随着辣椒种植面积的不断扩大，连作障碍愈加严重，已经成为制约辣椒产业可持续发展的瓶颈。连作障碍形成机理包括土传病虫害加剧、土壤理化性状劣化和植物的自毒作用三个方面^[1],其中自毒作用可能是连作障碍的主要原因，土壤性质劣化和土传病虫害加剧只是连作障碍的次生危害^[2].研究表明，自毒作用是辣椒连作障碍形成的重要原因之一^[3],辣椒连作会对自身产生毒害，抑制其生长^[4],邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）为主要潜力化感物质^[5].侯永侠等^[6]指出，辣椒根系分泌物中DBP的匹配度为48.87%;耿广东等^[7]认为，辣椒主要的化感物质中，DBP的含量最高，达到41.5%;须文^[8]研究表明，辣椒化感作用的优势组分中，DIBP的相对质量分数最大，为46.67%.可见，DBP和DIBP是辣椒主要化感物质，它们可能对辣椒的连作障碍起着重要作用。同时，DBP和DIBP作为酞酸酯中应用较多的两种，被广泛用于农膜、杀虫剂、杀菌剂的生产，也已经成为农田土壤中最常被检出的有机污染物^{[9, 10]}.研究表明，我国设施土壤中酞酸酯含量已经达到mg·kg^-1数量级，东南沿海地区设施土壤中酞酸酯含量在3.0~45.7 mg·kg^{-1 [9, 10]},南京城郊典型设施菜地土壤酞酸酯总体污染负荷为 4.31 kg·hm^-2,6种酞酸酯的总量为 0.15~9.687 mg·kg^-1,DBP为该地区设施农业土壤的主要酞酸酯种类之一^[11].因此，弄清楚DBP和DIBP对辣椒生长的影响，寻找能够有效修复DBP和DIBP胁迫的措施有现实意义。

任旭琴等^[12]研究表明，适量添加凹土能缓解DBP对辣椒的毒害作用，使其膜脂过氧化程度减轻，POD和CAT活性增强，根系活力和吸收能力增强。腐植酸可以促进土壤团粒结构的形成，增加土壤有机质和有效养分含量，改善土壤pH值，刺激作物生长发育，对缓解土壤连作障碍也有明显作用^[13].蜂窝煤渣有强烈吸附作用，对污水COD有一定的去除作用，还能在一定程度上改善土壤的透水透气性，煤渣里含有的无机盐也能为植物生长提供一些养分^[14].可见，利用凹土、蜂窝煤渣和腐植酸修复DBP/DIBP胁迫具有很好的可行性。本文通过外源添加DBP/DIBP模拟污染土壤，探讨了DBP/DIBP对辣椒生长的胁迫效应，应用Box-Behnken设计对凹土、蜂窝煤渣和腐植酸的配方进行优化，探讨其修复机制，以期探索一条DBP/DIBP的修复途径，为缓解辣椒连作障碍提供理论依据。

辣椒品种为中华红巨椒，辣椒幼苗购自淮安市蔬菜研究所。

凹土原土采自盱眙白虎山，由江苏省凹土资源利用重点实验室提供，风干研磨过1 mm筛；蜂窝煤渣为民用蜂窝煤彻底燃烧后的废弃物，研磨过1 mm筛备用；土壤样品采自稻麦轮作的表层农田土，取样深度0～20 cm,风干捣碎过5 mm筛，混入复合肥1.5 g·kg^-1,备用，复合肥含N∶P₂O₅∶K₂O为15∶15∶15。

DBP和腐植酸购自南京化学试剂有限公司，DIBP购自阿拉丁化学试剂有限公司。

用丙酮稀释DBP和DIBP,得丙酮-DBP和丙酮-DIBP溶液，取风干捣碎的土壤，等量加入丙酮-DBP溶液和丙酮-DIBP溶液，使土壤中DBP和DIBP含量均为0、10、20、40、80 mg·kg^-1,分别用T0、T10、T20、T40、T80表示，混匀晾干24 h,让丙酮充分挥发后装盆，泥瓦盆上口径33 cm,每盆装干土2.5 kg.定植6叶期的辣椒幼苗，定植时抖掉辣椒根系上的基质，及时浇透水，60 d后测定生长指标及单株干重。每处理90盆，3次重复。

依据前期单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计进行凹土、蜂窝煤渣、腐植酸的优化试验，各组分编码水平见表 1。

表 1 修复剂优化的Box-Benhnken设计因素水平表 Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design for remediation optimization

表选项

土壤处理和测定方法同前。选取DBP和DIBP 含量均为20 mg·kg^-1的土壤，将土壤分成15份，按照表 3所列Box-Behnken试验设计，加入凹土、蜂窝煤渣和腐植酸，充分混匀后装盆，定植辣椒幼苗，60 d后测定辣椒植株的干重，每处理30盆。

采用Design Expert 8.0.6软件进行数据处理和分析。

盆栽试验，土壤处理和管理方法同1.2.2,将土壤分成两份，设置2个处理：YH,凹土16.0 g·kg^-1,蜂窝煤渣16.0 g·kg^-1,腐植酸1.7 g·kg^-1;CK,不添加修复剂。60 d后测定辣椒根际土壤（根系抖落的土壤）酶活性以及根系生理指标，同时验证干重。

采用0.01 cm精度的卷尺测量株高和根长；排水法测定根系体积；将辣椒植株整株挖出，洗净根系，在105 ℃下杀青，70 ℃烘至恒重，测定干重；土壤脲酶采用靛酚比色法^[15];脱氢酶活性采用TTC还原法^[15];蛋白酶活性采用茚三酮比色法^[16];蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法^[16];根系活力采用TTC法^[17];MDA含量采用硫代巴比妥酸法^[17];POD活性采用愈创木酚法^[18];CAT活性采用紫外吸收法^[18]。

由表 2可知，随着土壤中DBP/DIBP含量增大，辣椒株高和根系长度均表现出下降趋势，至20 mg·kg^-1时与对照（T0）达到差异显着水平，分别仅为对照的84.08%和84.64%;受DBP/DIBP影响，根系体积也逐渐下降，40 mg·kg^-1 DBP/DIBP以上时，根系体积下降达差异显着水平；干重也表现出与上述生长指标相似的变化规律。可见，DBP/DIBP高于20 mg·kg^-1时，DBP/DIBP对辣椒产生胁迫效应。

表 2 DBP/DIBP对辣椒生长及干重的影响 Table 2 Effects of DBP/DIBP on growth and dry weight of pepper

表选项

以辣椒干重为响应值，在前期单因素试验基础上，选用三因素三水平的Box-Behnken试验设计，对凹土、蜂窝煤渣和腐植酸混合组成的修复剂配方进行优化（表 3）.

表 3 Box-Behnken试验设计及干重响应值 Table 3 Box-Behnken experimental design and results

表选项

通过多项回归分析，得到三因素与干重之间的回归模型：

Y=-0.015+0.159A+0.122B+1.750C+2.800×10^-3 AB-0.020AC-5.383×10^-3A²-5.083×10^-3B²-0.428C²

式中：Y为干重的预测值，g;A、B、C分别代表凹土、蜂窝煤渣和腐植酸的含量。

由于BC对干重没有显着影响（P>0.05）,没有进入上述模型。

回归模型方差分析表明（表 4）,该模型达到极显着水平（P<0.01）;回归方程的失拟项不显着，为0.197 5（P>0.05）;回归模型的决定系数R²=0.987 4,说明该模型能解释98.74%的变化；模型的信噪比为22.251（>4）,表明该模型具有足够的信号强度。由此可见该模型可用于分析和预测修复剂对辣椒干物质积累的影响。

表 4 回归模型的方差分析 Table 4 Analysis of variance for regression model based on Box-Behnken experimental design

表选项

从表 4可以看出，凹土、蜂窝煤渣和腐植酸对干重均有显着或极显着影响，各因素对辣椒干重影响的顺序依次为C>B>A,说明三因素对辣椒生长均存在显着正效应；在交互项中，凹土和蜂窝煤渣（AB）、凹土和腐植酸（AC）的互作对干重有极显着影响，而蜂窝煤渣和腐植酸（BC）的影响不显着；三因素的二次项（A²、B²、C²）对干重也有极显着影响。由此可见，凹土、蜂窝煤渣和腐植酸对辣椒DBP/DIBP胁迫有显着修复作用，三者合理配施的效果更好。

应用回归模型，按照植株干重最大化原则，得到三因素组成的最佳修复剂配方为：凹土15.91 g·kg^-1、蜂窝煤渣16.40 g·kg^-1、腐植酸1.67 g·kg^-1,辣椒干重的预测值为3.743 g.经验证，辣椒干重的实测值为3.736 g,表明预测值和实际值之间存在较高的拟合度，该模型具有较好的实用价值。添加修复剂后辣椒干物质增加20.91%,证实其修复效果显着。

从表 5可以看出，添加修复剂后，四种土壤酶活性显着增强，与CK相比，脲酶活性增强22.30%,脱氢酶活性增强49.29%,蛋白酶和蔗糖酶活性分别增强43.74%和46.24%,说明修复剂对辣椒根际土壤功能的多样性有明显改善。

表 5 修复剂对辣椒根际土壤酶活性的影响 Table 5 Effect of remediation on enzyme activities rhizospheric soil of pepper

表选项

由表 6可知，修复剂能有效提高DBP/DIBP胁迫下辣椒根系的抗氧化和吸收利用能力，致使其根系MDA含量显着降低，POD和CAT活性显着增强，根系活力增强和活跃吸收面积增大。从上述结果推测，修复剂是通过吸附降低根际土壤DBP/DIBP浓度，改善土壤环境，降低胁迫，增强根系吸收利用能力，进而显现修复效果。

表 6 修复剂对辣椒根系生理指标的影响 Table 6 Effect of remediation on root physiological indices of pepper

表选项

作物的连作障碍与其所产生的化感物质密切相关，化感作用会影响土壤的理化性质和养分状况，进而影响作物的吸收和利用^[19].DBP和DIBP是辣椒主要的化感物质^{[5, 6, 7, 8]},也是农田土壤中常被检出的污染物^[11],它们可能对辣椒的连作障碍起着重要作用，弄清楚DBP/DIBP对辣椒生长的影响有重要的现实意义。植物可以通过根系从土壤中吸收积累DBP,尹睿等^[20]发现，在辣椒果实、植株及根系中的DBP残留量随土壤中施加浓度增加而增加，辣椒果实中的维生素C和辣椒素含量随施加浓度增加而显着下降，推测辣椒品质的下降主要是由于DBP的作用。周宝利等^[21]认为，邻苯二甲酸二异丁酯对茄子种子萌发和幼苗株高、茎粗、地上部鲜质量、地下部鲜质量、根系活力和叶绿素含量具有“低促高抑”的现象。李轶修等^[22]研究表明，适当浓度DBP对茄子的种子萌发和幼苗生长有促进作用，但当浓度过大时或在土壤积累过多时则对其生长产生抑制作用。与上述结果类似，当DBP/DIBP含量较高，达到20 mg·kg^-1以上时，辣椒生长被显着抑制，不同的是，本研究中10 mg·kg^-1 DBP/DIBP对辣椒生长无明显抑制或促进作用，可能与试验材料和方法不同有关。

土壤中DBP/DIBP污染日趋严重，但对其修复研究却相对较少。凹土是以凹凸棒石为主要矿物成分的一种稀有天然非金属粘土矿物，具有良好的吸附性、离子交换性、分散性及环境友好性等特征，被广泛应用于环境保护、肥料控释技术及土壤改良等方面^{[23, 24]}.刘总堂等^[25]研究认为施加有机黏土可以使六六六有效固定在土壤中，减少其对环境的危害。腐植酸含有羟基、羧基和酚羟基等活性基团，对各种有机无机污染物具有强烈的吸持作用，能够通过疏水作用、配位交换和氢键作用吸附有机污染物，从而降低有机污染物的毒性^[26].宋娇艳等^[27]对腐植酸-DBP复合物红外光谱分析结果表明，腐植酸对DBP有吸附作用，其机理主要是腐植酸分子与DBP分子间发生的氢键相互作用。孙楠等^[28]认为，凹凸棒土与腐植酸分子间存在范德华力、氢键力、偶极间作用力，凹凸棒土对腐植酸存在物理吸附，这种吸附由凹凸棒土多孔性及比表面积决定。本研究表明，凹土、蜂窝煤渣和腐植酸对DBP/DIBP胁迫有显着修复效果，凹土与蜂窝煤渣、腐植酸之间存在显着互作性，这种互作可能源于它们之间存在的作用力能够使其比表面积增大，微观孔隙增多，对DBP/DIBP有更强的吸附性，从而能更好地改善土壤结构和功能，使土壤结构和养分利用合理^[25]。

土壤酶是土壤的重要组成部分，参与包括土壤生物化学过程在内的自然界物质循环，在土壤的发生发育以及土壤肥力的形成过程中起着重要作用^[29].Kandeler等^[30]认为，土壤酶的功能多样性与土壤功能的多样性紧密相关，土壤生态系统退化都伴随着不同土壤酶活性的下降。土壤酶活性降低，有效养分利用率下降是造成连作障碍的重要原因之一^[31].因此，本研究认为，合理配施凹土、蜂窝煤渣和腐植酸能使辣椒根际土壤的DBP/DIBP有效浓度下降，土壤微生态得到改善，土壤酶活性增强，进而使根系保护酶活性增强，膜脂过氧化降低，根系活跃吸收面积增大和根系活力增强，最终提高有效养分利用率，这是修复剂应对DBP/DIBP胁迫的主要机制。

当DBP/DIBP含量达到20 mg·kg^-1时，辣椒生长和干重被显着抑制，低于10 mg·kg^-1时影响不明显。

凹土、蜂窝煤渣和腐植酸的最佳配方含量分别为：15.91、16.40 g·kg^-1和1.67 g·kg^-1.验证表明，修复剂对DBP/DIBP胁迫有显着修复作用，使辣椒干重增加20.91%。

修复剂通过降低土壤中DBP/DIBP的有效含量，使土壤酶活性增强，改善土壤微生态，通过增强根系保护酶活性，降低膜脂过氧化，扩大根系活跃吸收面积，增强根系活力，从而提高有效养分利用率，促进辣椒生长。