多环芳烃是一类广泛分布于环境中并具有显着的致癌、致畸、致突变效应的持久性有机污染物，在持久性有机污染物（POPs）中居于重要地位^{[1, 2]}.鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）GY2B 和假单胞菌（Pseudomonas sp.）GP3A 是环境中重要的多环芳烃（PAHs）降解菌，两者都是革兰氏阴性菌。GY2B 是一株菲降解菌，对芘不能降解，GP3A 是一株芘降解菌，对菲基本上没有降解效果。在实际PAHs污染的土壤中，PAHs 不会只以单一的物质存在，一般会有多种底物同时以混合物的形式存在^{[3, 4, 5]},所以获得能够同时降解不同PAHs的菌株是当前研究的一个热点。原生质体融合技术具有不需要详细了解研究对象的遗传背景，不需要构建载体系统，可在种内、种间、属间、甚至目间实现原生质体融合，可以获得遗传性能优良的重组体等特点，在环境领域的应用越来越广^{[6, 7, 8]}.以GY2B 和GP3A 为亲本进行原生质体融合，构建一株能够同时并且高效降解菲和芘的菌株是本研究的目的。此研究的关键是必须从大量的非目标融合子中筛选出具有上述性状的融合子，因为两株菌的原生质体融合后，不仅有GY2B 和GP3A 的融合，还有GY2B 和GY2B、GP3A 和GP3A 自身的融合以及大量未融合的细胞，我们期望得到的是既能降解菲又能降解芘的GY2B 和GP3A 的融合子，所以原生质体融合前必须对亲本菌株进行遗传标记以便于顺利地筛选到融合菌株，融合后的菌株也必须经分析鉴定来确定其是真正的融合子。抗药性筛选方法具有一定的针对性，并且比较灵敏、快速，是一种较好的筛选方法^{[9, 10]}。

芘降解菌GP3A（Genbank登录号：EU233280）和菲降解菌GY2B（Genbank登录号：DQ139343）是本实验室先前在石油污染的土壤中筛选得到的，其培养方法及无机盐基础培养基（MSM）见参考文献^[11]和^[12]。

混合抗生素溶液的牛肉膏蛋白胨固体培养基（NR）:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,蒸馏水1 L,琼脂1.0%,调pH 值为7.2～7.4.高压蒸汽灭菌20 min后，冷却到60 ℃左右倒平板。

菲购于Fluka公司，芘、甲醇、Taq 酶、DNA Marker 购于Sigma 公司，6×Loading Buffer和UNlQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购于上海生工。Afa Ⅰ核酸内切酶和Msp Ⅰ核酸内切酶购于加拿大BBI。

PCR反应引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′）和1522R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

正己烷重蒸后使用，菲和芘用正己烷分别配成浓度10 g·L^-1 和5 g·L^-1的贮备液，置于4 ℃冰箱中保存备用。无水硫酸钠于马弗炉中400 ℃灼烧4 h 后使用。医用脱脂棉用二氯甲烷抽提72 h,通风橱风干后放入防潮箱。所有萃取过程用到的玻璃器皿先用重铬酸钾洗液清洗，静置过夜后依次用自来水、蒸馏水冲洗，放入烘箱中于120 ℃烘干后用锡纸封口，放置备用。

抗生素储备液制备：取一定质量抗生素，其中氯霉素用乙醇溶解，其他抗生素用去离子水溶解，配成浓度为2.5 mg·mL^-1的母液。用一次性注射器使抗生素溶液通过孔径为0.22 μm 的滤膜，过滤后的抗生素除氨苄青霉素和氯霉素置于常温下外，其余全部置于-20 ℃的环境下保存备用。

菲、芘无机盐培养液：取一定量的菲（芘）储备液，置于灭菌的三角瓶中，待正己烷挥发完毕加入经高压蒸汽灭菌的无机盐基础培养基。

（1）在100 mL 锥形瓶中配制50 mL 牛肉膏蛋白胨固体培养基溶液。灭菌后，将固体培养基置于55 ℃水浴锅中待用。

（2）在冷却至45~55 ℃的固体培养基溶液中分别加入不同体积的抗生素储备液，摇匀并排除气泡，倒平板冷却制成一系列浓度的固体培养基。每种浓度三个平行样，以一个不加抗生素的平板做空白对照。

（3）取1 mL 活化后的GP3A 和GY2B 菌液，用去离子水稀释1000倍，涂布于含有抗生素的固体培养基上，30 ℃恒温培养48 h后观察细菌生长情况。

将两种菌的菌液（OD₆₀₀=1.0）在4 ℃下以8000 r·min^-1的转速离心10 min,收集的菌体用磷酸缓冲液（PBS）冲洗两遍并重新悬浮在含有0.5 mol·L^-1蔗糖的PBS中；然后菌体用0.1%的EDTA（pH =8.0）在水浴振荡器中以37 ℃、110 r·min^-1预处理20 min;收集菌体并用高渗液（SMM:0.5 mol·L^-1蔗糖、20 mmol·L^-1 MgCl₂、20 mmol·L^-1 马来酸钠，pH=6.5）冲洗两遍，将GP3A和GY2B菌体重新悬浮在20 mL含有5 mg·mL^-1溶菌酶的SMM缓冲液中，在水浴摇床中以37 ℃、110 r·min^-1分别处理100 min和80 min,然后菌液用8000 r·min^-1的转速离心10 min,弃去上清液，再用SMM洗涤除酶后将原生质体悬浮于SMM中。

将两种菌的原生质体在含有1 mL 40% 聚乙二醇、10 mmol CaCl₂、15% 二甲基亚砜的PEG6000 溶液中诱导融合5 min,收集融合子。

菲和芘的测定方法见参考文献^[11]和^[12],具体步骤如下：

（1）将培养液经梨形分液漏斗用重蒸过的正己烷萃取两次，将有机相合并于鸡心瓶。有机相通过旋转蒸发在35 ℃下减压浓缩到3 mL 左右，然后经无水硫酸钠脱水后（在一个小漏斗底部放一点棉花，上面放约2 g 无水硫酸钠）转入另一个干净的鸡心瓶，再在旋转蒸发仪上减压蒸发、浓缩到一定体积后用5 mL 或25 mL 容量瓶定容。最后所有样品转移至2 mL 细胞瓶中，用压盖器压好盖子，放置-20 ℃冰箱中保存，待分析。

（2）菲和芘的浓度采用高效液相色谱仪（安捷伦1200）分析，采用HP-Extender-C18柱，流动相为甲醇∶水=80∶20,流速为1.0 mL·min^-1.菲和芘的检测波长分别为254、240 nm.该方法对菲和芘的检测限分别为10、50 ng·L^-1,菲的回收率在83.86%~122.86%之间，标准偏差2.61%~25.28%,芘的回收率在 91.14%~106.34%之间，标准偏差4.71%~16.55%。

将菌株GP3A、GY2B与融合菌株用涂布法接种到NR 固体培养基，置恒温培养箱（30 ℃）培养2~3 d,观察融合菌株在NR 固体培养基上的菌落特征。

通过扫描电镜的观察分析融合菌株F14和亲本的形态差异，具体步骤如下：

（1）细菌固定：NR培养基培养过夜的细胞用0.1 mol PBS（pH=7.0）清洗三遍，每次10 min,加入4 ℃预冷的2.5%体积分数戊二醛，在4 ℃固定12 h,吸出固定剂，用PBS（pH=7.0）洗3次，每次30 min,再用4 ℃预冷的1%四氧化锇固定3 h,然后用0.1 mol PBS（pH=7.0）洗3次，每次5 min。

（2）脱水：用系列梯度（体积分数）乙醇逐级脱水30%→50%→70%→80%→90%每个浓度15 min,100% 时脱水三次，每次10 min.30%、50%、70%在4 ℃冰箱内脱水，其他浓度乙醇在室温脱水。

（3）替换：将乙醇倒掉，换成叔丁醇重复进行脱水步骤（2）。

（4）干燥：用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。

（5）喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后用JFC^-1600离子溅射镀金膜约10 nm.

（6）观察：利用JSM-6360LV扫描电子显微镜进行观察并拍照（条件：EHT=25.00 kV）.

（1）菌种总DNA 的提取：采用UNlQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒。

（2）50 μL PCR 反应体系：DNA模板（100 ng·μL^-1）1μL;MgCl₂（25 mmol·L^-1） 3 μL;PCR 缓冲液（10 ×） 5 μL;dNTP（2.5 mmol·L^-1）1 μL;引物 27F（10 μmol·L^-1） 0.5 μL;引物1522R（10 μmol·L^-1） 0.5 μL;Taq 酶（5 U·μL^-1） 1 μL;去离子水 38 μL.PCR 扩增条件为：94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃ 延伸2 min,30个循环；72 ℃最终延伸7 min。

（3）PCR 产物酶切：用Afa Ⅰ和MspⅠ限制性内切酶对扩增得到的PCR 产物进行酶切。30 μL 酶切反应体系：15 μL PCR产物，3 μL 10×缓冲液，1 μL内切酶（10 U）,11 μL ddH₂O,37 ℃水浴4 h.反应中止后，取5 μL酶切后反应产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳，然后用美国BIO-RAD凝胶成像系统观察拍照。

取适量的菲和芘的正己烷溶液，加入灭菌的锥形瓶中，待正己烷挥发完，加20 mL MSM 培养基，使菲和芘的终浓度为100 mg·L^-1,调节pH 在7.0左右，加入1 mL融合菌液，将锥形瓶放入摇床中在30 ℃条件下以150 r·min^-1的转速培养。菲在0、8、12、24、36、48、60 h 取样，芘在0、24、48、72、120、168、216、240 h 取样，每个时间点设置3个平行样，3瓶培养液整瓶萃取，测定菲和芘的残留量。空白对照只加菲和芘于无机培养液中。

细菌的比生长速率以μ表示，单位为h^-1.计算公式如下：

式中：t为时间，h;N_t为培养t时间的生物量，个·mL^-1;N₀为开始时生物量，个·mL^-1。

微生物耐药性以及耐药机制的启动通常是由抗生素抗性基因调控的^{[13, 14, 15]},不同种的微生物对同一种药物的抗性不同，利用这种差异可对融合子进行选择^{[16, 17]}.假单孢菌株GP3A 的耐药性试验结果见表 1.本实验选用16 种抗生素，浓度范围40~300 μg·mL^-1.在此浓度范围内可以看出，任何浓度的新霉素和氨曲南对GP3A 完全没有抑制作用，说明GP3A 对新霉素和氨曲南具有抗性。从表 1也可以看出，任何浓度的新霉素和氨曲南对GY2B 完全没有抑制作用，GY2B和GP3A 一样，对新霉素和氨曲南也具有抗性。

表 1 菌株GP3A和GY2B对抗生素的抗性测定 Table 1 Resistance to antibiotics of GP3A and GY2B

表选项

进行菌株GY2B 和GP3A 的抗生素敏感试验时，为避免筛选出来的融合子是一种细胞融合或未融合的单个细胞，选取只对GY2B 有抗性的抗生素和只对GP3A 有抗性的抗生素，用于对融合细胞的筛选。从表 1可看出，在哌拉西林浓度为80 μg·mL^-1时，GY2B 不能生长而GP3A 可以生长；在红霉素浓度为100~150 μg·mL^-1或头孢他啶浓度为80 μg·mL^-1时，GP3A 不能生长而GY2B 可以生长。因此，80 μg·mL^-1的哌拉西林和头孢他啶或者80 μg·mL^-1的哌拉西林和100~150 μg·mL^-1的红霉素可以初步被选为筛选融合子的抗生素。然而由于抗生素之间可能存在的拮抗作用^[18],使得GP3A 和GY2B可以在含有上述浓度抗生素的再生培养基中生长，导致筛选不出融合子。我们将GP3A 和GY2B 分别涂布于含有上述浓度的抗生素的培养基上，经过48 h的30 ℃恒温培养，发现GP3A 和GY2B 在两个平板中都不能生长。因此可以认为，能够在同时存在哌拉西林（80 μg·mL^-1）和头孢他啶（80 μg·mL^-1）或哌拉西林（80 μg·mL^-1）和红霉素（100~150 μg·mL^-1）的再生平板上生长出来的菌体，就是GP3A 和GY2B 的融合子。

利用此法筛选融合子应注意，药物使用浓度不宜过高，否则会降低融合频率，同样也不可过低，浓度过低不足以抑制亲本的生长，从而降低筛选效率。除了药物质量、药物浓度及细菌耐药性遗传外，药物加入培养基时的温度也会对其产生重要影响^[17].培养基中加入药物时的适宜温度为45~55 ℃，如果温度过高药物会降低药效甚至完全失效，温度低于45 ℃时琼脂会凝固以致倒不成平板，因此在具体应用时应严格控制加入药物时的培养基温度。

从含有上述两种抗生素的选择培养基中随机挑选一批菌株，经活化培养后分别涂布于含有菲或者芘的无机盐固体培养基，30 ℃培养72 h.传代培养8代并挑取同时能在含有菲和芘的无机盐固体培养基上生长并产生透明圈的菌株，将这些菌分别接种于含有50 mg·L^-1菲或10 mg·L^-1芘的无机盐液体培养基，降解菲2 d,降解芘10 d,最后测出剩余的菲和芘的含量，实验结果见表 2.可以看出降解菲效果最好的是14号菌株，降解芘效果最好的是8号菌株，但是8号菌株降解菲的效果不高，而14号菌株的芘降解率可以达到37%,所以选择14号菌株做为后续研究对象，并命名这株菌为F14。

表 2 融合子对菲和芘的降解率 Table 2 Degradation efficiencies of phenanthrene and pyrene by fusant strains

表选项

图 1 为三种菌的菌落对比图片，GY2B菌落（图 1A ）为乳黄色，圆形，边缘整齐，不透明，光滑，湿润。GP3A菌落（图 1B ）颜色淡黄，表面光滑不透明，边缘整齐，有光泽。图 1C 为F14的菌落图片，F14 在平板上菌落为规则的圆形、隆起，边缘整齐，表面光滑，有粘稠感，菌落颜色为白色，不透明。肉眼观察F14 和GP3A 要比GY2B 的菌落大。融合子菌落的形态特征界于亲本菌落之间，兼而有之且不完全同于任一亲本菌落。

图 1 菌株GY2B（A）、GP3A（B）和融合菌株F14（C）的菌落形态 Figure 1 Colonies of GY2B（A）,GP3A（B） and fusant strain F14（C） grown on NR plate

图选项

用电子显微镜测微尺，分别测定两亲株的融合子的细胞长轴（a）和短轴（b）,按下式计算细胞的平均体积（V）:

每种菌取20个平行样，结果见表 3。

表 3 融合子和亲本菌株细胞尺度和体积比较 Table 3 Sizes and volumes of fusant and its parental cells

表选项

从图 2和表 3数据可以看出，GY2B为短杆状，GP3A为长杆状，融合菌株F14为椭球状，比双亲都短，而直径却大于双亲。融合子体积为0.184 μm³,约为GP3A体积（0.096 μm³）和GY2B体积（0.078 μm³）之和。这与其他细菌或真菌原生质体融合的结论相似^{[20, 21]}。

图 2 菌株GY2B（A）、GP3A（B）和融合菌株F14（C）的扫描电镜照片[19] Figure 2 Scanning electron microscope（SEM） images of GY2B（A）,GP3A（B） and fusant F14（C）

图选项

为进一步鉴定融合菌株F14是不同于亲本的菌株，采用分子生物学技术--限制性片段长度多态性（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP）对其进行分析。图 3是GP3A、GY2B 和 F14 rDNA 用限制性内切酶进行酶切的结果图。可以看出，用 AfaⅠ和MspⅠ限制性内切酶对PCR 产物进行酶切，酶切产物通过2.5% 琼脂糖凝胶电泳显示酶切位点有显着差异，三种菌产生的酶切片段数目和大小都不一样。PCR-RFLP是发展最早的分子标记技术之一，其原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位点变异的突变位点（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重组（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）均可导致RFLP的产生^[22]。不同菌种之间在不同的限制性内切酶的酶切片段大小和数目上有一定的差异。由此可见，F14是不同于亲本GP3A 和GY2B 的菌株。

图 3 GP3A、GY2B 和 F14 rDNA PCR-RFLP 用限制性内切酶AfaⅠ和 MspⅠ酶切的结果 Figure 3 rDNA restriction patterns exhibited by three strains（GP3A,GY2B,fusant strain F14） after digestion with restriction enzymes AfaⅠ and MspⅠ

图选项

图 4是融合菌株F14和其亲本对菲和芘的降解图。从图 4a可以看出，在起初的12 h,F14就将菲降解了65%左右。降解99%以上的菲（初始浓度为100 mg·L^-1） F14需要24 h,而亲本GY2B需要48 h,和亲本GY2B比较，F14降解菲的能力有很大提高。表 4是F14 和其他菌株对菲的降解结果，在这些菲降解菌中，相同菲初始浓度下融合菌株F14的降解时间快，降解百分比高，且细胞的比生长率μ值大。这些都说明融合菌株F14 是一个具有高效降解菲能力的菌株。

图 4 F14 和其亲本对菲（a）和芘（b）的降解效果比较 Figure 4 Phenenthrene（a） and pyrene（b） degradation by strain F14 and its parental strains

图选项

表 4 F14和文献报道的其他降解菌在菲降解时间、菲降解百分比和细胞比生长率方面的比较^[19] Table 4 Comparisons of time and percentages of phenanthrene degradation by and microbial specific growth rate（μ） of strain F14 with those in literature

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F14 和GP3A 降解芘的效果如图 4b 所示。对于初始浓度为100 mg·L^-1的芘，F14在72 h 之前对芘的降解都比较快，降解率达到11.6%,在之后的7 d里降解比较缓慢，在最终的10 d 时降解率为18.3%,而GP3A在此时只可以降解11.3%.表 5 列举了F14 和文献报道的其他降解菌对芘的降解率，在这些芘降解菌中，F14 的降解效果要优于一些菌。实验选取了初始浓度为15、50 mg·L^-1的芘为研究对象，F14 在10 d 时对这两种初始浓度的芘的降解率分别为46%和37.1%.这说明F14 对芘是有一定降解效果的。

表 5 本研究得到的融合菌和文献报道的其他降解菌对芘降解率的比较 Table 5 Comparisons of pyrene degradation by a fusant strain obtained in this study with that reported in literature

表选项

菲降解菌GY2B对芘没有降解效果，而芘降解菌GP3A不能降解菲，两者融合后的菌株F14则既可以降解菲又可以降解芘，且比亲本降解菲、芘的效果都高。这可能是因为GY2B和GP3A是相近的两个菌属^[29],在遗传背景上存在着一定程度的相似性。融合子是由于亲本的原生质体发生了基因重组，导致在融合细胞中具有双亲的细胞质和细胞核，因而融合子细胞合成并分泌有关的加氧酶类、降解有机物的能力，优于任一亲本菌株。同时，融合菌株F14 可以同时降解菲和芘的能力预示了其在处理多环芳烃污染土壤的实际应用中，可以提高处理效率，具有开发应用的前景。融合菌株F14对其他多环芳烃的降解能力将在后续的文章中报道，并对F14的降解酶、降解基因等做进一步的研究。

（1）通过16种抗生素不同浓度的耐药性实验，选出了哌拉西林（80 μg·mL^-1）+头孢他啶（80 μg·mL^-1）或哌拉西林（80 μg·mL^-1）+红霉素（100~150 μg·mL^-1）的组合可以作为筛选GY2B 和GP3A 融合子的抗生素药物。

（2）通过形态学、扫描电镜观察，F14 与亲本菌株GY2B 和GP3A 在形态上有明显不同，通过分子生物学技术PCR-RFLP 分析，鉴定融合菌株F14 与GY2B 和GP3A 为不同的菌种，是GY2B 和GP3A 的融合子。

（3）F14 在24 h 可以将初始浓度为100 mg·L^-1的菲降解99% 以上，与亲本GY2B 及文献报道的其他降解菌相比，F14 具有较高的降解菲的能力。F14 对于初始浓度为100 mg·L^-1的芘也具有降解作用，在10 d时的降解率为18%,比其亲本GP3A 的降解率高。融合后的菌株既可以降解菲又可以降解芘。