人工纳米材料由于具有独特的物理、化学性质而得到广泛应用，但其对人体健康及环境的潜在影响也引起科学界和政府部门的高度关注^[1].研究发现，不同粒径的重金属颗粒的生物有效性和毒性有显着区别^[2].与微米级颗粒相比，纳米颗粒具有粒径小、比表面积大、生物活性强等特性，其环境行为、归趋、生物毒性、生态风险，以及受其污染的环境修复工作越来越受到重视^[3].CuO纳米颗粒（CuO NPs）主要用于抗菌性涂料、塑料制品、纺织品和食品的包装^[4]，相对于其他纳米材料具有更强的毒性^[5].纳米颗粒进入环境后会与空气、水和土壤相互作用，导致颗粒的表面性质以及粒子的形态发生变化^[6].最新研究表明，在培养基中的氨基酸等有机物的作用下，CuO NPs的淋滤量会显着增加，其淋滤的铜离子量高达60%~75%，离子态的铜更容易被植物吸收，因而毒性显着增强^[2]。

土壤微生物是土壤中的活性胶体，比表面积大、带电荷、代谢活动旺盛，它们本身及其产生的各种物质广泛参与水体、土壤、沉积物等环境介质中的物理、化学和生物化学反应，进而影响多种元素的迁移、转化^[7].微生物也被证明能够影响重金属形态，进而改变其生物有效性^[8].海州香薷根际的耐铜细菌可以增加铜的生物有效性，并显着提高植物对铜的累积水平，有助于缩短修复周期^[9].另有研究表明，丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能够将湿地植物芦苇（Phragmites australis）和鸢尾（Iris pseudoacorus）根际土壤中的铜转化为金属纳米颗粒^[10]，从而降低其对植物的毒害；相反，AMF会使玉米根际土壤中交换态铜的比例从26%升高到43%^[11]，提高白三叶（Trifolium repens Linn.）和黑麦草（Lolium perenne L.）根际土壤中水溶态砷的浓度^[12].微生物对重金属形态、有效性的影响决定于微生物和重金属本身的特征，并与两者所处的环境有关。受到环境介质中土壤胶体等多种物质的复杂影响，CuO NPs的淋滤量和淋滤比率要比在培养基中低很多，因此生物有效性差^[13]，难以被植物吸收。如能通过微生物促进其淋滤，将显着提高植物的富集和修复效率。

本研究通过PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）和测序等方法，分析了铜矿废弃地上的先锋植物茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）的根际细菌群落，通过选择性培养基对耐铜细菌进行了筛选和驯化，开展了CuO NPs淋滤试验，探讨了影响微生物淋滤的环境因子，从而为提高植物-微生物联合修复CuO NPs污染土壤提供理论依据。

采样地点位于安徽省芜湖市南陵县大工山-凤凰山古铜矿区（30°55′51″N，118°09′23″E），距铜陵市（30°45′12″~31°07′56″N，117°42′00″~118°10′06″E）35 km.该地属亚热带季风气候，年均气温15.8 ℃，年均降水量1400 mm，年均蒸发量1377 mm，平均日照长度为1935 h，无霜期237~258 d.废弃地土壤属砂质壤土，水土流失现象严重，由于废弃时间超过50 a，经过长期自然演替表土层有机质较高。植被主要包括海州香薷（Elsholtzia splendens Nakai）、茵陈蒿、鸭跖草（Commelina communis L.）、酸模（Rumex acetosa）和头花蓼（Polygonum capitatu）等草本植物，覆盖率约为40%。

茵陈蒿是一种铜耐性植物，根部铜积累量可达533 mg·kg^-1[14].本研究取样时间为2014年3月，以3个面积约为20 m²的废弃地作为取样点，各样点之间相距100~120 m.每个取样点随机选取4个1 m×1 m 的样方。将样方内的茵陈蒿整株取出，采用抖根法收集根际土壤，同一样方内的土样混合均匀，作为一个混合样（约200 g）.所有土壤样品立即带回实验室，部分新鲜土壤用于提取细菌总DNA，其余土壤自然风干后待用。

CuO NPs（CAS 1317-38-0）购自Sigma-Aldrich公司，分子量79.55，粒径范围25~60 nm，平均粒径48 nm，颗粒近球形，比表面积29 m²·g^-1.作为参照的微米级CuO购自生工生物工程（上海）有限公司。两种CuO颗粒进行扫描电镜表征，结果见图 1。

图 1 CuO颗粒扫描电镜图 Figure 1 Scanning electron microscope（SEM） images of CuO particles

图选项

土壤 pH 值采用1 mol·L^-1的KCl制成水、土混合液（土∶溶液，1∶2.5），pH计测定。有机质采用K₂Cr₂O₇-H₂SO₄稀释热法测定^[15].土壤总磷和有效磷浓度分别采用H₂SO₄-HClO₄消解和HCl-H₂SO₄浸提，钼铵蓝比色法测定^[16].土壤Cu、Zn总量采用HF-HClO₄-HNO₃消解，有效态Cu、Zn通过0.1 mol·L^-1的HCl浸提^[15]，火焰原子吸收分光光度计进行测定（AA-6650，岛津，日本）。

通过PCR-DGGE对细菌群落进行分析。采用DNA提取试剂盒PowerSoil^TM DNA Isolation Kit（MOBIO Laboratories,CA,USA）提取细菌总DNA.通过巢式PCR对细菌16S rDNA V3区进行扩增。PCR扩增均采用30 μL的反应体系，包括：3 μL 10 × PCR buffer，2.4 μL dNTP（2.5 mmol·L^-1）,2 μL MgCl₂（25 mmol·L^-1）,引物各1 μL（10 pmol）,1U Taq聚合酶，1 μL模板，0.5 μL BSA（牛血清蛋白）和18.1 μL ddH₂O.第一轮扩增采用细菌通用引物27F和1492R^[17],扩增条件为：94 ℃ 5 min,94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30个循环，最后72 ℃延伸10 min.产物大小约为1500 bp,扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验（80 V,60 min）.将第一轮扩增产物稀释10倍作为第二轮扩增的模板，引物为341F（5′端带有GC夹）和534R^[18].第二轮扩增采用降温程序：94℃ 10 min,94 ℃ 1 min,65 ℃ 1 min（退火温度每轮降低1℃，直到降至56 ℃）,72 ℃ 1 min,共10个循环。后20个循环程序为：94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,最后72 ℃延伸10 min.扩增产物大小约为200 bp,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检验（80 V,60 min）。

巢氏PCR产物采用BioRad公司的Dcode^TM基因突变检测系统（BioRad Lab,LA,USA）进行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝胶（37.5∶1）的浓度为8%,变性梯度为35%~50%,电缓冲溶液为1×TAE.预热温度达到60 ℃时将10 μL PCR产物和2 μL 6 × loading buffer加入胶孔，200 V电泳5 min,后将电压降至120 V电泳7 h.电泳结束后，小心将胶取下，用AgNO₃进行染色，拍照。

通过DNA凝胶回收试剂盒（Axygen Biosciences,China）对优势条带进行切胶回收，采用无发夹结构的341F和534R重新进行扩增。扩增产物用试剂盒（Axygen Biosciences,China）进行纯化。纯化后的产物以pMD18-T作为载体（Takara,大连）克隆到大肠杆菌JM109中表达。阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序。

取10 g茵陈蒿根际土壤加入90 mL无菌水制成土壤悬液，180 r·min^-1振荡30 min,依次稀释成10^-1~10^-6六个梯度。取0.1 mL稀释度为10^-2、10^-3、10^-4的土壤悬浮液分别涂布于含有500 mg·L^-1 CuSO₄的选择性培养基（K₂HPO₄ 0.3 g,KH₂PO₄ 0.2 g,MgSO₄·7H₂O 0.2 g,酵母提取物5.0 g·L^-1,NaCl 10 g·L^-1,琼脂2%,pH7.2）,每个浓度3次重复，在37 ℃培养24 h.选择最佳的稀释度，用灭菌的去离子水将所有细菌菌落转移至水相，并配制成含有200、400、600、800 mg·L^-1 CuO NPs的LB液体培养基，37 ℃、280 r·min^-1培养6 h.取10 mL培养液通过0.22 μm的微孔滤膜进行过滤，去除细菌和CuO NPs颗粒，淋滤液中铜离子浓度通过原子吸收分光光度法测定。从三个样点中选择淋滤能力最强的细菌群落，对该群落中的细菌通过平板划线分离法逐步纯化，并接种于斜面培养基，37 ℃培养24 h直至出现菌落，放入4 ℃冰箱中保存。纯化的细菌进行革兰氏染色^[19]。

将纯化后的耐铜细菌接入50 mL的液体LB培养基，37 ℃振荡培养12 h进行活化。将1 mL活化后的菌液接入50 mL含有100 mg·L^-1 CuO NPs的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养24 h.随后，按同样的方法将菌液依次接入含有200 mg·L^-1和400 mg·L^-1 CuO NPs的液体LB培养基中进行梯度驯化。在对照和含200 mg·L^-1 CuO NPs的液体LB培养基中检验驯化效果。随后，将驯化的菌株接种于斜面培养基，放入4 ℃冰箱中保存。

将驯化后的耐铜菌株接入50 mL液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h进行活化。利用超声分散法将CuO NPs配成100、200、400 mg·L^-1的水悬液，并作为水相配制LB液体培养基。将1 mL活化后的菌液接入含有CuO NPs的液体LB培养基中，37 ℃、280 r·min^-1培养6 h.取10 mL培养液通过0.22 μm的微孔滤膜进行过滤，去除细菌和CuO NPs颗粒，淋滤液中Cu²⁺浓度通过原子吸收分光光度法测定。

将驯化后的耐铜菌株接入50 mL的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h进行活化。利用超声分散法将CuO NPs颗粒配成100、200、400 mg·L^-1的水悬液，并作为水相制成LB液体培养基。随后，按照2%的接种量分别接入含有CuO NPs颗粒的液体LB培养基中，37 ℃、280 r·min^-1培养6 h.取10 mL培养液5000 r·min^-1离心5 min,沉淀和上清液一起放入超声波细胞破碎仪中（功率200 W,1/2探头，超声30 s,间歇30 s）进行超声破碎，通过0.22 μm的微孔滤膜进行过滤，淋滤液中Cu²⁺浓度通过原子吸收法测定。

使用SPSS 20.0对数据进行统计分析（SPSS,Inc.,Chicago,IL）,先进行正态分布和方差齐性检验（Normal distribution and homogeneity of variance test）,然后进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。不同处理的均值在5%的显着性水平下进行LSD（Least significant difference）多重比较。细菌群落的多样性、均匀度按下列公式计算：

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式中：H为香农-威纳多样性指数；Pi是某一泳道中第i个条带的亮度占该泳道中条带总亮度的比值；S为条带数（即丰富度）;EH为均匀度。

试验土壤呈酸性（表 1）,不同样点的酸度有显着差异（P＜0.05）,S1样点的pH最高。但S1的有机质、总磷、有效磷均显着低于其他两个样点（P＜0.05）。所有取样点均受到铜、锌两种重金属的复合污染，S1和S2的污染水平相近，但均显着低于S3（P＜0.05）。

表 1 土壤理化性质 Table 1 Soil physiochemical properties

表选项

三个取样点细菌群落的DGGE电泳结果见图 2.细菌群落的多样性指数分别为1.32、1.80和1.79，多样性水平均较低^[20].丰富度为4、8和8,均匀度为0.96、0.85和0.86。对3个群落中亮度较高的7条优势条带进行回收测序（长度160~194 bp），将测序结果与Genbank中的数据进行Blast比对，并利用核糖体数据库（The Ribosomal Database Project,RDP）中的Classifier模块判断序列所属的物种类别（置信度阈值设为80%），结果列于表 2。结果表明，耐铜细菌分别与寡养单胞菌属、气球菌属和微球菌属相似度最高，其中气球菌属为优势属。

图 2 耐铜细菌群落16S rDNA V3区变性梯度凝胶电泳图谱 Figure 2 Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE） profile of amplified 16S rDNA V3 region from Cu tolerant

图选项

表 2 DGGE回收条带序列比对结果 Table 2 Match of recovered DGGE bands to known species

表选项

耐铜细菌群落对CuO NPs的淋滤结果如图 3。CuO NPs的淋滤随着处理浓度的升高呈增加趋势，但不同CuO NPs浓度下各细菌群落的淋滤结果有明显差异。当CuO NPs浓度为200 mg·L^-1时，未接种耐铜细菌的对照淋滤出的Cu²⁺反而最高。但随着CuO NPs处理浓度的升高，处理组的淋滤量明显提高，在800 mg·L^-1浓度下，来自取样点S3的细菌群落淋滤效果最好，显着高于其他处理（P＜0.05）。

图 3 各细菌群落对CuO NPs的淋滤作用 Figure 3 Effect of bacterial communities on leaching of CuO NPs

图选项

对细菌群落S3进行进一步分离培养和纯化，得到3种细菌S31、S32、S33.通过上述16S rDNA序列分析结果（表 2）、革兰氏染色和形态学特征进行分类鉴定。3种菌落表面湿润，易挑取，正反面颜色一致。其中，S31呈亮黄色，菌落圆形、有隆起、不透明、边缘整齐、有粘性，革兰氏染色阴性、球菌，确定为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas,图 4a）。S32呈灰白色，菌落呈圆形或不规则形状、不透明，革兰氏染色阴性、球菌，排列方式包括单个、多联体和成团块等形式，确定为气球菌属（Aerococcus,图 4b）.S33呈棕黄色，菌落圆形、不透明、边缘整齐、革兰氏染色阳性、球菌，排列方式包括单个、多联体或成团块等形式，确定为微球菌属（Micrococcus,图 4c）。

图 4 从群落S3分离、纯化的耐铜细菌菌斑和革兰氏染色结果 Figure 4 Colony and gram staining of copper-tolerant bacteria isolated and purified from community S3

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在驯化前先对细菌的铜耐受水平进行测试。结果表明，细菌在0~6 h数量增长较快，6 h后进入平台期。随着CuO NPs浓度的提高，细菌生长受到显着抑制，在400 mg·L^-1浓度下细菌增殖速度非常缓慢。

对照条件下，驯化虽然能改善细菌的生长，但对三种细菌OD值的影响均不明显（图 5）。加入200 mg·L^-1的CuO NPs均对细菌的生长产生明显的抑制作用，S31和S32受抑制明显，但S33受影响较小。从驯化的效果来看，S31驯化后在CuO NPs处理中的增殖情况显着改善（P＜0.05），其他两种细菌驯化效果不明显。因此，选择S31进行后续淋滤试验。

图 5 CuO NPs对三种细菌的驯化效果 Figure 5 Acclimation of CuO NPs on three bacteria

图选项

无论是否添加CuO NPs及其处理浓度高低，驯化后细菌S31的生长状况均要好于驯化前。在100 mg·L^-1浓度下，S31的菌体密度甚至显着高于对照（P＜0.05,图 6a）。200 mg·L^-1的处理中驯化对细菌S31生长的影响更加明显，其菌体密度仍然高于接种未驯化S31的对照处理（P＜0.05,图 6b）。400 mg·L^-1 CuO NPs对细菌S31的抑制仍十分明显，虽然驯化后细菌的菌体密度仍然相对较高，但增加并不明显（图 6c）。

图 6 不同CuO NPs浓度对细菌S31的影响 Figure 6 Effect of different CuO NPs concentrations on growth of bacterium S31

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随着CuO NPs处理浓度的增加，淋滤出的铜离子量明显提高，但不同浓度的CuO NPs处理中驯化对细菌S31的淋滤效果有不同影响。在100 mg·L^-1浓度下，接种耐铜细菌S31的两个处理淋滤效果均好于对照，但驯化没有明显提高细菌对CuO NPs的淋滤。在200 mg·L^-1浓度下三种处理的结果均无差异。在最高的400 mg·L^-1 CuO NPs浓度下，接种S31处理的淋滤效果好于对照，并且驯化后S31的淋滤量显着提高（P＜0.05,图 7）。

图 7 细菌S31对CuO NPs的淋滤 Figure 7 Effect of bacterium S31 on leaching of CuO NPs

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超声处理后细菌S31淋滤的铜离子量均有所增加，但只有在200 mg·L^-1 CuO NPs的处理中达到显着水平（P＜0.05,图 8），CuO NPs浓度达到400 mg·L^-1时超声对淋滤结果基本没有影响。

图 8 超声处理细菌S31对CuO NPs淋滤的影响 Figure 8 Effect of ultrasonic treatment on leaching of CuO NPs

图选项

本研究的三个样点均受到高浓度的铜锌复合污染，可能是导致茵陈蒿根际耐铜细菌多样性较低的原因之一。该区域铜矿废弃地上的另一种耐铜植物--海州香薷根际AMF的多样性也非常低，且多样性与铜污染水平呈显着负相关^[20].研究中筛选的耐铜细菌分别属于气球菌属、寡养单胞菌属和微球菌属，其中气球菌属为优势属。微球菌、假单胞菌（Pseudomonas）在铜污染生境中十分常见，铜离子浓度达560 mg·L^-1仍可正常生长，耐铜能力较高^[21],但气球菌和寡养单胞菌目前还未曾报道。与其他研究中发现的耐铜细菌相比^[22],本研究筛选的三个属的细菌铜耐性水平均较低，400 mg·L^-1的CuO NPs（铜离子浓度＜300 mg·L^-1）对其增殖就已造成了非常明显的抑制，而且在有机物作用下通过淋滤作用产生的铜离子毒性要低于CuSO⁴等盐类产生的铜离子。其原因可能是铜离子与多肽物质相结合，降低了对细菌的毒害作用^[2]。

Gunawan 等^[2] 研究表明，CuO NPs的淋滤主要是由氨基酸等小分子量有机物引起的，本研究中未接种细菌的对照处理CuO NPs的淋滤也可以达到50%左右，主要是源于酵母浸提液中各种有机物的影响。研究发现，耐铜细菌产生的有机酸可以进一步提高铜的淋滤量^[9].这可能是本研究中细菌促进CuO NPs淋滤的重要原因之一。耐铜细菌可以通过细胞壁和细胞膜大量吸附铜离子^[23],以降低对细胞的氧化胁迫。本研究对细菌进行超声处理后，淋滤的铜离子量会有所增加（图 8）,可能与细菌对铜离子的解吸有关，也可能与超声处理导致CuO NPs趋于分散，从而进一步促进淋滤有关。从本研究的结果可以推断，耐铜细菌对CuO NPs的淋滤决定于淋滤出的铜离子总量与被菌体吸附的铜离子的差值，并与CuO NPs的处理浓度有关。200 mg·L^-1浓度下对照的淋滤量反而高于接种任何一种细菌群落的处理，可能是由于该浓度下细菌的增殖并未受太明显的抑制，虽然接种细菌使淋滤出的铜离子总量有所增加，但被细菌所吸附的铜离子增加更多所造成的。细菌群落在不同CuO NPs浓度下的淋滤效果有显着差异，群落S3在800 mg·L^-1下淋滤值最高，而S1和S2分别在400 mg·L^-1和600 mg·L^-1时表现最好。由于400 mg·L^-1的CuO NPs就已对细菌的增殖产生了显着抑制，可以推断S3之所以在800 mg·L^-1浓度下淋滤量达最大值可能与以下两方面的原因有关：一是S3在高浓度CuO NPs下通过菌体自身活动，产生了更多的氨基酸或其他小分子有机酸等代谢产物，增加了铜离子的溶出；二是由于细菌增殖受到强烈抑制，菌体吸附的铜离子大大减少。重金属胁迫下，微生物和植物大量释放有机酸是一种十分常见的现象，不仅可以改变金属的形态和粒径^[10],还可以通过螯合作用降低重金属毒害^[24].因此，细菌为缓解铜的胁迫产生了更多有机酸，但同时又进一步增加了铜的有效性。Li等^{[25, 26]} 发现，镉胁迫下不同藻类之间会产生互惠现象（Facilitation）,镉敏感的藻类会受到耐镉藻类的保护，因此多样性越高生产力也越高，对镉的去除能力越强。本研究未测定细菌群落在不同CuO NPs处理中的生长情况，因此难以判断细菌之间是否存在互惠作用。但从最终的淋滤量来看，从群落S3分离出的细菌S31无论是否进行驯化其淋滤量均高于群落S3.实际上S31是组成群落S3的三种细菌中对铜胁迫最敏感的（图 5），其淋滤量高于群落S3可能是由于有机酸释放能力更强，菌体所吸附的铜离子更少造成的。

经过铜梯度驯化后，三种细菌的增殖情况均有所改善，尤其是S31，驯化后对铜胁迫的耐性显着增加。低浓度CuO NPs处理中（100、200 mg·L^-1）S31的生长量甚至高于对照，说明少量的铜离子对耐铜细菌的生长有一定的促进作用。这是很多耐受性生物的共同特征。但是，400 mg·L^-1的CuO NPs对细菌生长的抑制仍十分明显。

本研究结果表明，耐铜细菌对CuO NPs的淋滤，以及驯化对淋滤的影响，与CuO NPs的处理浓度有关。100 mg·L^-1 CuO NPs产生的铜离子促进细菌生长，虽然其吸附的铜离子也在增加，但细菌对淋滤作用的强化占优势，因此净淋滤量高于对照。200 mg·L^-1 CuO NPs处理使细菌对铜离子的正负影响基本达到平衡，但此浓度下驯化对细菌增殖的效果最为明显。当CuO NPs浓度增加到400 mg·L^-1时，细菌通过有机酸的作用溶出更多铜离子，吸附的铜离子则大大减少，因此净淋滤量高于对照。由于受到多种因素的共同影响，自然环境中CuO NPs的迁移、转化等环境行为将更加复杂。耐铜细菌能否强化CuO NPs污染环境的植物修复效果还有待通过进一步的盆栽试验进行验证。

（1）茵陈蒿根际耐铜细菌群落多样性较低，主要包括气球菌、寡养单胞菌和微球菌等三个属，气球菌为优势属。

（2）细菌S33对铜耐性最强，但S31的驯化效果最好，100 mg·L^-1和200 mg·L^-1的CuO NPs处理对S31的生长有一定促进作用，400 mg·L^-1的CuO NPs仍会产生明显抑制。

（3）不同处理浓度下，细菌S31对CuO NPs的淋滤作用、驯化对淋滤的影响均有明显差异，可能与细菌的增殖、有机酸的释放，以及菌体对铜离子的吸附等因素有关。