相关调查表明，我国室内空气中甲醛（Formaldehyde,HCHO）浓度普遍高于室内空气质量标准（0.10 mg·m^-3,GB/T 18883-2002）,新装修房内HCHO浓度甚至高达3.86 mg·m^-3,净化室内空气HCHO污染成为人们高度关注的课题^{[1, 2]}.近几年的研究主要集中在用植物净化室内HCHO污染，多为寻找能净化室内HCHO污染的植物，对其净化能力和效果进行比较^{[3, 4, 5, 6]},一些学者利用¹⁴C和¹³C标记法对HCHO进入高等植物体内的代谢转化机制开展研究^{[7, 8, 9]},但植物吸收HCHO的机制及其影响因素方面的研究未见报道。

气孔是植物进行水分交换和气体交换的门户，气孔开度和导度对外界非生物因素的刺激或变化敏感^[10].已有研究证明，HCHO可导致多种植物的气孔开度或导度不同程度地下降^{[8, 11, 12, 13, 14]},H₂O₂作为植物气孔运动信号转导过程的成员之一，是否参与调节气孔运动尚存在争议。外源H₂O₂可以诱导气孔的关闭^{[15, 16]},但高湿环境下蚕豆叶片内产生的H₂O₂并未引起气孔关闭^[17],说明H₂O₂对气孔开闭的调节受不同环境因素影响。李惠民等^[18]研究显示HCHO可诱导拟南芥体内H₂O₂积累，但HCHO胁迫下植物体内H₂O₂的产生和积累是否影响气孔开度或导度，鲜见报道。为此，本研究以蚕豆（Vicia faba L.）为研究对象，对蚕豆进行模拟室内空气HCHO污染的处理，通过对蚕豆叶片H₂O₂含量及其H₂O₂亚细胞定位的检测，探讨HCHO胁迫下蚕豆保卫细胞H₂O₂的积累对气孔开度和导度的影响，为提高植物吸收HCHO能力的应用研究和植物气孔活动应答HCHO污染的机制研究提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料和处理

用云南蚕豆8363（Yunnan Candou 8363）做供试材料，选择饱满种子沸水烫30 s以杀死蚕豆蟓，25 ℃黑暗下催芽萌发，待胚根长出2 cm转入花盆栽培，长到6片复叶时选择长势一致的健壮植株用于HCHO处理和测定。HCHO处理装置为一个三面由压缩板材（59 cm×40 cm×48 cm）构成、一面有玻璃门的家具柜，处理前用室内装修污染检测仪对柜内和柜外空气分别进行了0、24、48、72 h的检测，没有检测到苯、氨、甲苯和二甲苯，处理时用胶带密封柜的周沿。将XK-930-CH₂O泵吸式甲醛测定仪固定在柜子玻璃门上，分别于 8:00、14:00、21:00三个时间点读取未放蚕豆植株的空柜内HCHO浓度，获得为期3 d的HCHO背景值，柜内HCHO浓度在早上8:00最低，中午14:00最高，日平均浓度在0.46～0.72 mg·m^-3 之间；放入蚕豆植株后，72 h内柜内HCHO日平均浓度在0.44～0.64 mg·m^-3之间，与未放入蚕豆植株差异不大，说明柜内板材持续释放HCHO.将长有蚕豆植株的花盆放入柜内后封闭柜门，同时在柜外（经测定HCHO浓度为0）放置长势一致的蚕豆植株作为对照（CK）,控制柜内和柜外的温度和相对湿度等条件在相近的水平，柜内外光强均设定在450 lx·m^-2,光照和黑暗处理时间设定为12 h/12 h.分别于0、24、48、72 h（每天的14:00）测定柜内和柜外蚕豆叶片的气孔开度和导度，并于相同时间取样用于叶片H₂O₂含量测定和H₂O₂的荧光显微定位检测。

抗坏血酸（Ascorbic acid,ASA）抑制实验按如下步骤进行：在蚕豆叶片下表皮均匀涂抹2 mmol·L^-1的ASA,放入柜内，处理48 h后取样测定蚕豆叶片的气孔开度、导度和H₂O₂含量，以柜内0、48 h时未涂抹ASA的蚕豆叶片为对照。实验期间昼夜气温变化范围13~22 ℃，为避免土壤及其中的微生物吸收HCHO对实验结果造成影响，处理时将种植蚕豆的花盆从根基部到盆底用PVC膜封扎。 1.2 气孔开度和导度测定

处理后取柜外和柜内植株顶部往下第2片复叶上的叶片，用镊子轻轻撕取下表皮于载玻片上，滴上一滴生理盐水，盖上盖玻片，将制好的载玻片置于光学显微镜（Nikon Eclipse E200）下观察，中倍镜下用测微尺测量气孔开度，每个叶片测量40个气孔，取平均值。选取活体植株同部位的叶片，用CI-340便携式光合作用测量仪（美国）进行气孔导度的测定。 1.3 叶片H₂O₂含量和抗氧化酶活性测定

称取0.5 g叶片，加1 mL预冷的丙酮匀浆，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min,取l mL上清液，加3 mL萃取剂（体积比CCl₄∶CHCl₃=3∶1）混匀，再加5 mL ddH₂O,混匀，4000 r·min^-1离心1 min,上层水相为H₂O₂待测液，H₂O₂含量采用二甲酚橙法测定^[19],以μmol·g^-1 FW表示。称取0.5 g叶片，加2.5 mL预冷的磷酸缓冲液（50 mmol·L^-1 pH 7.4）匀浆，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min,上清液为酶提取液。过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性测定参照陈家长等^[20]的方法，以OD240每分钟减少0.1的酶量为一个酶活力单位（U）;超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性测定参照卫麦霞等^[21]的方法，SOD活性以抑制NBT光化还原的50%为一个U;POD活性以OD₄₆₀每分钟增加0.01为一个U;抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）活性测定参照沈文庵等^[22]的方法，以每分钟氧化1 μmol ASA的酶量为一个U.酶活性单位均以U·min^-1·g^-1 FW表示。 1.4 保卫细胞中H₂O₂的荧光显微定位观察

参考张小莉等^[23]的方法加以改进。剪取顶部往下第二片复叶上生长状态好的叶片，用dd H₂O洗净，撕取下表皮，用毛笔轻轻刷去叶肉细胞，在 Tris 缓冲液（10 mmol·L^-1 Tris,50 mmol·L^-1 KCl,pH 6.1）中培养5 min.探针孵育时，从Tris 缓冲液中取出表皮条，放入装有1 mL 探针负载缓冲液（10 mmol·L^-1 Tris,50 mmol·L^-1 KCl,pH 7.2）的EP管中，再加入1 mL终浓度为50 μmol·L^-1 的H2DCFDA（2′，7′-二氯氢化荧光素乙二脂）,混匀，室温避光孵育20 min.将负载H2DCFDA 的表皮条用新鲜负载缓冲液漂洗2次，以洗去细胞表层多余的探针，将表皮条放在滴加一滴负载缓冲液的载玻片上，加上盖玻片，置于荧光显微镜（Olympus CFM-400E）下观察和拍摄保卫细胞内绿色荧光的分布，激发波长420～485 nm,软件为Tsview7. 1.5 数据统计分析

所有生理生化指标测定均重复3次，用SPSS19.0对所得数据进行统计学分析，显着性差异用多重比较（Duncan）法检验。 2 结果与分析 2.1 HCHO处理下蚕豆叶片气孔开度、导度和H₂O₂含量的变化

分别在0、24、48、72 h对柜内和柜外蚕豆叶片的气孔开度、导度和H₂O₂含量进行测定。结果显示（图 1）,柜外蚕豆叶片的气孔开度和导度在0 h时分别为1.82 μm和38.89 mmol·m^-2·s^-1,24 h时分别降至1.65 μm和29.82 mmol·m^-2·s^-1（P<0.05）,0 h和24 h形成的差异是蚕豆从温室移到室内短时间内适应温湿度等环境条件细微变化引起的，此后气孔开度和导度不再改变（P>0.05）.与0 h时比较，HCHO处理72 h时，柜内蚕豆叶片的开度和导度分别显着下降46.3%和77.5%,24～72 h内柜内叶片的开度和导度均比相同时间柜外叶片的低。可见，柜内空气中的HCHO对蚕豆叶片的气孔开度和导度有较强的抑制作用，而且这种抑制作用随HCHO胁迫时间延长而增强。

图 1 不同时间HCHO 处理下蚕豆叶片气孔开度、导度和H2O2含量的测定结果 Figure 1 Stomatal aperture，stomatal conductance and H2O2 content of Vicia faba leaves under HCHO stresses for different time

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对不同时间柜内和柜外蚕豆叶片的H₂O₂含量进行测定，结果显示（图 1）,柜外蚕豆叶片H₂O₂含量在24 h内没有显着性差异，48 h与24 h相比，从1.46 μmol·g^-1 FW升至1.60 μmol·g^-1 FW,此后未见明显变化，说明在未受HCHO胁迫的环境中蚕豆叶片中H₂O₂含量随时间的延长增加速度比较平缓。这与正常生理状态下叶片中抗氧化酶系统的清除功能有关。与0 h时比较，柜内蚕豆经HCHO处理24 h和72 h时叶片H₂O₂含量分别显着增加28.4%和45.2%（P<0.05）;处理24~72 h期间，柜内叶片H₂O₂含量均显着高于柜外蚕豆叶片。可见HCHO胁迫对蚕豆叶片有明显的过氧化损伤作用，暴露于HCHO的时间越长，叶片产生的H₂O₂越多。 2.2 HCHO处理下蚕豆保卫细胞中H₂O₂的荧光显微定位分析

Cho等^[24]、Lü等^[25]和Tossi等^[26]以H₂DCFDA为荧光探针分别对拟南芥保卫细胞和水稻根中产生的H₂O₂进行原位显微分析，本研究通过H2DCFDA探针对蚕豆叶片H₂O₂进行显微定位检测。由图 2可见，蚕豆叶片的H₂O₂都定位于保卫细胞中（图 2a-图 2d、图 2i-图 2m）;0 h时柜外和柜内叶片保卫细胞中的荧光很暗（图 2a、图 2i）,说明正常生理状况下保卫细胞中积累的H₂O₂很少；24 h和48 h时柜内保卫细胞的胞质中荧光强度明显增强（图 2j、图 2k）,说明HCHO处理初期H₂O₂累积于胞质中；72 h时柜外蚕豆保卫细胞中的荧光主要集中于胞质中（图 2d）,柜内保卫细胞胞质和叶绿体中H₂O₂荧光强度都明显增强（图 2m）,说明随着HCHO处理时间的延长，不仅保卫细胞胞质中积累的H₂O₂增多，积累H₂O₂的叶绿体数也显着增多。H₂O₂定位于保卫细胞揭示它对HCHO胁迫下蚕豆叶片的气孔运动可能具有一定的调节作用，柜内蚕豆叶片保卫细胞的荧光强度强于相同处理时间柜外的蚕豆叶片，说明柜内HCHO胁迫诱导蚕豆保卫细胞积累了更多的H₂O₂.

图 2 不同时间HCHO 处理下蚕豆保卫细胞H2O2荧光亚细胞定位检测 Figure 2 Fluorescence subcellular localization detection of H2O2 in Vicia faba guard cells under HCHO stresses for different times

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H₂DCFDA探针对H₂O₂的特异性不强，图 2所显示的荧光可能与其他活性氧的产生和积累有关。为了进一步证实上述结果的正确性，在叶片上涂抹H₂O₂清除剂ASA,经HCHO处理后进行保卫细胞H₂O₂的荧光显微定位检测。ASA是植物体内重要的抗氧化化合物，涂抹的外源ASA可进入保卫细胞，在胞质APX催化下，ASA与H₂O₂反应，H₂O₂接受NADPH的电子得以还原成H₂O,从而清除H₂O₂的毒性。由图 3可见，涂抹ASA叶片后保卫细胞胞质中荧光强度显着低于未涂抹ASA的叶片，证实HCHO胁迫导致蚕豆叶片保卫细胞中H₂O₂的积累。

图 3 涂抹ASA 对HCHO处理下蚕豆保卫细胞中H2O2的荧光亚细胞定位检测 Figure 3 Fluorescence subcellular localization detection of H2O2 in Vicia faba guard cells under HCHO stresses for different time by daubing ASA

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为了探讨HCHO胁迫下蚕豆叶片气孔开度和导度的下降是否与保卫细胞中H₂O₂的积累有关，对柜内不同处理时间蚕豆叶片H₂O₂含量和气孔开度与导度进行了相关性分析。通过相关系数r可知，不同时间HCHO处理下积累的H₂O₂与气孔开度的r值为-0.65～-0.63,呈中度负相关（P<0.05）,与气孔导度的r值为-0.90～-0.79,呈高度负相关（P<0.01）.这说明因HCHO胁迫引起的气孔开度和导度下降与H₂O₂积累有密切相关性。为了证实气体HCHO持续处理下保卫细胞中H₂O₂积累是影响蚕豆叶片气孔开度和导度的主要因子，对涂抹ASA后经HCHO处理的蚕豆叶片进行了气孔开度、导度和H₂O₂含量的测定。结果显示（图 4）,涂抹了ASA的叶片与未涂抹ASA的叶片相比，H₂O₂含量从1.92 μmol·g^-1 FW显着降至1.45 μmol·g^-1 FW,气孔导度和开度则显着高于未涂抹ASA的叶片，分别上升21.7%和6%.对涂抹ASA后柜内蚕豆叶片H₂O₂含量与气孔开度和导度进行相关性分析，发现H₂O₂含量下降与开度的上升呈中度相关（^r=-0.76,^P<0.05）,与导度的上升呈高度相关（^r=-0.97,^P<0.01）,可见HCHO胁迫下引起的H₂O₂积累导致了气孔开度和导度的降低。

图 4 涂抹ASA 后HCHO 处理48 h 时蚕豆叶片H2O2含量和气孔开度、导度测定结果 Figure 4 H2O2 content，stomatal aperture and conductance of Vicia faba leaves under HCHO stresses for 48 h after daubing ASA

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为了探讨HCHO胁迫引起蚕豆叶片细胞内H₂O₂含量升高的原因，分别在0、24、48、72 h对柜内和柜外蚕豆叶片的CAT、SOD、POD和APX活性进行了测定。结果显示（图 5）,与0 h的柜内蚕豆叶片相比，HCHO处理24 h时柜内叶片CAT、SOD、POD和APX的活性均显着升高，分别上升7.22%、3.20%、14.77%和6.72%,说明短时间的HCHO胁迫诱导蚕豆叶片抗氧化防御机制应激性加强；此后随着时间延长，柜内叶片 CAT和APX活性一直下降，从24 h到72 h分别降低22.66%和12.85%;POD活性先上升7.64%后又降低27.07%;SOD活性开始没有发生明显变化，72 h 时从284.52 U·min^-1·g^-1 FW显着升至291.44 U·min^-1·g^-1 FW.在HCHO处理24～72 h期间，将相同时间的柜内叶片和柜外比较，24 h和48 h时柜内叶片的四种酶活性均比柜外高，72 h 时SOD活性比柜外高，但CAT、POD和APX活性比柜外低。这说明HCHO处理72 h对蚕豆叶片的这三种酶活性起到了强烈抑制作用。由上述结果可知，HCHO胁迫诱导了SOD活性，对CAT、POD、APX活性是先诱导后抑制。

图 5 不同时间HCHO 处理下蚕豆叶片CAT、SOD、POD、APX 活性的测定结果 Figure 5 Activities of CAT, SOD, POD and APX in Vicia faba leaves under HCHO stresses for different time

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本研究结果显示，HCHO处理初期CAT、POD和APX活性上升，随着处理时间延长却呈下降趋势（图 5）,可见蚕豆叶片在HCHO处理初期即表现出氧化损伤效应，这种效应在短时间内启动了蚕豆体内清除H₂O₂的抗氧化酶防御机制，但随着处理时间的延长，HCHO胁迫抑制了蚕豆体内CAT、POD和APX的活性，SOD活性却稳定上升。HCHO胁迫下四种酶活性的变化与前人的研究结果不同^{[27, 28]},这种变化使得蚕豆叶片中H₂O₂不能及时转化，导致H₂O₂的积累。

对于不同时间HCHO处理下H₂O₂在保卫细胞中的定位，短时间（48 h内）的HCHO胁迫造成H₂O₂先在胞质中积累，与以下原因有关：胞质中分布有Cu/Zn-SOD,SOD活性的升高使胞质中活性氧转化成了H₂O₂;H₂O₂具有较高的跨膜通透性^[29],由过氧化物酶体乙醇酸氧化、线粒体呼吸电子传递链、乙醛酸循环体脂肪酸β-氧化、叶绿体光化学反应等途径产生的H₂O₂可以穿膜而进入胞质^[30];质膜上的氧化还原酶系统是产生H₂O₂的重要部位，位于质膜外侧的SOD、POD、NADPH氧化酶及多胺氧化酶、质膜上还原型的电子载体等途径产生的H₂O₂也都能进入胞质^[16].HCHO处理72 h导致保卫细胞积累H₂O₂的叶绿体数量增多，主要是因为高等植物叶绿体PSⅠ假环式电子传递链的受体端存在NADPH氧化酶等，可通过位于类囊体膜上的铁氧还蛋白、黄素、喋啶和二酚等还原型组分将单电子传递给基态氧分子，从而形成超氧阴离子自由基（Superoxide anion free radical,O2·）,O2·经SOD催化歧化生成H₂O₂^{[31, 32, 33]},叶绿体中清除H₂O₂的关键酶是APX,但HCHO处理72 h后叶片中APX活性被显着抑制。

前人研究发现，盐胁迫可使植物体内H₂O₂含量增加^[34],盐胁迫下蚕豆叶片中的H₂O₂积累伴随着气孔的关闭反应^[35].韦立秀等^[14]分别用2.85、5.49 mg·m^-3的HCHO处理2种蚕豆24、48 h,发现2种蚕豆叶片的气孔开度均随HCHO浓度的增加和胁迫时间的延长而变小，但没有分析气孔开度的影响机制。该研究发现，0.46～0.72 mg·m^-3的HCHO胁迫诱导的保卫细胞H₂O₂积累抑制了气孔的开度和导度，涂抹ASA的实验表明，由于ASA的清除作用使保卫细胞中H₂O₂含量减少，气孔开度和导度即随之回升，相关系数分析也显示H₂O₂含量积累和气孔开度与导度的下降具有高度相关性。这进一步证实空气中HCHO污染引起的蚕豆保卫细胞H₂O₂积累在气孔开放信号转导过程中对气孔开度和导度的调节起到关键作用。H₂O₂积累对气孔开度和导度的抑制使得植物吸收净化HCHO的能力减弱，应用植物净化室内空气HCHO污染应消除这种抑制作用。 4 结论

（1）HCHO持续胁迫显着增强了蚕豆叶片中SOD活性，CAT、POD、APX三种抗氧化酶活性先升高后下降，使得叶片中的H₂O₂不能迅速被清除，从而导致蚕豆叶片中H₂O₂的积累增加。

（2）在0.46～0.72 mg·m^-3的HCHO处理下，短时间内蚕豆叶片细胞中产生的H₂O₂主要积累在保卫细胞的胞质中，处理时间延长到72 h,H₂O₂不仅分布于胞质，积累H₂O₂的叶绿体数量也增多。

（3）HCHO胁迫使蚕豆叶片保卫细胞中H₂O₂大量积累是导致蚕豆气孔导度和开度下降的主要原因。