近年来，人类各种工业活动导致大量重金属进入土壤，严重威胁了人类健康和生态平衡^[1].植物修复是修复土壤重金属污染中备受推崇的方法，而如何提高其修复效率成为了研究的重点。其中配合施肥等农艺措施在生产上意义重大^[2],并且发现氮肥能提高一般植物和富集植物修复镉（Cd）污染的效率^[3];另一方面，植物的抗逆性与活性氧（ROS）的清除紧密相关，过量的重金属会使ROS的产生与清除机制失去平衡，引发膜脂过氧化作用^[4],致使植物体受到伤害。而植物本身具有一个高效的抗氧化防御系统，在这个系统中抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环是清除植物体内ROS自由基的重要途径^[5].

龙葵（Solanum nigrum）是我国研究人员新发现的Cd超累积植物，其耐Cd机制的研究意义重大。目前对龙葵的研究主要集中在Cd富集特性、解毒机理及部分生理代谢机制方面。魏树和等^[6]发现龙葵是Cd超积累植物；王林等^[7]在此基础上通过研究龙葵地上部和地下部吸收积累Cd的变化探讨氮、钾肥提高龙葵修复 Cd 污染土壤的可行性；曾秀存等^[8]研究了两种基因型龙葵对Cd胁迫的生理响应，但最终研究表明两种龙葵均不是Cd超富集植物。研究认为，施N能增加Cd在土壤中的生物有效性^[9];NO₃^--N与NH₄⁺-N分别促进水稻根和地上部生长，且NH₄⁺-N促进水稻Cd吸收^[10];也有研究表明施加NO₃^--N会减少菜心（Brassica campestris）对Cd的吸收量^[11].由此可见，不同形态氮素对不同植物Cd的生物有效性的影响存在差异。目前，国内外对Cd胁迫下植物抗氧化系统的研究，多集中于研究抗氧化酶防御系统（SOD、POD、CAT）,对AsA-GSH 循环系统研究较少，尤其是对Cd胁迫下外源添加不同形态氮素的AsA-GSH循环的研究更少。因此，本研究以龙葵为材料，研究不同形态氮素（NO₃^--N[NaNO₃]、NH₄⁺-N[（NH₄）₂SO₄]和NH₄⁺-N+NO₃^--N [NH₄NO₃]）对龙葵的抗坏血酸-谷胱甘肽代谢循环和吸收Cd的影响，以期进一步揭示超富集植物龙葵的耐Cd机制。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试土壤

采用温室盆栽试验，于2013年5-10月在四川农业大学成都校区实验基地进行。供试土样取自四川农业大学成都校区实验基地未开垦的自然土壤（不含腐叶根）,采样深度为0~20 cm.将其自然风干、捣碎、剔除杂物，研磨，过5 mm筛，并用适量多菌灵消毒，堆积静置45 d后，按照每盆8 kg的标准装入带托盘塑料花盆中备用。花盆规格为下口径20 cm、上口径30 cm、深25 cm.测定种植土的基本理化性质为：pH 6.8,全氮0.73 g·kg^-1,全磷0.38 g·kg^-1,全钾3.76 g·kg^-1,有机碳32.92 g·kg^-1,总Cd 0.419 mg·kg^-1. 1.1.2 植物材料

供试龙葵通过向公司购买种子，自行培育而成。 1.2 试验设计

将装有种植土的塑料花盆置于大棚（透光率80%;温度为25±3℃；相对湿度为78%）内，用清水控制土壤含水量为田间持水量的60%.选取生长健壮且长势一致（植株长出4片真叶）的龙葵幼苗，除去原有土，剪除损伤的烂根、叶，操作时不损伤根系。再用清水小心冲洗，每盆栽植3株，种植深度1.5~2.0 cm.养护管理期间，每天观察植株生长情况，浇水时浇透，并将溢出的水倒回盆内，使土壤湿度基本一致。10 d后，植株恢复生长，将40 mg·kg^-1（由预试验得到的临界浓度）的Cd²⁺（CdCl₂·2.5H₂O）水溶液均匀浇灌在盆土中（渗出液反复回收浇灌，直到Cd²⁺与盆栽土壤均匀混合）,浓度以纯Cd计，单位为mg·kg^-1.Cd处理15 d后按表 1（三种不同形态N素的浓度梯度设为0、25、50、100、200、400 mg·kg^-1干土）向龙葵浇灌不同浓度、不同形态的外源氮素，CK用清水浇灌，每个处理3盆，重复3次。浇灌分3次进行，保证最终施加到土壤的N素含量均相同，通过计算可知：NO₃^--N[以NaNO₃为试验N素],加入该N肥的质量梯度为795、1590、3180、6360、12 720 mg;NH₄⁺-N [以（NH₄）₂SO₄为试验N素],加入该N肥的质量梯度为590、1180、2360、4720、9440 mg;NH₄⁺-N+NO₃^--N（以NH₄NO₃为试验N素）,加入该N肥的质量梯度为357、714、1428、2856、5712 mg.

表 1 试验设计 Table 1 Experimental design

表选项

处理30 d后，取植株中部成熟叶片，测定各项生理生化指标。称取鲜叶0.5 g剪碎，加0.05 mol·L^-1pH值7.8的PBS（内含1% PVP）5 mL及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，经15 000×g,4℃下离心15 min,上清液定容至10 mL,上清液为酶提取液，用于以下测定。 1.3.1 过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性

参照李合生等^[12]的方法。SOD采用NBT光氧化还原法，以抑制NBT光氧化还原50%的酶量为一个酶活性单位。 1.3.2 超氧阴离子产生速率和过氧化氢（H₂O₂）含量

分别参照王爱国等^[13]和Patterson等^[14]的方法，采用羟胺法测定超氧阴离子（O₂^-·）的产生速率，过氧化氢（H₂O₂）含量采用分光光度计法测定。 1.3.3 丙二醛（MDA）含量

采用Cakmak^[15]的方法，结合硫代巴比妥酸法测定。 1.3.4 还原型谷胱甘肽（GSH）和抗坏血酸（AsA）含量

参照Nagalakshmi等^[16]的方法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量，采用巯基试剂DTNB;抗坏血酸（AsA）含量的测定则采用分光光度计法^[17]. 1.3.5 谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性

参照Milosevic等^[18]的方法测定GR活性；采用抗坏血酸氧化法^[19]测定APX活性，具体过程有所改动。 1.3.6 Cd含量

龙葵根、茎、叶样品Cd 含量采用湿样消解法，用原子吸收分光光度计（上海精密科学仪器有限公司，AA320N型）测定龙葵地上和地下部分镉含量。 1.3.7 龙葵生物量

处理45 d后，采用破坏性收获法采集植株。用蒸馏水将收获的植株上附着的杂质洗净，将样品分为根、茎、叶三部分，准确称重；在105℃烘箱内杀青30 min,再在75℃下烘干至恒重，计算单株龙葵根、茎、叶及单株生物量。 1.4 数据分析

采用Excel 2010对试验数据进行初步计算，在SPSS 17.0上进行单因素方差分析、Duncan's多重比较分析，单因素方差检验（One-way ANOVA）和最小显着性差异法检验（LSD）,最后采用Excel 2010制表作图。显着性水平设定α=0.05. 2 结果与分析 2.1 不同形态氮素对龙葵生长的影响

由表 2可知，不同形态氮素对龙葵的地上部分生物量构成显着的差异，而对龙葵的地下部分生物量（干重）影响不大。外源添加不同浓度NO₃^--N的龙葵地上部分均显着高于CK,且地上部分干重随着NO₃^--N浓度的增加而逐渐增加，T5处理较CK增加了62.80%.NH₄⁺-N的影响与NO₃^--N相似，且NH₄⁺-N处理下龙葵地上部分干重增加最多。NH₄⁺-N+NO₃^--N处理下龙葵地上部干重虽与前二者变化趋势相同，但对地下部分干重影响极显着。从而得知，在三种氮素形态中，NH₄⁺-N的处理对地上部生物量（干重）的增加显着高于NO₃^--N或NH₄⁺-N+NO₃^--N.

表 2 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵地上部和地下部干重的影响 Table 2 Effects of different forms of exogenous nitrogen on shoot and root dry weights of Solanum nigrum under Cd stresses

表选项

从表 3可看出，外源施加NO₃^--N后，龙葵的地上部和地下部Cd积累含量受到显着影响，且地上部Cd含量明显高于地下部。施用NH₄⁺-N的各组处理中，龙葵的各部分Cd含量积累变化显着，呈现明显的正相关，T10浓度处理下的龙葵各部分Cd含量达到最大值。NH₄⁺-N+NO₃^--N对龙葵各部分积累Cd随浓度升高呈现先升后降趋势。综合比较三种不同形态氮素对龙葵积累Cd的影响可知，NH₄⁺-N更能促进龙葵积累Cd.

表 3 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵地上部和地下部Cd积累量的影响 Table 3 Effects of different forms of exogenous nitrogen on Cd content of Solanum Nigrum under Cd stresses

表选项

由图 1可知，在40 mg·kg^-1 Cd处理下生长的龙葵，外源添加不同形态氮素后，叶片的MDA含量显着下降。NO₃^--N和NH₄⁺-N处理下龙葵叶片MDA含量随着处理浓度的增加而降低，NH₄⁺-N+NO₃^--N处理下龙葵叶片MDA含量则随着处理浓度的增加呈现先降后升的趋势，但各浓度下的叶片MDA含量仍旧低于CK.比较三种氮素形态处理下的龙葵MDA含量可知，NO₃^--N处理下的龙葵叶片MDA含量下降幅度大于其他两种形态。

图 1 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵叶片丙二醛含量的影响 Figure 1 Effects of different forms of exogenous nitrogen on MDA content of Solanum nigrum leaves under Cd stresses

图选项

如图 2所示，40 mg·kg^-1Cd的土壤中生长的龙葵在外源施加不同形态氮素后，其叶片中超氧阴离子产生速率均减缓。NO₃^--N和NH₄⁺-N+NO₃^--N处理的超氧阴离子产生速率随着氮素处理浓度的升高呈现先减缓后增快的趋势，但产生速率仍比CK慢。NH₄⁺-N处理下叶片的超氧阴离子产生速率在T10处理有最小值，较CK降低了38.10%.由此可见，NH₄⁺-N对龙葵叶片超氧阴离子产生速率的影响最为显着。同样地，试验中外源施加不同形态氮素均对龙葵叶片H₂O₂含量产生显着影响，且NH₄⁺-N对龙葵叶片H₂O₂含量的影响最为显着。

图 2 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵叶片超氧阴离子产生速率（A）和过氧化氢含量（B）的影响 Figure 2 Effects of different forms of exogenous nitrogen on superoxide anion production rate（A） and H2O2 content（B） of Solanum nigrum leaves under Cd stresse

图选项

如图 3所示，NO₃^--N处理下的龙葵叶片的SOD活性随着处理浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，在T2处理达到最大值，CAT和POD活性则随着处理浓度的升高逐渐降低。龙葵叶片的SOD活性在NH₄⁺-N处理下则随着处理浓度的升高逐渐降低；NH₄⁺-N+NO₃^--N与之相同，但降低幅度比NH₄⁺-N小。而NH₄⁺-N处理下的CAT活性则随着处理浓度的升高先升后降，在T7处理活性最大；POD在该浓度活性最大，且各浓度下的活性均高于CK.NH₄⁺-N+NO₃^--N处理下的龙葵叶片的SOD和CAT活性随处理浓度的升高而降低，POD活性则先升高后降低。

图 3 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵叶片超氧化物歧化酶（A）、过氧化氢酶（B）、过氧化物酶（C）活性的影响 Figure 3 Effects of different forms of exogenous nitrogen on superoxide dismutase（SOD）（A）, catalase（CAT）（B） and peroxidase（POD）（C） activities of Solanum nigrum leaves under Cd stresses

图选项

如图 4所示，不同浓度的NH₄⁺-N处理下，其APX含量呈现逐步上升趋势，T10处理有最大值，较CK上升了34.24%.龙葵叶片的APX含量在不同浓度的NO₃^--N处理下呈现先上升后缓慢下降的趋势，但均大于CK.与其他两种形态相比，NH₄⁺-N+NO₃^--N的处理对龙葵叶片内APX含量的影响相对不明显，各浓度间变化微小。同时，施加外源氮素后，龙葵叶片的GR活性也有显着变化。T2处理活性最大，较CK增加了19.87%.GR活性在NH₄⁺-N的处理下差异显着，随着浓度的升高，活性逐渐下降。NH₄⁺-N+NO₃^--N对GR活性的影响也是显着的，且活性均小于CK.

图 4 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵叶片抗坏血酸过氧化物酶（A）和谷胱甘肽还原酶（B）活性的影响 Figure 4 Effects of different forms of exogenous nitrogen on ascorbate peroxidase（APX）（A） and glutathione reductase（GR）（B） activities of Solanum nigrum leaves under Cd stresses

图选项

由图 5可知，龙葵叶片的AsA含量在不同浓度NO₃^--N处理下呈现逐渐升高的趋势，且从图表走势可看出，浓度达到T4后，AsA含量的增长走势渐缓，逐步趋于稳定。不同浓度NH₄⁺-N处理后，AsA含量呈现逐步上升的趋势。相对来说，NH₄⁺-N+NO₃^--N的处理对龙葵苗中AsA含量的影响不明显。同时，NO₃^--N处理的龙葵GSH含量随着处理浓度的增加先上升后下降，在T2处理含量最高。龙葵在NH₄⁺-N处理下的GSH含量随着氮处理浓度的升高而逐渐下降至最后趋于稳定；NH₄⁺-N+NO₃^--N的处理则对龙葵叶片的GSH含量影响并不显着。

图 5 Cd胁迫下不同形态氮素对龙葵叶片抗坏血酸（A）和谷胱甘肽含量（B）的影响 Figure 5 Effects of different forms of exogenous nitrogen on ascorbic acid（AsA）（A） and glutathione（GSH）（B） content of Solanum nigrum leaves under Cd stresses

图选项

重金属胁迫会导致植物缺乏氮素，增施氮肥能够缓解重金属的毒害作用。本试验中，不同的氮素水平下，龙葵地上部及地下部的生物量都有显着提高，可能是较低浓度的Cd胁迫刺激了根细胞壁增强交换位点蛋白活性^[20],在根系对Cd²⁺进行交换排除作用的同时也加强根系对水分和营养物质的吸收。张敬锁等^[10]对水稻的研究结果与本试验一致，NH₄⁺-N对龙葵地上部生物量增产最显着，对地下部不明显。这可能是由于龙葵对NH₄⁺具有较高的吸收运输能力，足以满足地上部的增长对氮素的需求。有研究表明，土壤中Cd的不同形态及土壤本身理化性质的不同都可能在一定程度上影响植物对Cd²⁺的吸收和运输。施加外源氮素后，龙葵的地上部和地下部Cd积累量均有所增加，表明外源氮素缓解了Cd胁迫。而地上部的积累量大于地下部，可能是因为龙葵是Cd超富集植物，对Cd的转运能力强，而添加外源氮素强化了它对Cd的转运能力。NH₄⁺-N对地上部Cd积累增加作用显着，与李继光等^[21]研究的超积累植物东南景天的结果一致。可能是因为NH₄⁺-N肥料水解后经过硝化作用，会降低土壤pH^[22],土壤pH值的降低显着影响了Cd的有效形态，从而显着增加了龙葵地上部的Cd积累量。这可能是NH₄⁺-N效果优于其他两种形态氮素的重要原因。而NH₄⁺、NO₃^-本身理化性质相反，同时存在可能影响了龙葵对氮素的正常吸收，因此可能需要根系生物量的增加来摄取足够的氮素营养以满足地上部的增长。 3.2 不同形态氮素对Cd胁迫下龙葵清除自由基的促进作用

为了减缓和抵御伤害，植物会调动抗氧化酶类（SOD、CAT、GR等）和抗氧化物质（GSH、AsA等）来清除活性氧和自由基，同时氮素的增加会影响植物本身抗氧化代谢的调节。龙葵叶片的H₂O₂含量和超氧自由基产生速率较无外源添加氮素均有下降，则说明对重金属的毒害有缓解效果。

MDA是膜脂过氧化的最终产物，常被作为植物细胞ROS累积水平和受损程度的重要指标。三种形态氮素影响下均表现了MDA含量不同程度的降低，表明外源添加氮素对Cd毒害起到了缓解作用。试验结果表明NO₃^--N对于缓解Cd胁迫产生的ROS发挥了作用，而在较低浓度NO₃^--N条件下，SOD是发挥作用的主导物质。这可能是因为SOD是对抗ROS的第一道防线，一定范围内的ROS积累会刺激产生更多的SOD^[23].POD与CAT在NH₄⁺-N较低浓度下催化缓解ROS过程中发挥主导作用，当NH₄⁺-N浓度较高时，则仅仅POD在清除ROS中发挥作用。依此类推，较低浓度的NH₄⁺-N+NO₃^--N环境下，POD在清除ROS中发挥主导作用。这可能是由于N素对含铁酶类（CAT、APX等）有很高的亲和性，能够诱导同工酶CAT1和CAT2 的表达或调节CAT 与细胞色素 C 氧化酶（COX）等含血红素铁酶类活性。 3.3 不同形态氮素对Cd胁迫下龙葵抗坏血酸-谷胱甘肽代谢循环的促进作用

抗坏血酸和谷胱甘肽作为植物体内重要的非酶抗氧化剂，可以直接作用和清除活性氧。植物应答活性氧积累等生物胁迫时，GSH库增大^[24].本试验说明在施加低浓度的外源NO₃^--N时，龙葵可以通过调节GSH来维持细胞体内的氧化还原平衡，减缓了Cd的毒害作用，而高浓度的NO₃^--N则降低了GSH含量，增加了氧化胁迫程度。因龙葵对NH₄⁺和NO₃^-的吸收机制不同，缓解Cd胁迫的能力不同，应对氧化胁迫的方式不同，所以可能会导致对龙葵中的GSH含量的影响存在差异。

AsA能够直接清除H₂O₂等多种ROS自由基，也可以通过 AsA-GSH循环间接清除H₂O₂等。施加外源不同形态的氮肥，龙葵中AsA含量均较CK有所增加，清除活性氧的能力加强，缓解了Cd的毒害效应。APX是植物体内重要的抗氧化物酶，它的活性决定了植物AsA-GSH循环抗逆境生理的作用。本研究表明，外源施加氮肥提高了龙葵的APX活性，与丁继军等^[25]的研究结果一致，外源添加物能提高重金属胁迫下的APX活性，有利于AsA的合成，提高清除ROS自由基的能力，缓解Cd胁迫。

在氧化胁迫条件下，GSH通过还原H₂O₂来缓解氧化胁迫，同时GSH被氧化成GSSG,而GSSG又可以在GR的作用下还原为GSH.由此可知，在重金属胁迫下，谷胱甘肽还原酶（GR）对活性氧的清除起关键作用^[26].催化还原为AsA的过程要消耗NADPH,而NADPH浓度的降低可能影响GR活性，这可能是引起本试验结果的原因。有研究表明在一定程度上施用NH₄⁺-N能促进植物对Cd的吸收，Cd吸收的增加引起了氧化胁迫消耗GSH,GR要将GSSG还原为GSH,故活性会加强。但由于施用（NH₄）₂SO₄会降低土壤 pH 值，表现出酸化土壤的作用，随着pH值的降低，植物吸收Cd的量会减少，引起的氧化胁迫会减弱，降低GR的活性，故本试验的结果是高浓度的NH₄⁺-N处理降低了龙葵叶片的GR活性。同时，GSH在清除ROS时本身被氧化成GSSG,而GR活性降低，所以不能及时将GSSG还原，导致GSH含量下降。 4 结论

（1）外源添加不同形态氮素均能显着提高龙葵幼苗地上部（茎秆、叶片和果实）生物量（干重）,且NH₄⁺-N处理对地上部生物量的增产效果明显好于NO₃^--N和NH₄⁺-N+NO₃^--N.

（2）与40 mg·kg^-1 Cd胁迫（CK）相比，幼苗叶片的超氧阴离子产生速率、过氧化氢（H₂O₂）与丙二醛（MDA）含量在不同形态氮素处理下均呈不同程度的显着降低，表明不同形态氮素对幼苗的Cd毒害有所缓解。

（3）外源添加不同形态氮素在一定程度上能提高抗氧化酶活性，增加抗氧化剂含量，缓解Cd对其产生的氧化胁迫，改善生长状况。不同形态氮素对龙葵Cd积累的促进顺序为：NH₄⁺-N>NO₃^--N.