘干的植物样品用来测定磷和锑。植物地上部分测定全磷：硫酸-双氧水消煮-钒钼黄比色法^[23].植物中锑的测定，取0.1 g于6 mL HNO₃（65%,m/m）和H₂O₂（30%,m/m混合消解液（体积比5∶1）中，在电热板上150℃消解2 h,赶酸至1 mL,冷却后用质量分数为1%的HNO₃清洗并转移至25 mL的容量瓶中，定容后过0.45 μm的滤膜，ICP-MS测定重金属锑的浓度，测定的值都为3次重复后所取的平均值。植物的质控样品为GBW10048（GSB-26）芹菜，质控样品回收率都在（90±10）%.

参照 Grace等^[24]的方法，稍作修改。称取叶片 0.300 g,在液氮中研成粉末，加入 3 mL 提取缓冲液[0.1 mol·L^-1 K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH7.6）,1 mmol·L^-1 EDTA,0.3% Triton X-100,2% PVP]及少许石英砂于冰浴中研磨匀浆，18 000 g、4℃离心 15 min,取上清液并分装保存于-70℃超低温冰箱，用于抗氧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定利用氮蓝四唑（p-Nitro-Blue tetrazolium chloride,NBT）比色法^[25],稍作修改。3 mL反应体系：1.79 mL 50 mmol·L^-1 KH₂PO₄-K₂HPO₄（pH 7.6）缓冲液，0.3 mL 130 mmol·L^-1 甲硫氨酸（Met）、0.3 mL 750 μmol·L^-1 NBT、0.3 mL 100 μmol·L^-1 EDTA,0.3 mL 20 μmol·L^-1核黄素，对照管加入0.01 mL 50 mmol·L^-1 KH₂PO₄-K₂HPO₄（pH 7.6）缓冲液，样品管加入 0.01 mL酶液。对照管取两支，其中一支置于暗处，其余的试管置于 4000 lx 光照下20 min,反应结束后，以不照光的对照管为空白，分别测定其他各管在560 nm 下的吸光度值，SOD 活性单位以抑制 NBT光还原的50%为一个酶活力单位。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定参照 Knörzer 等^[26]的方法，稍作修改。利用 H₂O₂（ε= 39.4 mmol·L^-1·cm^-1）在 240 nm 的下降速率来测定 CAT 的活性。1 mL反应体系：10 mmol·L^-1 KH₂PO₄-K₂HPO₄（pH 7.6）缓冲液，10 mmol·L^-1 H₂O₂,粗酶提取液 20 μL.利用酶液启动反应，每隔5 s记录一次，测定1 min内240 nm下吸光度值的下降值。

过氧化物酶（POD）活性的测定参照 Maehly等^[27]的方法，稍作修改。愈创木酚在 POD的催化下氧化成茶褐色产物，此产物在 470 nm 处有最大光吸收（ε=26.6 mmol·L^-1 cm^-1）,利用络合物在 470 nm 增加的速率来测定 POD 的活性。1 mL 反应体系：50 mmol·L^-1 KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液（pH 7.6）,0.1 mmol·L^-1 EDTA,10 mmol·L^-1 愈创木酚，5 mmol·L^-1 H₂O₂,50 μL的粗酶提取液。用酶液启动反应，每隔 5 s 记录一次，测定1 min内470 nm下吸光度的增加值。 1.6 试验数据的处理与分析

所有试验数据用Microsoft（R） Excel 2000 （1985-1999 Microsoft Corporation）进行均值和标准差计算并作图。用统计分析软件SPSS（SPSS Inc.,Release 11.5.0）对试验数据进行二维方差分析，检验各处理平均值之间的差异显着性。 2 结果与讨论 2.1 接种AM真菌对苜蓿吸收锑的影响

不同接种处理下苜蓿地上部分和地下部分的锑浓度分别如图 1所示。由图分析，接种AM真菌显着提高了苜蓿地上和地下部分锑的含量（P < 0.05）.在锑添加浓度为500 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分锑浓度高71%、地下部分锑浓度高46%;在锑添加浓度为1000 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分锑浓度高37%、地下部分锑浓度高34%,这一结果说明接种AM真菌促进了苜蓿对锑的吸收和积累。

图 1 不同锑添加浓度下接种和未接种AM真菌苜蓿地上和地下部分锑的含量 Figure 1 Shoot and root Sb concentrations of Medicago sativa inoculated with/without AM fungi under different Sb addition levels

图选项

AM真菌广泛地分布在各种自然环境和土壤类型中，从矿山土壤到农田土壤都有AM真菌的存在^[13].我们在野外研究中发现锑矿区生长的植物体内锑含量和菌根侵染率呈显着正相关（P < 0.05）（未发表）.在本研究中，我们用温室接种对比实验来进一步研究AM真菌对植物吸收积累锑的影响。关键结果之一就是证明了AM真菌确实能够增加植物对锑的吸收和积累（图 1）,这说明AM真菌在锑的生物地球化学循环方面扮演着重要角色。AM真菌已被发现能够影响植物对很多重金属如As^[28]、Cd^[29]、Zn^[30]和Cu^[31]的吸收。据我们所知，这是关于微生物对锑在土壤-植物系统中迁移影响的首次报道。

有研究证实，AM真菌会通过改变根际理化环境来影响植物对重金属的吸收，AM真菌侵染植物根系后会引起植物根系的发育、根系分泌物的组分和数量等的变化，这些变化又会引起根际环境pH、Eh、含水量、有机组分、微生物群落结构和活性等的变化，从而影响重金属的形态、价态、移动性和生物有效性并最终影响植物的吸收^{[32, 33, 34]}.我们同期的研究结果也发现接种AM真菌会改变根际土壤中锑的化学赋存形态，增加了可交换态部分而减少了碳酸盐结合态（另刊发表）.而影响植物对锑吸收的主要因素是土壤中锑的有效态^[35].所以这应该是为什么接种后植物体富集了更多锑的重要原因之一。但是，我们也不能排除AM真菌会通过菌丝的直接作用参与植物对锑的吸收，因为有研究表明AM真菌菌丝可以直接吸收重金属并将其转运到植物体内^[36].因此，对于AM真菌促进植物吸收锑的具体影响机制还需要进一步的研究。 2.2 接种AM真菌对苜蓿生物量和磷的影响

不同处理下苜蓿地上和地下部分生物量如图 2所示。随着土壤中锑浓度增加，接种和未接种的苜蓿生物量都呈现出下降趋势。接种AM真菌对苜蓿地上部分的生物量没有显着影响，但是接种AM真菌显着增加了苜蓿地下部分的生物量（P < 0.05）.在锑添加浓度为500 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分生物量高17%、地下部分生物量高32%;在锑添加浓度为1000 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分生物量高17%、地下部分生物量高56%.

图 2 不同锑添加浓度下接种和未接种AM真菌苜蓿地上部和地下部干物重 Figure 2 Shoot and root dry weights of Medicago sativa inoculated with/without AM fungi under different Sb addition levels

图选项

苜蓿中磷的含量如图 3所示，在锑的胁迫下，接种AM真菌显着提高了苜蓿对磷元素的吸收（P < 0.05）,在锑添加浓度为500 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分的磷含量高29%;在锑添加浓度为1000 mg·kg^-1时，接种处理比未接种处理地上部分的磷含量高41%.

图 3 不同锑添加浓度下接种和未接种AM真菌苜蓿地上部分P含量 Figure 3 Shoot P concentrations of Medicago sativa inoculated with/without AM fungi under different Sb addition levels

图选项

已有研究表明在重金属胁迫条件下，接种AM真菌能够增强植物对营养元素和水分的吸收，增强叶片的光合作用，促进植物的生长，提高植物的生物量^[37].de Andrade等^[29]也证实重金属污染土壤中AM真菌能够改善宿主植物的营养状况从而使得宿主生物量提高。这与我们的实验结果相似。Zhang等^[38]研究发现，接种AM真菌能改善植物的磷营养状况，在促进植物生长的同时形成“稀释效应”,降低植物中重金属砷的浓度，减少重金属的毒性，以此来帮助植物适应重金属胁迫环境。

在锑胁迫下，接种AM真菌后，苜蓿地上部分中磷的含量增加，这说明AM真菌促进了苜蓿对磷的吸收。AM真菌的主要功能之一就是改善宿主植物的矿质营养状况，尤其是磷素营养。它能分泌有机酸活化难溶性磷，分泌磷酸酶水解土壤中的有机或无机磷酸盐，从而增强植物对难溶性磷的吸收^{[39, 40]}.这也可能说明接种AM真菌促进了植物对磷的吸收，从而促进苜蓿生物量的提高。

Zhang等^[38]利用温室接种实验发现接种AM真菌促进植物对磷的吸收的同时也降低了植物对砷的吸收。本研究发现AM真菌能够同时促进植物对磷和锑的吸收，这与Zhang的结果不同。磷、砷和锑为同一主族元素，研究发现砷（V）和磷在植物体内是同一运输通道，两者之间存在相互抑制和竞争关系^[41].但磷（PO₄^3-）的加入并未影响玉米和向日葵（Helianthus annuus）对锑[KSb（OH）₆]的吸收，这表明五价锑的吸收不像砷一样是通过磷酸吸收系统进行的^[42].这可能是AM真菌为什么能够同时促进植物对磷和锑吸收的原因。 2.3 接种AM真菌对苜蓿SOD、CAT、POD酶活性的影响

如图 4所示，随着锑浓度的增加，苜蓿中三种酶活性都呈现上升趋势。同时，在锑胁迫下，接种处理三种酶活性都比未接种处理的低。在锑添加浓度为500 mg·kg^-1,苜蓿接种和未接种处理的SOD和POD活性差异显着（P < 0.05）.在锑添加浓度为1000 mg·kg^-1时，苜蓿接种和未接种处理的SOD活性差异显着（P < 0.05）;在不同锑添加浓度下，苜蓿接种和未接种处理的CAT活性没有显着差异。

图 4 不同锑添加浓度下接种和未接种AM真菌苜蓿地上部分SOD、POD和CAT活性 Figure 4 Shoot SOD, POD and CAT activities of Medicago sativa inoculated with/without AM fungi under different Sb addition levels

图选项

在重金属胁迫条件下，进入植物细胞的金属离子能够通过氧化还原反应诱导植物体内产生活性氧化物质（ROS）如超氧阴离子自由基（O₂^-·）、过氧化氢（H₂O₂）、羟氧自由基（OH·）、单质氧（¹O₂）,进而导致细胞产生氧化损伤。Feng等^[43] 研究发现锑在植物体内也能够产生氧化胁迫，抗氧化酶POD和CAT活性的增加是植物对锑的重要解毒机制。

接种AM真菌后，苜蓿体内三种酶的活性比未接种处理要低，这与Yu等^[19]的研究结果一致。他们在蜈蚣草上接种了摩西球囊霉后，植物地上和地下部分的砷总量提高了，而砷酸还原酶（AR）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性却有所降低。他们还研究发现，接种AM真菌能够抑制植物体内砷 （Ⅴ）还原为砷（Ⅲ）,从而减少砷的毒害，并进一步减少了对产生POD和SOD酶的化学刺激效应。接种AM真菌后，苜蓿植株内可能也产生类似的反应，抑制了锑（Ⅴ）还原为锑（Ⅲ）,从而导致三种酶的活性比未接种处理要低。而研究证实在植物体内确实存在着锑（Ⅴ）向锑（Ⅲ）转化的现象^{[44, 45]}.Zhang等^[38]认为AM真菌甚至有可能会参与砷在植物体内的甲基化过程并减少对植物的毒害效应。但是，我们目前的研究还不能直接证明AM真菌也会参与锑在植物体内的形态转化，这也是我们下一步研究的重点内容。 3 结论

（1）温室盆栽试验表明，接种AM真菌促进了苜蓿地上和地下部分的锑含量，说明AM真菌能够促进苜蓿对锑的积累。这进一步证明AM真菌在锑的生物地球化学循环方面扮演着重要角色。

（2）接种AM真菌能改善锑胁迫下苜蓿的磷营养状况，促进植物对磷的吸收，提高植物地上和地下部分的生物量。

（3）接种AM真菌降低了苜蓿SOD、POD、CAT酶活性，可能是因为接种AM真菌降低了锑在苜蓿体内的毒害，从而减少了产生抗氧化酶的化学刺激效应，具体影响机理有待进一步研究。