三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国海水养殖的主要品种，其肉味鲜美，营养丰富，颇受消费者的喜爱，也是重要的出口创汇品种，养殖前景十分广阔。随着养殖集约化程度的提高，投喂频率增加、消毒剂和药物的滥用以及不适当的管理方法使得养殖环境日益恶化，时常爆发不明原因大规模死亡现象，严重阻碍了梭子蟹养殖的健康和可持续发展。

据资料显示，许多病害的发生并不是由某种具体的病原体造成的，异常的温度、盐度、溶氧或环境中的毒性污染物才是引起水产动物批量死亡的主要原因^[1].近年来，由于各种工业废水和固体废弃物渗出液大量地排入水体以及在水产养殖中经常使用硫酸铜进行清塘灭藻和病害防治，所以养殖水体中Cu²⁺含量越来越高，已成为我国水产养殖的主要污染物。水域中过量的Cu²⁺不仅可以诱导养殖动物体内积累大量活性氧自由基，造成组织细胞损伤和生长发育障碍，而且使养殖动物免疫力大大下降^{[2, 3, 4, 5]}.目前国内外已有许多关于Cu²⁺对水产养殖动物生态毒理学方面的研究报道^{[4, 6, 7]},但大多针对鱼类和虾类，研究的内容也主要集中在Cu²⁺的急性毒性及对鱼类生长发育的影响^{[4, 8]}.关于水体Cu²⁺对蟹类毒性和生理功能影响方面的研究资料很少^{[9, 10, 11, 12]},而有关梭子蟹的仅见陈寅儿等关于Cu²⁺在三疣梭子蟹体内的毒性效应和积累的研究报道^[13].本文通过测定不同浓度水体Cu²⁺胁迫下三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉等主要组织活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）的变化，探讨水体Cu²⁺对三疣梭子蟹主要组织氧自由基水平和抗氧化能力的影响规律，以期为水体Cu²⁺污染的早期检测及生态风险评价提供理论基础，也为三疣梭子蟹养殖环境的人工调控和健康安全养殖模式的建立提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 实验用蟹

三疣梭子蟹购于浙江宁波水产市场，蟹体健康活力强、附肢完整，雄性，蟹龄C₁₀-C₁₂,体重（132.19±14.63）g,置于 60 cm×50 cm×40 cm 的塑料水槽中暂养1 d后进行实验。实验所用海水用海水晶配制（Cu²⁺≤0.001 mg·L^-1）,水温（18±1）℃，盐度22±1,pH 7~8,实验期间不投饵，用充气泵不间断充气。每日及时吸去排泄物，换水50%. 1.2 主要药品和试剂

活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）和考马斯亮蓝蛋白等测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；硫酸铜（Cu₂SO₄·5H₂O）为分析纯，用蒸馏水配成10 g·L^-1 Cu²⁺储备液，实验时根据需要用人工海水稀释到所需浓度；海水晶由上海保嘉生化技术有限公司金坛分公司生产。 1.3 主要仪器设备

微量移液器、漩涡混匀器、恒温水浴锅、分析天平、可见分光光度计（722S,上海精密科学有限公司）、冷冻离心机（Eppendorf 5430R,Germany）. 1.4 Cu²⁺梯度设置

根据渔业水质标准GB 11607-1989（Cu²⁺≤0.01 mg·L^-1）、急性毒性试验、预试验及宁波地区梭子蟹养殖池塘水域Cu²⁺含量。本实验设置4个Cu²⁺处理组和一个对照组，处理组Cu²⁺浓度分别为0.04、0.4、2、4 mg·L^-1,各处理组浓度均大于渔业水质标准要求，每个处理组设置两个平行组，另外设置一个0 mg·L^-1 的对照组，每组50只蟹。 1.5 样品采集和处理

在Cu²⁺胁迫后0、6、12、24、48、72、96 h时分别从每组中取6只蟹，用吸水纸吸干蟹体表水分，置于冰盘内，用消毒过的剪刀剪开背壳，快速取出全部鳃、肝胰腺和头胸部肌肉，再用4 ℃ 90%的灭菌生理盐水洗净、吸水纸吸干后置于洁净样品袋中于-40 ℃冷冻保存。实验时将各样品于4 ℃冰箱中解冻，用分析天平准确称取0.4 g各组织分别移入无菌离心管中，加入9倍体积的预冷生理盐水冰浴匀浆1min（12000r·min^-1）,然后于 4 ℃ 6000r·min^-1 离心15 min,取上清酶液分装备用^[14]. 1.6 ROS含量、总SOD活性及T-AOC的测定

组织ROS含量、总SOD活性、T-AOC及组织匀浆粗提取液蛋白的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，具体测定方法按说明书进行。

ROS含量定义为：在37 ℃下每毫克组织蛋白每秒钟使反应体系中双氧水浓度降低1 μmol为一个抗活性氧单位（U·mg^-1）.SOD活性定义为：在37 ℃下每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U·mg^-1）.总抗氧化能力（T-AOC）单位定义为：在37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度值（OD）增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位（U·mg^-1）. 1.7 数据处理

所有结果均以两个平行组数据的平均值±标准偏差（Mean±SD）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan检验法进行数据差异性检验。统计学分析均采用SPSS 13.0 软件完成。 2 结果与分析 2.1 水体Cu²⁺对三疣梭子蟹鳃ROS含量的影响

不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹鳃ROS含量的变化见图 1,各实验组鳃ROS变化的趋势均不相同。与对照组相比，0.04 mg·L^-1 组鳃ROS含量略有升高，但无显着差异；0.4 mg·L^-1组呈下降-恢复的变化趋势，各实验时间点也未呈显着变化；2.0 mg·L^-1 组在实验12 h内呈下降趋势，实验进行24 h后逐渐升高，48 h后显着高于对照组（P < 0.01）,96 h时鳃ROS含量为（347.63±23.26）U·mg^-1,是对照组的7.1倍；4.0 mg·L^-1 组随着实验时间的延长呈逐渐升高趋势，实验12 h时已显着高于对照组，实验96 h时为（402.59±14.21） U·mg^-1,是对照组的8.2倍。

图 1 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹鳃ROS 含量的变化 Figure 1 Changes of ROS content in gill of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肝胰腺ROS含量的变化见图 2,各实验组肝胰腺ROS含量变化趋势与鳃相同。0.4 mg·L^-1和2.0 mg·L^-1组肝胰腺ROS含量在实验48 h时分别为（76.39±9.08）U·mg^-1和（60.49±11.75）U·mg^-1,与对照组相比下降了约35%和48%（P < 0.01）,其后0.4 mg·L^-1组逐渐恢复到正常水平，而2.0 mg·L^-1组72 h后已显着高于对照组，至实验96 h时为（246.51±23.49）U·mg^-1,是对照组的2.2倍；4.0 mg·L^-1组随着实验时间的延长呈逐渐升高趋势，实验12 h时已显着高于对照组，实验96 h时为（422.49±49.90）U·mg^-1,是对照组的3.8倍。

图 2 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肝胰腺ROS 含量的变化 Figure 2 Changes of ROS content in hepatopancreas of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肌肉ROS含量的变化见图 3,各实验组肌肉ROS含量变化趋势基本与鳃和肝胰腺相同。0.4 mg·L^-1组和2.0 mg·L^-1组肝胰腺ROS含量分别在实验48 h和24 h时降到最低，为（60.84±9.62）U·mg^-1和（59.19±20.43）U·mg^-1,与对照组相比下降了31%和33%（P < 0.01）,其后逐渐上升，2.0 mg·L^-1组在实验48 h后已显着高于对照组，至实验96 h时为（301.27±21.78）U·mg^-1,是对照组的3.4倍；4.0 mg·L^-1组随着实验时间的延长呈逐渐升高趋势，实验12 h时已显着高于对照组，实验96 h时为（379.79±26.14）U·mg^-1,是对照组的4.3倍。

图 3 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肌肉ROS含量的变化 Figure 3 Changes of ROS content in muscle of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹鳃SOD活性的变化见图 4.各实验组鳃SOD活性均呈现先升后降的变化趋势，Cu²⁺浓度越高鳃SOD活性达峰时间越早。低浓度Cu²⁺（0.04 、0.4 mg·L^-1）对鳃SOD活性总体呈诱导作用，在实验期间鳃SOD活性均高于对照组，峰值出现在实验72 h,分别为（480.65±17.35）U·mg^-1和（446.04±40.55）U·mg^-1,较对照组分别提高了79%和67%（P < 0.01）;高浓度Cu²⁺（2.0、4.0 mg·L^-1）鳃SOD活性峰值分别出现在实验24 h 和12 h,为（377.82±37.29）U·mg^-1和（418.74±47.18）U·mg^-1,较对照组提高了42%和56%（P < 0.01）,之后鳃SOD活性开始下降，实验48 h后两组的鳃SOD活性都显着低于对照组，呈抑制趋势。

图 4 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹鳃SOD活性的变化 Figure 4 Changes of SOD activity in gill of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肝胰腺SOD活性的变化见图 5.各实验组肝胰腺SOD活性变化趋势与鳃基本相同，但各组的SOD活性达峰时间更早，且Cu²⁺浓度越低诱导作用越强。0.04、0.4、2.0 mg·L^-1三组对肝胰腺SOD活性总体呈诱导作用，在实验时间内肝胰腺SOD活性均高于对照组，峰值出现在实验48 h和24 h,分别为（260.44±27.25）、（282.69±17.21） U·mg^-1和（205.55±11.34）U·mg^-1,较对照组分别提高了238%、267%和174%（P < 0.01）;4.0 mg·L^-1组肝胰腺SOD活性呈先诱导后抑制的变化趋势，峰值出现在实验6 h时，为（139.15±15.43）U·mg^-1,较对照组提高了82%（P < 0.01）,之后肝胰腺SOD活性开始下降，实验72 h后低于对照组。

图 5 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肝胰腺SOD 活性的变化 Figure 5 Changes of SOD activity in hepatopancreas of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肌肉SOD活性的变化见图 6,各实验组肌肉SOD活性变化趋势不同。与对照组相比，0.04 mg·L^-1组肌肉SOD活性在整个实验时间内基本没有明显变化，0.4 mg·L^-1组肌肉SOD活性随着实验时间的延长逐渐增强，实验96 h时达到峰值（200.26±20.45）U·mg^-1;2.0 mg·L^-1组肌肉SOD活性呈先升后降的变化，峰值出现在实验24 h时，为（183.36±13.58）U·mg^-1（P < 0.01）,实验78 h后基本恢复正常水平；而4.0 mg·L^-1组肌肉SOD活性呈先诱导后抑制的变化趋势，峰值出现在实验12 h时，为（99.85±6.18）U·mg^-1（P < 0.01）,实验48 h后显着低于对照组（P <0.05）.

图 6 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肌肉SOD活性的变化 Figure 6 Changes of SOD activity in muscle of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹鳃T-AOC的变化见图 7.与对照组相比，0.04 mg·L^-1组鳃T-AOC呈诱导趋势，随着实验时间的延长逐渐升高；其他三组鳃T-AOC均呈先升高后降低的变化趋势，0.4 mg·L^-1和2.0 mg·L^-1组在实验24 h时达到峰值，分别为（26.69±6.12）U·mg^-1 和（18.71±2.74）U·mg^-1,是对照组的3.5倍和2.5倍，且鳃T-AOC在整个实验时间内均明显高于对照组；而4.0 mg·L^-1组在实验12 h时达到峰值（17.78±1.15）U·mg^-1,是对照组的2.5倍，其后逐渐下降，实验96 h时已恢复至对照组水平。

图 7 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹鳃T-AOC 的变化 Figure 7 Changes of T-AOC content in giu of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肝胰腺T-AOC的变化见图 8.与对照组相比，0.04 mg·L^-1和0.4 mg·L^-1组肝胰腺T-AOC呈先升后降的变化趋势，都在实验6 h时达到最大值，分别为（151.35±23.28）U·mg^-1和（95.61±10.68）U·mg^-1,是对照组的2.3倍和1.4倍。2.0 mg·L^-1 和4.0 mg·L^-1组肝胰腺T-AOC随实验时间的延长呈逐渐降低的变化趋势，T-AOC水平被显着抑制，且与实验时间呈负相关。

图 8 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肝胰腺T-AOC的变化 Figure 8 Changes of T-AOC content in hepatopancreas of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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不同浓度Cu²⁺胁迫后三疣梭子蟹肌肉T-AOC的变化见图 9.Cu²⁺ 0.04 mg·L^-1和0.4 mg·L^-1组T-AOC随实验时间的延长呈先升后降的变化趋势，并均在6 h时达到峰值，分别为（23.41±3.39）U·mg^-1和（26.97±5.01）U·mg^-1（P<0.01）.Cu²⁺ 2.0 mg·L^-1和4.0 mg·L^-1组T-AOC随实验时间延长呈抑制趋势，与实验时间呈负相关。

图 9 Cu2+胁迫下三疣梭子蟹肌肉T-AOC 的变化 Figure 9 Changes of T-AOC content in muscle of Portunus trituberculatus under Cu2+ stresses

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ROS是需氧生物在代谢过程中产生的比氧活泼的含氧活性物质，主要有超氧阴离子自由基（O^-₂·）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（OH-）等，它们不仅在机体细胞、组织和器官的发生、生长过程中发挥着重要的作用，而且还参与凝血酶原和胶原蛋白的合成、核苷酸的还原、体内药物和毒物的解毒过程及杀菌等作用^[15].当生物体受到环境中某些污染物胁迫时，机体受刺激会产生大量活性氧自由基，但过量的ROS就会引起机体组织细胞氧化应激反应造成生物大分子物质损伤，甚至引起疾病和死亡，而机体为保持活性氧自由基平衡，就必须通过抗氧化防御体系及时清除过量的活性氧自由基^{[4, 15, 16]}.本实验结果表明，正常情况下三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织中的活性氧含量相对稳定，且为肝胰腺>肌肉>鳃。作者认为这与各组织的生理功能密切相关，肝胰腺是物质代谢的中心，肌肉产生力并导致运动，它们在执行生理功能时都会产生ROS,另外由于蟹循环系统为开放式，肝胰腺和肌肉中会有血淋巴细胞，也会产生ROS;而鳃是外源性器官，主要功能是呼吸，正常情况下其ROS含量远低于肝胰腺和肌肉。本实验结果还显示，在0.04、0.4 mg·L^-1水体Cu²⁺作用下，三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量相比对照组没有显着变化，在2、4 mg·L^-1水体Cu²⁺作用下，会导致梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量显着升高，且升高的幅度与Cu²⁺浓度成正比。这说明低于0.4 mg·L^-1的水体Cu²⁺在三疣梭子蟹抗氧化解毒能力的可控范围，对三疣梭子蟹组织细胞不会造成明显损伤；但高于2 mg·L^-1的水体Cu²⁺已对梭子蟹主要组织细胞造成损伤，三疣梭子蟹抗氧化解毒能力下降。

SOD是目前发现的唯一以超氧阴离子自由基（O-2·）为底物的酶^[5],也是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，它在生物抗氧化酶类中处于核心地位，可催化O^-₂·转化为H₂O2和O₂,从而清除O^-₂·^[17].本实验结果显示，正常情况下梭子蟹三种组织的SOD活性为鳃>肝胰腺>肌肉，与Dandapat等^[18]研究的罗氏沼虾和潘鲁青等^[19]研究的中华绒螯蟹结果一致。作者推测由于鳃主要用于呼吸作用，有氧呼吸的氧化磷酸化过程主要产生超氧阴离子自由基（O^-₂·）,会诱导SOD的大量产生；而肝胰腺和肌肉在执行正常生理功能时会产生多种ROS,不同ROS诱导的抗氧化酶不一定相同，如它们可通过诱导SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSP-Px）、谷胱甘肽转硫酶（GST）等多种抗氧化酶来清除不同的ROS,因此其中产生的SOD含量可能低于鳃。另外，从实验结果还可看Cu²⁺ 0.04、0.4 mg·L^-1实验组对鳃、肝胰腺、肌肉SOD活性总体呈诱导趋势，而Cu²⁺ 2、4 mg·L^-1实验组仅在实验24 h内对三种组织SOD活性具有一定的诱导作用，且诱导作用与浓度成反比；4 mg·L^-1实验组在实验48 h后SOD活性呈现明显被抑制现象，与吴众望^[20]和姜令绪^[21]的实验结果一致。

T-AOC包括抗氧化酶系统和非酶促抗氧化系统两个部分，它主要通过消除活性氧自由基避免引发脂质过氧化、分解过氧化物阻断过氧化链、除去起催化作用的金属离子等途径起抗氧化作用，是水生动物抗氧化应激的生物标志性指标^[22].正常情况下，由于机体不同组织执行不同生理功能，它们的总抗氧化能力（T-AOC）存在差异。孔祥会等^[14] 研究表明锯缘青蟹中T-AOC表现为肝胰腺>肌肉>鳃，谭树华等^[23] 研究也显示克氏原螯虾中肝胰腺的T-AOC高于鳃。本实验的结果也证实，水体Cu²⁺为0 mg·L^-1时梭子蟹T-AOC表现为肝胰腺>肌肉>鳃。这与它们的生理功能是一致的，因为肝胰腺是三疣梭子蟹生理代谢活动的中心，它需要丰富的抗氧化酶和抗氧化物的种类和数量来清除物质代谢和能量代谢过程中产生的大量氧化产物，维持机体内环境的稳定，所以T-AOC最高；肌肉运动需要ATPase产生大量能量，产能过程中伴随着糖酵解和氧化磷酸化，会产生活性氧自由基和其他氧化产物，也需要多种抗氧化酶和抗氧化物质来清除，因此T-AOC次之；而鳃以产生超氧阴离子自由基为主，其他代谢物少，抗氧化物质主要是SOD,所以鳃T-AOC最小。另外，本实验结果也显示，Cu²⁺ 0.04、0.4 mg·L^-1实验组对三疣梭子蟹三种组织T-AOC均具一定的诱导作用，Cu²⁺ 2、4 mg·L^-1实验组仅对鳃T-AOC有促进作用，而对肝胰腺和肌肉T-AOC却具明显的抑制作用，在实验时间内呈下降趋势。可见Cu²⁺对肝胰腺和肌肉T-AOC的影响大于鳃，与谭树华等^[23]和李艳东^[24]研究Cd2+对克氏原螯虾和中华绒螯蟹组织T-AOC影响的结果类似。

本实验结果也说明三疣梭子蟹组织SOD活性和T-AOC均具有明显的“毒物兴奋效应”^[25],Cu²⁺低浓度刺激或高浓度短暂的刺激均能诱导梭子蟹组织SOD和T-AOC活性增加，但高浓度长时间的Cu²⁺胁迫会使机体产生大量的活性氧自由基和丙二醛等有毒有害物质，而过量的自由基数量和其他有毒有害物质超过了机体抗氧化体系的还原能力，结果导致机体组织细胞损伤，使酶的合成受影响，SOD和T-AOC活性下降。 4 结论

低浓度水体Cu²⁺对三疣梭子蟹不会造成明显损伤，但高浓度水体Cu²⁺对三疣梭子蟹会造成一定损伤。Cu²⁺低浓度刺激或高浓度短暂的刺激对三疣梭子蟹抗氧化能力具有一定诱导作用，但高浓度长时间的Cu²⁺胁迫使三疣梭子蟹抗氧化体系受损，从而导致机体组织细胞损伤。因此，合理的水体Cu²⁺调控是三疣梭子蟹健康养殖的关键。