土壤团聚体是土壤有机质保持的场所，土壤团聚过程决定了土壤有机碳被保护的程度^[1],通过二者关系研究有助于揭示土壤固碳机制。土壤有机碳的固定和稳定是物理、化学和生物化学共同作用的过程，土壤有机碳能够被保护而免于分解是通过四种机制：吸附在粘土上（化学保护）;进入团聚体内（物理保护）;转移和储存在地下，特别是Bh层；经过生物化学的转化产物能够抗微生物分解（生化保护）^[2].其中，土壤有机碳通过物理保护进入团聚体中，关于团聚体与有机碳之间相互关系的研究较多^{[3, 4, 5, 6, 7]}.土壤团聚体也是土壤有机质通过生物化学转化机制形成腐殖物质的场所，腐殖物质富含各种官能团并与矿物表面相互作用，被认为是能抗微生物分解的主要的固碳物质^[8].腐殖物质只有被禁锢在团聚体中，才能保持其持久性；反过来，由腐殖物质参与形成的团聚体会变得更加稳定，这可能是土壤固碳的最重要机制^[9].目前，从生物化学保护机制出发，研究腐殖物质与土壤团聚体间关系的较少，主要聚焦于团聚体中胡敏酸的研究^{[10, 11, 12]}.与胡敏酸相比，尽管富里酸（FA）分子量较小，芳化度和缩合程度较低^[13],但因其也富含脂肪族与芳香族的结构，能够抵抗微生物对其分解^[14],在土壤有机碳固定、养分贮蓄和土壤结构的保持方面仍具有重要作用，所以不应忽视土壤团聚体中FA的相关研究。

玉米秸秆还田避免秸秆焚烧，既能减少雾霾、提高空气质量，也能藏碳于土，减少温室气体排放，同时玉米秸秆还田作为增加土壤有机碳和培肥土壤的重要措施已经得到广泛推广应用，秸秆碳的矿化和腐殖化作用势必对土壤腐殖质的组成和性质产生影响^[15].

本文从生物化学保护机制出发，通过元素分析、热重分析及其红外光谱分析研究了黑土添加玉米秸秆培养后，土壤及其不同粒级团聚体中FA的分子结构特征，为进一步探讨腐殖物质与团聚体之间的关系及土壤团聚体的固碳机制提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料

供试黑土（样品黏淀湿润软土）于2005年4月采自吉林省农业科学院国家黑土肥力与肥料效益监测基地（43°30′N,124°48′E）,在长期定位试验（始于1980年）不同施肥处理中的对照处理（不施肥，种植玉米）地块0~20 cm土壤，拣出碎石、砂砾和植物残体，风干，部分土样研磨、过筛，用于土壤基本性质测定，其余样品保存待用。取样地所处的气候条件为温带半湿润大陆性季风气候，年降水570 mm,年均温5.6 ℃。土壤基本性质如下：土壤有机质18.81 g·kg^-1,全氮 1.55 g·kg^-1,碱解氮 109.40 mg·kg^-1,有效磷 42.84 mg·kg^-1,速效钾 114 mg·kg^-1,pH 6.50.砂粒（2000~20 μm）39.08%,粉粒（20~2 μm）29.87%,粘粒（<2 μm）31.05%,土壤质地为壤质粘土，容重1.20 g·cm^-3.

供试玉米秸秆采自吉林农业大学试验田，烘干、粉碎，过250 μm筛。该玉米秸秆含有机碳 442.30 g·kg^-1,全氮 5.60 g·kg^-1,C/N为79. 1.2 培养试验

培养试验开始于2008年8月，设添加玉米秸秆和对照（未添加玉米秸秆）2个处理，每个处理3次重复。添加玉米秸秆处理为在1500 g风干土壤中加入60 g玉米秸秆（占风干土质量的4%）与7.83 g硫酸铵（调C∶N=20∶1）混合均匀，对照处理为1500 g黑土。将对照处理与添加玉米秸秆处理均用蒸馏水调至田间持水量的70%,称重，定期补水，置于25 ℃恒温室内培养360 d. 1.3 团聚体分级

采用湿筛法^[16],称取培养后的风干土样100 g,置于孔径分别为2000、250、53 μm 组成的机械自动振荡套筛的最上层（筛子直径：18 cm）,在室温条件下用蒸馏水浸润5 min,以30 次·min^-1 速度在蒸馏水中振荡2 min,上下振幅为3 cm,将筛上的团聚体冲洗到烧杯中，获得> 2000、2000~250 μm大团聚体，250~53 μm微团聚体。为获取<53 μm粉-粘粒组分，需在桶内沉降 72 h,弃去上清液后，将团聚体转移至烧杯中。将盛有团聚体的烧杯，置于50 ℃条件下烘干，称重。土壤团聚体组成及其有机碳含量见文献^[17]. 1.4 富里酸提取与纯化

称取一定量的某一粒级团聚体，加入蒸馏水振荡过滤除去水浮物，加入0.1 mol·L^-1 NaOH+Na₄P₂O₇（土∶液=1∶10）,常温下振荡10 min,静止24 h,将提取液用虹吸法吸出。用2.5 mol·L^-1的HCl调节提取液至pH=1.5,（70±2）℃条件下保温1~2 h并静置过夜，离心，上清液为FA.FA经活性炭吸附、解吸后转入电渗析仪纯化，然后通过旋转蒸发（50~60 ℃）浓缩后，用ALPHA 1-4/2-4冷冻干燥机冻干，保存在密闭样品瓶中。 1.5 化学分析

元素分析：全土及团聚体内FA的C、H、N采用德国VARIO EL-Ⅲ型元素分析仪测定，应用CHN模式，O含量采用差减法计算，并用热重分析的灰分和含水量数据进行校正。

热重分析（TGA）:用ShimazuTG-60热重分析仪测定，称取样品约1~3 mg,在200 mL·min^-1的空气流量条件下，5 ℃·min^-1由25 ℃升至110 ℃，保持60 min以确保水分全部蒸发，然后继续以 5 ℃·min^-1,由110 ℃升至600 ℃，保持30 min,用α-Al₂O₃作参比。通过计算机测量峰面积，计算失重量。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）:应用美国NICOLET EZ360红外光谱仪，采用KBr压片法测定。将待测FA纯化样品经红外灯干燥后，粉碎研磨<2 μm,与KBr粉末以1∶200的比例在玛瑙研钵中混磨后压片。扫描范围4000~400 cm^-1,分辨率4 cm^-1,32次扫描重复，扫描间隔为2 cm^-1.峰面积计算使用Omnic Version 4.1 软件包。 2 结果与分析 2.1 黑土团聚体中富里酸元素组成

根据表 1,FA主要由C、H、O、N元素组成，全土及团聚体内FA分子含C 355.23~461.13 g·kg^-1,含O 443.90~597.20 g·kg^-1,C含量低于O含量。就对照处理而言，各级团聚体中FA的C、H、N含量随着团聚体粒径的减小呈增加趋势，O含量表现为递减，构成FA元素组成的C/H 、O/C和C/N摩尔比值表现为随着团聚体粒径的减小而递减的趋势。其中，就FA的C/H摩尔比值而言，>2000和2000~250 μm大团聚体分别比250~53 μm微团聚体高20.88%和12.89%,比<53 μm粉-粘粒组分高37.50%和27.50%,表明未添加玉米秸秆土壤中，大团聚体（>2000 μm和2000~250 μm）FA分子的缩合程度高于250~53 μm微团聚体和<53 μm粉-粘粒组分。

表 1 黑土团聚体中富里酸的元素组成（不含水分与灰分） Table 1 Element composition of fulvic acid from different aggregates in black soil（oven-dry and ash free basis）

表选项

与对照相比（表 1）,黑土施入玉米秸秆后，全土FA中C、H、N含量较对照分别增加了9.04%、33.61%和34.88%,O含量减少了10.37%;其C/H 、O/C和C/N摩尔比值比对照分别减少了18.18%、17.92%和19.17%,表明玉米秸秆的添加使黑土FA 分子的缩合度和氧化度下降。玉米秸秆的添加对不同粒径团聚体中FA的元素组成也产生了影响，各级团聚体中FA的C、H、N含量较对照相比均呈增加趋势，O含量与C/H 、O/C、C/N摩尔比值分别呈下降趋势。特别是2000~250 μm大团聚体和<53 μm粉-粘粒组分中FA的H、N含量较对照提高幅度较大（H为37.56%和21.59%;N为34.55%和17.28%）,C含量提高幅度较小（11.73%和3.19%）.添加玉米秸秆处理中，对于<53 μm粉-粘粒组分而言，其FA的C/H、C/N和O/C摩尔比值均低于其他团聚体，分别低18.07%~23.60%、11.65%~19.51%和18.18%~38.46%.

在对照和添加玉米秸秆两种处理中，就FA元素组成的O/C摩尔比值而言，>2000 μm和2000~250 μm大团聚体比250~53 μm微团聚体高10.22%~40.00%,比<53 μm粉-粘粒组分高22.50%~62.50%（表 1）,表明在一定程度上，>2000 μm和2000~250 μm大团聚体FA的氧化度高于250~53 μm微团聚体和<53 μm粉-粘粒组分。 2.2 黑土团聚体中富里酸热重分析

热重分析（TGA）中，20~110 ℃低温阶段为腐殖质中束缚水分损失区域，260~350 ℃中温阶段为腐殖质分子结构中生物可降解成分如非芳香核部分脂肪族侧键与羧基的裂解区域，350 ℃以上高温阶段为芳香核裂解区域^[18].高温失重与中温失重的比值（高/中）反映FA的芳香碳/（脂肪碳+羧基碳）的比值。

根据表 2,FA除了在20~110 ℃低温区域水分失重（1.64%~12.33%）外，在高温阶段失重量低于中温阶段，表明FA分子结构中芳香结构的比例低于脂肪族与羧基结构的比例，FA的芳构化程度较低。在对照土壤中，高温阶段FA失重量随着团聚体粒径的减小呈下降趋势，>2000 μm大团聚体FA失重量分别比2000~250、250~53和<53 μm团聚体高出45.31%、47.11%和69.65%,同时，>2000 μm团聚体FA的高/中比值最高，高出其他团聚体23.91%~42.50%,表明随着团聚体粒径的减小，FA的芳香性减弱，>2000 μm团聚体FA的芳香性最强。

表 2 黑土团聚体中富里酸的热重分析 Table 2 Thermogravimetric analysis of fulvic acid from different aggregates in black soil

表选项

与对照相比，添加玉米秸秆处理中，全土FA在中温阶段失重量比对照高73.62%,高温阶段失重量低于对照17.89%,失重量的高/中比值低于对照51.85%（表 2）,表明玉米秸秆的施用增加了FA的脂族性。与不同粒径的团聚体相比，大团聚体（>2000与2000~250 μm）中FA的高/中比值高于250~53 μm微团聚体和<53 μm粉-粘粒组分，高出32.73%~93.88%,表明大团聚体FA的芳香性高于其他粒级。 2.3 黑土团聚体中富里酸红外光谱分析

FA红外光谱主要吸收峰的峰位及其归属为^[18]:3400 cm^-1为羟基伸缩振动，2920、2850 cm^-1分别为不对称与对称脂族C-H伸缩振动，1720 cm^-1为羧基的C=O 伸缩振动，1620 cm^-1为芳香C=C伸缩振动，1400 cm^-1为脂族C-H变形振动，1230 cm^-1为羧基中-OH的变形振动和C-O伸缩振动，1034 cm^-1为多糖或类多糖物质的C-O 伸缩与硅氧化合物的Si-O伸缩振动。采用分析软件对各官能团的吸收峰进行积分，用某一峰的面积占特征峰面积的百分比（相对强度）来相对反映该峰所对应的官能团的比例，并用2920/1720和2920/1620 比值来反映腐殖质分子的脂族碳/羧基碳和脂族碳/芳香碳的比值。

由图 1可以看出，对照及添加玉米秸秆处理的全土与各级团聚体FA的红外吸收谱形相似，吸收峰在3400、1034 cm^-1 处伸缩振动强烈，在2920、1720、1230 cm^-1处伸缩振动较强，在1620 cm^-1处伸缩振动弱，表明FA芳化度较低，与TGA分析一致，但含有大量的多糖、羧基。

图 1 对照（a）与添加玉米秸秆（b）处理的黑土团聚体中富里酸的傅里叶变换红外光谱 Figure 1 FTIR spectra of fulvic acid from different aggregates in black soil under control（a） and corn stalk（b） treatments

图选项

不同处理以及不同粒级团聚体中FA的某些特征峰的吸收强度存在着差异。根据表 3,就对照土壤团聚体FA而言，大团聚体（>2000和2000~250 μm）中，1720、1620 cm^-1伸缩振动强于微团聚体（250~53 μm）与粉-粘粒组分（<53 μm）,2920、1034 cm^-1伸缩振动分别弱于微团聚体和粉-粘粒组分（图 1a）,同时，大团聚体中FA的2920/1720和2920/1620特征比值均低于微团聚体和粉-粘粒组分，分别低53.00%~75.94%、70.91%~96.20%.这表明大团聚体FA的脂族碳/羧基碳和脂族碳/芳香碳特征比值低于微团聚体和粉-粘粒组分，羧基碳和芳香碳含量高于微团聚体和粉-粘粒组分，脂族碳与多糖碳含量低于微团聚体和粉-粘粒组分。

表 3 黑土团聚体中富里酸红外光谱主要吸收峰的相对强度（%） Table 3 Relative intensity of main absorption peaks of FTIR spectra of fulvic acid from different aggregates in black soil（%）

表选项

与对照相比，黑土添加玉米秸秆培养360 d后，全土FA在2920 cm^-1处的吸收峰强较对照有所增加（11.49%）,但在1620 cm^-1处吸收峰强比对照减少了68.32%,其2920/1620特征比值比对照增加了252.47%（表 3）,表明玉米秸秆的添加使黑土FA分子脂族性增强，芳香性减弱。

就添加玉米秸秆处理而言，全土及各级团聚体中FA在1720 cm^-1处伸缩振动比对照增强，其增幅达40.92%~93.90%（图 1a、图 1b,表 3）,1230 cm^-1处吸收峰强较对照有所加强（2.55%~34.24%）,而1034 cm^-1吸收峰强度比对照减少16.58%~40.94%,2920/1720特征比值较对照减少27.66%~86.10%（表 3）.除250~53 μm微团聚体外，其他粒级团聚体FA在2920 cm^-1处的吸收峰强均分别高于各自对照21.02%~27.99%;除<53 μm粉-粘粒组分外，其他三个粒级FA在1620 cm^-1处吸收峰强分别比对照减小47.62%~81.78%,2920/1620特征比值分别比对照增加34.86%~604.35%（表 3）.

在添加玉米秸秆处理中，不同粒级团聚体FA的红外光谱相比，大团聚体（>2000 μm和2000~250 μm）中FA在1620 cm^-1处吸收峰强比微团聚体（250~53 μm）与粉-粘粒组分（<53 μm）高26.59%~46.97%（图 1b,表 3）,微团聚体与粉-粘粒组分中FA的2920/1620特征比值比大团聚体高36.17%~92.28%（表 3）,表明微团聚体与粉-粘粒组分中FA的脂族碳/芳香碳的比值高于大团聚体。 3 讨论 3.1 添加玉米秸秆对黑土及其团聚体中富里酸的缩合度与氧化度的影响

在元素分析中，C/H、O/C的摩尔比值是表征腐殖物质缩合程度和氧化程度的指标，C/H、O/C的摩尔比值分别与缩合程度和氧化程度呈正比^[18].与对照相比，玉米秸秆的施用在一定程度上提高了全土FA的C、H、N含量，但O含量有所减少，C/H、O/C和C/N的摩尔比值分别较对照减少（表 1）,表明黑土中玉米秸秆的施用使FA的含氮基团有所增加，但缩合程度与氧化程度有所下降，FA的分子结构趋于简单化，与吴景贵的研究结果一致^[15].Jindaluang等^[19]研究表明C/N比值减小的有机质更易分解。对于<53 μm粉-粘粒组分而言，其FA的C/H、O/C和C/N的摩尔比值均分别低于其他粒径团聚体，表明<53 μm粉-粘粒组分的FA的缩合程度和氧化程度低于其他团聚体，但含氮基团高于其他团聚体。Galantini等^[20]对南美草原土壤通过荧光光谱分析也证实了其粉粒与粘粒中的FA是以低缩合度与弱腐殖化程度为特征的，而且粉粒与粘粒中N含量占土壤中全N含量的65%~90%^[19]. 3.2 添加玉米秸秆对黑土及其团聚体中富里酸的脂肪族与芳香族结构的影响

热重分析（TGA）是重要的热分析方法，是指在程序控温下，测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术^[18],是广泛应用于无机、有机、特别是高分子聚合物等方面的物质受热时质量下降的热分析技术^[21].因此，把TGA技术应用到土壤学研究领域，是研究腐殖物质分子结构的一种有效手段。FA在中温阶段的失重量高于高温阶段（表 2）,反映了在FA分子结构中芳香结构的比例低于脂肪族与羧基含量的总和，芳构化程度较低，与窦森等^[22]研究一致。玉米秸秆的添加使FA的高/中比值低于对照（表 2）,FA的脂族性得到提高，芳香性下降。不同粒径的团聚体之间相比，大团聚体（>2000 μm与2000~250 μm）中FA的高/中比值比微团聚体（250~53 μm）与粉-粘粒组分（<53 μm）高32.73%~93.88%,表明大团聚体FA的芳香性高于微团聚体与粉-粘粒组分。

与对照相比，土壤添加玉米秸秆后，全土及各级团聚体FA在1720、1230 cm^-1处红外吸收峰振动较对照有所加强，说明玉米秸秆的施用使FA的羧基由羧酸盐形式向氢离子饱和的形式过渡，同时游离的羧基增加^[15].玉米秸秆的添加使全土FA在2920 cm^-1处较对照有较强的吸收峰，1620 cm^-1峰强较对照减弱，2920/1620特征比值有较大幅度的增大（表 3）,表明玉米秸秆的施用能提高土壤FA的脂族性，但芳香性减弱，与TGA分析一致。吴景贵等^[15]研究表明土壤施入玉米根系与玉米秸秆提高了FA的脂肪族特征。Demyan等^{[23, 24]}研究发现，施用有机肥后土壤有机质的红外光谱在2920 cm^-1 处较不施有机肥土壤有更强吸收峰，证实有机肥的施用增加了土壤有机质的脂族性。元素分析表明玉米秸秆添加在一定程度上降低了FA的缩合度、氧化度和C/N比值，TGA及红外光谱分析结果反映了土壤施入玉米秸秆后，FA的脂族性得到提高。总之，玉米秸秆的添加使土壤FA的结构趋于简单化。

土壤添加玉米秸秆对不同粒径团聚体中FA的某些特征峰的红外吸收产生了影响（表 3）,除250~53 μm微团聚体FA在2920 cm^-1处不对称脂族C-H伸缩振动减弱外，其他粒级团聚体均较对照有所增强，表明玉米秸秆的添加增加了>2000 μm和2000~250 μm大团聚体与<53 μm粉-粘粒组分中FA的脂族碳含量。这种结果或许与不同粒径团聚体对有机质的物理、化学保护机制有关，对于大团聚体（>2000 μm和2000~250 μm）而言，Gryze等^[25]研究表明土壤中的新鲜有机物能频繁的参与到大团聚体形成过程中。Yamashita 等^{[3, 26]}通过玉米同位素标记手段证实了>250 μm大团聚体中含有来源于标记玉米植株的新碳含量较高。由于大团聚体包含了微团聚体和大团聚体内的胶结物质-粗有机质，通常大团聚体比微团聚体包含更高的土壤有机碳含量，主要是由木质素衍生物和其他的大分子如脂类、壳多糖、软木脂、微生物多糖及长链直的碳氢化合物组成的，这些进入大团聚体中的粗有机质大部分被微生物分解，部分未被彻底分解成CO2的有机碳可能通过腐殖化过程被转化成脂族碳含量较高的腐殖物质^[14].而<53 μm 组分由粉粒与粘粒组成，具有较大的比表面积和较高的永久表面电荷，能够吸附和稳定有机碳，可能有利于在<53 μm粉-粘粒组分中形成的FA富含脂族碳。

就不同粒径团聚体而言，两种处理的大团聚体FA的2920/1620特征比值均低于微团聚体与粉-粘粒组分（表 3）,表明大团聚体FA的芳香性高于微团聚体与粉-粘粒组分，脂族性低于微团聚体与粉-粘粒组分，与TGA分析结果一致。此结果或许可归因于不同粒径团聚体拥有不同尺度大小的多级孔隙单元，Lugato等^[27]研究表明，在<53 μm粉-粘粒中，富含<0.2 μm孔径孔隙，细菌难以进入；250~53 μm微团聚体是由土壤矿物颗粒在有机质和氧化物等胶结物质作用下形成的，富含微小的孔隙；许多微团聚体在生物和物理因素作用下进一步形成较大的团聚体，在微团聚体之间产生更大、更多的孔隙^[28].因此，不同粒径大小的团聚体具有不同孔隙度的多级孔隙，土壤孔隙大小分布控制气体扩散、水势和微生物的活动，强烈影响土壤有机碳的数量、重新分配及质量^[27].大团聚体中有机质的木质素成分在好气条件下通过微生物的作用缓慢降解，增加的酚基参与到腐殖物质的形成中^[29],与富含超微细孔隙的微团聚体相比，大团聚体可能更有利于所形成FA的芳香碳含量高于微团聚体。Verchot等^[30]研究发现，微团聚体（20~53 μm）有机质比其他团聚体（>212 μm和53~212 μm）倾向于有较低的羧基碳和芳香碳，与本研究结果相似。 4 结论

培养条件下黑土及添加玉米秸秆黑土团聚体中，大团聚体（>2000 μm和2000~250 μm） FA分子的氧化度高于微团聚体（250~53 μm）和粉-粘粒组分（<53 μm）,脂族碳/芳香碳比值低于微团聚体和粉-粘粒组分，与微团聚体和粉-粘粒相比，大团聚体FA分子在化学结构上芳香性较强。

黑土中玉米秸秆的添加使黑土FA分子的脂族性增强，芳香性减弱，缩合度和氧化度下降，FA分子结构趋于简单化。