近年来,随着生态农业和可持续循环农业的发展,设施番茄有机生态型无土栽培发展迅速,种植面积逐年扩大。但种植者为了降低成本,常常将栽培基质重复使用,导致番茄病虫害加重、果实品质和产量下降等连作障碍问题日益严重,成为制约番茄生态型无土栽培可持续发展的重要因素。已有研究表明,连茬栽培番茄的基质不适于番茄生长^[1]。连茬栽培时,植物残体与病原微生物的代谢产物对植物有致毒作用,并连同根系分泌的自毒物质一起影响植株生长发育,最后导致自毒作用^[2]。许多研究已证实自毒作用是导致植物产生连作障碍的重要因子之一^{[3, 4, 5]}。植物的许多部位都能合成自毒物质,并通过根系分泌、残茬腐解、淋溶、挥发等途径滞留在土壤中,影响后续种植作物的生长发育。因此,寻求适宜的缓解方法对连作障碍的深入研究有着非常重要的理论和实践意义。

抗坏血酸(AsA)是普遍存在于植物组织中的高丰度小分子抗氧化物质,在植物细胞对氧化胁迫的抵御、细胞分裂和伸长中发挥着重要作用^[6]。已有大量研究证明,活性氧产生是化感物质的主要作用机理之一^[7]。研究表明,0.5 mmol·L^-1的AsA既能缓解肉桂酸的毒性,又能缓解多种苯基羧酸类化合物对黄瓜胚根生长的抑制作用^[6];Younis等^[8]报道,外源添加AsA能提高蚕豆种子对离子胁迫和渗透胁迫的抗性;外源AsA还能提高植物对高温、臭氧胁迫及镉胁迫的抗性^{[9, 10, 11]}。但是,外源AsA能否有效提高番茄对自毒作用的抗性及其作用机理目前未见报道。本研究拟用外源AsA处理自毒胁迫下的番茄种子,分析其萌发、生长及生理指标的变化,观察根系超微结构的差异,并利用数学隶属函数模型,综合评价了不同AsA浓度的缓解效果,为进一步明确AsA缓解番茄自毒作用的机理提供借鉴,也为日光温室番茄有机生态型无土栽培基质的重复利用提供理论和技术支撑。

试验选用番茄品种为"粉冠一号",无限生长型,抗病性强,耐低温、耐热性强,是日光温室、春秋大棚和春提早中小棚栽培的最佳品种。

抗坏血酸:规格BR,含量99%,购自Sigma公司。

从甘肃酒泉戈壁绿丰农业专业合作社非耕地设施蔬菜标准园取连续种植3 a的番茄根圈基质(炉渣、菌渣、牛粪、鸡粪和玉米秸秆体积比为13颐5颐5颐2颐14的混合基质),样品风干、粉碎后过20目筛,称取25 g放入1 L锥形瓶,加入500 mL蒸馏水,密封后放入振荡器中浸提48 h (温度为25益,振荡速度为200 r· min^-1),经过滤即得到浓度为0.05 g·mL^-1的基质浸提液。贮存于4益冰箱中备用。

试验共设5个处理,分别为:(A1)0.05 g·mL^-1的基质提取液中含有0.25 mmol·L^-1的抗坏血酸;(A2)0.05 g·mL^-1的基质提取液中含有0.5 mmol·L^-1的抗坏血酸;(A3)0.05 g·mL^-1的基质提取液中含有1 mmol·L^-1的抗坏血酸;(CK1)0.05 g·mL^-1基质提取液;(CK2)1/2浓度Hoagland营养液。将经过10% H2O2消毒2 min的番茄种子置于5 mL离心管内,分别滴加各处理液3 mL,稍振荡,使种子与溶液充分接触。浸种24 h后,将每个离心管中的种子各50粒整齐地摆放在铺有两层滤纸的培养皿(直径9 cm)中,开始每皿中分别加入5 mL处理液,以后各处理每天分别添加5 mL相应的处理液。将培养皿放在智能人工气候箱(RXZ-310B)中避光培养(温度25益,湿度45%),每处理进行三次独立的生物学重复。每天用5 mL处理液冲洗培养皿中的滤纸,以保证处理浓度不变。

根据《国际种子检验规程》^[12]的要求,以处理的当天为发芽的第1 d,从第2 d起逐日统计种子发芽数,第4 d测定发芽势,第8 d测定发芽率,计算发芽指数。8 d后在光照(白天27益,夜间18益)条件下培养,第12 d时每个处理任选5株测量主根和上胚轴的长度,重复3次。剩下的幼苗继续培养到第21 d时取混合样(根茎叶)测定抗氧化酶活性、抗氧化剂和丙二醛(MDA)含量及电解质渗漏率(EL),取根尖观察超微结构。

(1)种子萌发生长指标的测定:发芽率、发芽势和发芽指数的测定参照陶嘉龄^[13]的方法;主根和上胚轴长用数显游标卡尺测定。

(2)生理生化指标的测定:超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定用氮蓝四唑法^[14];过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法^[15];抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定参照沈文飚等^[16]的方法;抗坏血酸(AsA)含量的测定参照李合生^[14]的方法;还原型谷胱甘肽(GSH)含量的测定参照Ellman^[17]的方法;MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法^[14];电解质渗漏率用相对电导率表示,用DDS-11A型电导率仪测定^[18]。

(3)根系超微结构的观察:培养21 d后,取处理A3和CK1样品的根尖,用双面刀片切成2 mm长的根段,迅速放入3%戊二醛(0.2 mol·L^-1的磷酸缓冲液,pH=7.2)固定,用真空抽气法将材料沉入固定液底部,4益保存。将固定好的样品用0.2 mol·L^-1的磷酸缓冲液漂洗3次(每次10 min),1%锇酸固定2 h,上行梯度乙醇脱水,丙酮置换浸透,Epon-812环氧树脂包埋聚合,修块切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染色,HI原TACHI透射电镜观察,每处理共观察30个视野并照相。用Leica EM UC6超薄切片机切片,JEM-1230型透射电镜观察照相。

采用Microsoft Excel 2003软件处理数据并制图,采用SPSS16.0的ANONA进行方差分析,用新复极差法(Duncan)对数据进行差异显著性分析。

各处理自毒作用的大小用隶属函数值比较^[19],综合隶属函数值越大,表明自毒作用越小

化感隶属函数值X_(ij)冤用模糊数学隶属函数值的方法计算,公式如下所列。

参照Willamson等^[20]的方法,利用化感效应指数(RI)表示自毒效应抑制率(RI>0为促进作用,RI < 0为抑制作用,绝对值大小与作用强度一致),当T逸C时,RI=1-C/T;当T < C时,RI=T/C-1。其中:C为对照值,T为处理值。

从表 1可以看出,AsA处理后,番茄的发芽率显著升高,且随着AsA处理浓度的增大发芽率逐渐增高,A1、A2和A3处理的发芽率分别比CK1提高了35.7%、43.9%和46.9%。发芽势的变化基本与发芽率一致,A1处理与A2、A3处理间的差异达显著水平;A2处理与A3和CK2差异不显著,但与CK1差异显著;A3处理与CK1间的差异达显著水平,与CK2差异不显著。不同处理的发芽指数大小为CK2>A3>A2> A1>CK1,且A3处理与CK2差异不显著,与其他所有处理差异达显著水平;A1和A2均与所有处理间差异显著。番茄幼苗主根长度变化趋势与发芽指数一致,随着AsA浓度的增大主根长度增大。幼苗上胚轴对AsA的反应没有其他指标敏感,处理后A3与CK2差异不显著,与其他处理差异达显著水平;A1、A2与CK1间的差异不显著,与A3和CK2差异显著;A1与A2两处理间没有显著性差异。

表 1 AsA 对自毒作用下番茄种子萌发和幼苗生长的影响 Table 1 Effects of ascorbic acid on germination and growth of tomato under autotoxicity stress

表选项

自毒作用下外源AsA对番茄幼苗SOD、POD及APX活性的影响不同处理间差异显著。由表 2可知,外源添加AsA后,A1、A2、A3处理的SOD活性较CK1显著升高;所有添加AsA处理的SOD活性均显著低于CK2,说明外源AsA对SOD活性的调节能力较差。与SOD活性相比,POD活性对AsA的调控更敏感,外源AsA处理后,A2与A3处理间差异不显著,且POD活性均极显著高于CK2;A1、A2和A3处理的化感效应指数分别为-0.270、0.082和0.079,说明A2、A3处理能显著提高番茄植株的POD活性。外源AsA处理后,植株的APX活性随着AsA浓度的增大而增大,且A1、A2和A3处理的APX活性均高于CK1,且差异显著;A1与所有处理间差异显著;A2与CK2处理间无显著性差异;A3处理的APX活性显著高于CK1和CK2。总体来说,各处理的化感效应指数大小为CK1<A1<A2<A3<CK2。

表 2 AsA 对自毒作用下番茄幼苗SOD、POD 及APX 活性的影响 Table 2 Effects of ascorbic acid on SOD，POD and APX activities in tomato plants under autotoxicity stress

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自毒作用下外源AsA处理后幼苗的GSH含量显著升高,且所有处理间均达到差异显著水平(表 3)。与CK1相比,A1、A2和A3处理的GSH含量分别增加了48.9%、70.9%和56.9%。番茄幼苗的GSH含量随着外源AsA浓度的升高呈先升后降的趋势,所有处理中,A2处理的GSH含量最高,为9.335滋g· g^-1,CK2次之,CK1最小,说明GSH对外源AsA的反应较敏感,当用0.5 mmol·L^-1的AsA处理时幼苗的GSH含量最大,高浓度的AsA反而会抑制幼苗的GSH含量。与GSH相比,植株体内的AsA对外源AsA的处理更敏感,当用不同浓度的外源AsA处理后,植株的AsA含量较CK1极显著升高,说明外源AsA可以直接被植株吸收利用;A2处理的AsA含量显著高于所有处理和对照,但随着外源AsA浓度的升高植株的GSH含量却急剧下降,可能是由于AsA的反作用造成的。不同处理的化感效应指数的绝对值大小为CK1>A2>A3>A1>CK2,说明A2、A3处理可促进植株GSH的合成和转化。

表 3 AsA 对自毒作用下番茄幼苗GSH 和AsA 含量的影响 Table 3 Effects of ascorbic acid on GSH and AsA content in tomatoplants under autotoxicity stress

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由表 4可知,基质浸提液单独处理时(CK1),番茄幼苗的MDA含量显著高于未经基质浸提液处理的(CK2),增加了212.3%。与CK1相比,含有不同浓度抗坏血酸的浸提液处理均可降低自毒作用下MDA的含量,其中以A3含量最低,比CK1降低了67.5%,表明抗坏血酸处理(A3)可以显著减轻由于自毒作用而造成的膜脂过氧化作用。电解质渗漏率(EL)的变化趋势与MDA基本一致,与单一基质浸提液处理相比(CK1),含有抗坏血酸的基质浸提液处理后,EL均有所降低,且随抗坏血酸浓度的增大而降低,但A3与CK2处理间差异不显著。

表 4 AsA 对自毒作用下番茄幼苗MDA 含量和电解质渗漏率（EL）的影响 Table 4 Effects of ascorbic acid on MDA content and relative conductivity in tomato plants under autotoxicity stress

表选项

从图 1可以看出,基质浸提液处理的番茄根尖细胞壁增厚,且细胞壁不完整,有破损现象(图 1 A中箭头指示方向为细胞壁受损的地方);局部细胞形状极不规则;没有发现细胞核、质体、液泡及其他结构。这表明番茄幼苗在连茬基质浸提液处理下,幼苗根尖的超微结构受到破坏。加入浓度为1 mmol·L^-1的AsA处理后,根尖细胞中发现细胞核、前质体、线粒体、液泡、基粒片层等结构(图 1C、图 1D),但细胞核边缘略显不规则,可能是由于AsA的浓度太小,还没有完全缓解化感物质造成的伤害。这表明添加外源AsA虽然不能完全消除连茬基质浸提液对根尖细胞的伤害作用,但是能在一定程度上减少伤害。

图 1 AsA 对自毒作用下番茄幼苗根尖超微结构的影响 Figure 1 Effect of ascorbic acid on ultrastructure of root tips of tomato seedling

图选项

从表 5可以看出,自毒作用下不同浓度的外源AsA处理后番茄幼苗各测定指标的综合隶属函数值大小为A1(4.968)、A2(6.044)、A3(6.753);与CK1相比,A1、A2、A3处理的各指标综合隶属函数分别增大了6.69%、29.78%和45.01%,外源AsA浓度越大增幅亦越大。所有处理各指标的综合隶属函数值大小为A3>CK2>A2>A1>CK1,说明外源AsA对由连茬基质浸提液造成的自毒作用具有缓解效应,其中A3的缓解效果最好,A2次之,A1较差。

表 5 AsA 对自毒作用下番茄各测定指标的隶属函数值 Table 5 Subjection values of ascorbic acid effect on measurement index of tomato under autotoxicity stress

表选项

AsA是普遍存在于植物组织中的高丰度小分子抗氧化物质,对植物的生长调控具有积极作用。Rudrappa等^[21]研究表明,0.5 mmol·L^-1 AsA能缓解由化感物质(没食子酸)造成的拟南芥生物量的降低,使其地上、地下部鲜重提高80%;此外,AsA能有效清除没食子酸处理后产生的大量H2O2,使解体的细胞骨架恢复正常。张韵^[6]报道,0.25~1 mmol·L^-1的外源AsA能减弱自毒物质造成的黄瓜胚根伸长受抑制现象,且以0.5 mmol·L^-1效果最佳。本研究结果同样表明,0.25、0.5、1 mmol·L^-1的外源AsA对由连茬基质浸提液造成的番茄种子萌发和幼苗生长受抑制作用具有缓解效应,其中1 mmol·L^-1的缓解效果最好。这与Rudrappa^[21]、张韵^[6]等的研究结果不太一致,可能是由于研究的作物、方法及测试的指标、试验的环境和条件等不同造成的。

AsA能够直接或间接地清除活性氧^[22],维持植物体内细胞的氧化还原处于动态平衡。化感物质常引起活性氧的产生、引发氧化胁迫,使植物种子的萌发和生长受阻^[7]。我们之前的研究表明,0.05 g·mL-1的连茬基质水浸液能显著抑制叶片叶绿素含量、幼苗SOD和APX酶活性及根系活力,进而抑制番茄植株生长。Ding等^[23]报道,黄瓜根系分泌的自毒物质能加速活性氧的大量产生,造成生长量显著降低。活性氧与植物体内的抗氧化酶系统关系密切^[24],有研究表明抗氧化酶活性是鉴定植物抗逆性强弱的重要指标^[25],SOD、POD和APX是植物体内主要的保护酶^{[26, 27]},其中SOD可以将O^-₂·歧化,转化为H₂O₂,而APX可以清除H₂O₂。在本研究中,外源添加不同浓度的AsA能提高基质水浸液处理下番茄幼苗的SOD、POD、APX酶活性,且以1 mmol·L^-1的效果最好,还发现POD酶对植株AsA的调控比SOD更敏感。这说明外源AsA能刺激番茄植株内的SOD、POD、APX酶活性,从而消除植株体内的氧自由基,起到缓解水浸液胁迫的作用。

提高植物体内的抗氧化物质含量是提高植物抗逆性的重要措施之一^[28]。还原型谷胱甘肽(GSH)是植物体内一种必需的代谢物和调节物^[29],是植物体内广泛存在的一种重要抗氧化物质。赵娟等^[30]报道,植物体内GSH水平的高低与植物对胁迫的耐受性密切相关,其在组织中的含量变化可以作为植物是否遭受氧化胁迫的标志^[31]。本研究结果表明,基质浸提液胁迫下外源添加AsA能显著提高植株的GSH含量,其中以0.5 mmol·L^-1 AsA处理的植株GSH含量最大。与GSH相比,植株内源AsA对外源AsA的处理更敏感,当用外源AsA处理后,植株的AsA含量较浸提液处理极显著升高,说明外源AsA被提供到AsA-GSH循环,使植株AsA的合成和转化加快。本研究发现,外源AsA浓度为0.5 mmol·L^-1时植株的AsA含量最高,1 mmol·L^-1处理的含量降低,说明外源AsA的添加可以影响自毒作用下番茄植株内源AsA的含量,高浓度外源AsA使内源AsA降解速度加快,或使内源AsA的合成和转化受阻。

MDA是直接反映膜脂过氧化的指标之一,其含量的高低反映了细胞氧化损伤的程度。本研究结果表明,单一基质浸提液处理后番茄幼苗的MDA含量和电解质渗漏率显著增高,说明细胞膜系统受到严重伤害;当用含有不同浓度抗坏血酸的基质浸提液处理后,MDA含量和电解质渗漏率均显著降低,且以高浓度(1 mmol·L^-1)处理效果最好,说明外源抗坏血酸显著降低了幼苗MDA的积累和电解质外渗,维持了自毒作用下番茄幼苗细胞膜系统的稳定性。

逆境条件下,细胞器结构会被破坏,并将最终导致细胞相关生理功能的降低甚至丧失^[32]。本试验结果表明,连茬基质水浸液处理下根尖细胞受到伤害,细胞壁有破损,没有细胞核、质体、液泡及其他结构,这种细胞形态结构的改变是自毒作用下番茄的重要生理反应之一。自毒胁迫下加入浓度为1 mmol·L^-1的AsA后,减轻了伤害症状,细胞中发现细胞核、前质体、线粒体、液泡、基粒片层等结构,说明AsA降低了基质浸提液对细胞结构的负作用,发挥了保护作用。

外源AsA处理引起自毒胁迫的番茄幼苗产生一系列的积极应答,种子发芽率、发芽势和发芽指数升高,幼苗主根和上胚轴生长加快,植株抗氧化酶(SOD、POD、APX)活性和抗氧化剂(AsA、GSH)含量升高,MDA含量和电解质渗漏率均降低,对幼苗根系结构的不良影响减少,能维持其正常的生理功能,有效缓解了自毒胁迫造成的伤害。本试验所有处理各指标的综合隶属函数值分析表明,1 mmol·L^-1的AsA对番茄自毒作用的缓解效果最好,但此浓度是否为最佳浓度还有待进一步研究验证。