自工业革命以来，大气中CO₂浓度持续增加，IPCC最新统计数据表明，到2015年全球碳排放量将接近400亿t^[1].CO₂及其他温室气体不断增加带来的温室效应对人类生存和发展的威胁日渐增大^[2].温室气体主要包括CO₂、CH₄、N₂O,其中CO₂对温室效应的贡献比例最大，约占60%^{[3, 4]}.作为受人类活动干扰最大的陆地生态系统，也是全球碳库中最为活跃的部分--农田生态系统，其CO₂排放量每年约占全球CO₂排放量的21%~25%^{[5, 6]}.因此，农田土壤碳库的转化机理及动态循环也是近年来众多学者研究的热点。

作为陆地生态系统中最大的碳库，土壤碳库包括有机和无机碳库^[7].有机碳库一般指存在于土壤中的各种含碳有机物质，能够在气候和人为作用下利用好氧条件降解并以CO₂形式进入大气，或在厌氧条件下以CH₄形式释放^[8];无机碳库主要指分布在全球干旱半干旱地区土壤中的碳酸盐类，由原生性碳酸盐和次生性碳酸盐组成^[9],前者指未经风化而直接由成土母质保存下来的碳酸盐，后者指在风化成土过程中形成的碳酸盐。由于次生碳酸盐在形成过程中可以固存大气CO₂,具有减缓温室效应的巨大潜力，使得研究干旱半干旱地区CO₂的形成与周转具有重要意义^[10].作为这些地区主要碳库形式的无机碳库，一般比该地区有机碳库大2~5倍，占全球无机碳库的92%.我国无机碳库主要分布在西北和华北地区，贮量为60~77.9 Pg,相当于全球无机碳库（700~1000 Pg）的1/15~1/20^{[11, 12]}.近年来一些培养试验发现，含有碳酸盐的土壤在不同的培养条件下有13%~40% 的CO₂来自无机碳释放^{[13, 14, 15, 16]},可见土壤无机碳在稳定全球碳库和调节CO₂浓度方面同样具有重要作用^{[17, 18]}.

自合成氨工艺发明以来，全球氮肥用量不断增加。氮肥的大量投入满足了人口增长对粮食的需求，但也带来了诸多环境问题，土壤酸化就是其中的突出问题之一^[19].我国是世界上氮肥用量最多的国家，每年的平均用量达 240 kg·hm^-2,约占世界总用量的三分之一。大量施用氮肥已改变了我国氮循环过程，到2010年我国人为投入氮素的比例已超过当年总氮量的80%^[20].石灰性土壤无机碳的释放与土壤pH值关系密切，施用生理酸性氮肥引起的土壤pH值降低，是否会对我国北方石灰性土壤无机碳的释放产生影响，尚少见报道。

利用室内培养可以较好地评价土壤碳的释放状况。由于石灰性土壤同时含有机碳和无机碳，通过灭菌抑制微生物活性能够区分土壤生物作用（有机质矿化）和非生物作用（碳酸盐分解）^[21].为此，本试验选取了陕西不同地区的四种典型土壤作为研究对象，利用培养试验探究了施用硫酸铵氮肥在未灭菌及灭菌条件下土壤pH值、矿质态氮含量及碳释放量的变化，旨在评价土壤碳、氮作用机理及效应。 1 材料与方法 1.1 供试土壤

供试土壤于2014年夏季采自陕西省不同地区，土壤类型包括塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土。其中塿土采自杨凌区西北农林科技大学农作一站试验地（ 108°04′07″E,34°17′56″N）,黑垆土采自咸阳市长武县王东村（107°40′17″E,35°14′50″N）,黄绵土采自延安市安塞县任塔村（109°15′140″E,36°51′48″N）,风沙土采自榆林市靖边县四十里铺（109°15′48.3″E,36°38′18.8″N）.采土深度均为表层0~20 cm.试验前各土壤的基本性质见表 1.

表 1 试验前供试土壤的基本理化性质 Table 1 Physicochemical properties of soils before experiment

表选项

试验设 3 个研究因素，即土壤类型、氮肥用量及灭菌。其中土壤类型为上述四种土壤；氮肥用量为 0、 0.3 g N·kg^-1,种类为（NH₄）₂SO₄（分析纯）;灭菌处理设灭菌及未灭菌 2 个水平，共计16 个处理，另外以不加土壤为空白，每个处理重复 3 次。

试验开始前，先称取足量的风干土样，调节含水量为 16% ,预培养 7 d以恢复土壤活性。试验开始时，未灭菌土壤先根据预培养前后土壤重量差值补充水分，之后根据（NH₄）₂SO₄用量加入并混匀。对于灭菌土壤，先配制好灭菌液，方法如下：配制 1∶100（W/V）的NaOH 溶液 400 mL,再加入 30.24 g的哌嗪-1,4-二乙磺酸（PIPES）生物缓冲剂溶解^[22],之后纯水定容到 1 L作为溶液A;再配制 0.1 mol·L-1 的NaOH 溶液B,将A、B按 5∶4（V/V）混合成溶液C.土壤加入HgCl2浓度为 1000 mg·kg^-1[23],按照比例为 5%（W/V）^[13]将HgCl₂ 溶解于溶液C,用溶液B调节溶液C的pH值与试验前土壤pH初始值接近，之后与土壤混匀使其充分灭菌。根据预培养所损失的总水分减去灭菌液的量，作为剩余水分的补充，以保证与未灭菌土壤含水量一致，再加入（NH₄）₂SO₄混匀。

未灭菌和灭菌土壤每个处理称取相当于 20 g 风干土的土壤放入小培养瓶中，同时将装有 10 mL 0.1 mol·L^-1 NaOH溶液的小瓶与装土的培养瓶一同放入 0.5 L的大培养瓶中加盖密封，于 25 ℃ 恒温培养箱培养。分别在培养的第 1、3、5、7、9、13、17、21、25、32、39、46 d测定各土壤 CO₂ 释放量。每次测定后更换NaOH溶液并用称重法补充土壤水分。 1.2.2 培养试验-2 与培养试验-1施肥及灭菌方法相同，共16个处理，每个处理重复3次。二者同时开始培养，每个处理称取相当于150 g风干土的土壤后加无菌透气膜封好。在培养的第1、5、9、17、25、32、39、46 d采集土壤样品，测定硝铵态氮及pH值。定期用称重法保持水分恒定。 1.3 分析项目及测定方法

CO₂释放量采用碱液吸收法测定^[24]:每次测定前向装有NaOH的小瓶加入 1.5 mL 1 mol·L^-1 BaCl₂ 使吸收的CO₂ 沉淀，再用 0.1 mol·L^-1 HCl 滴定剩余NaOH,从而间接计算出CO₂ 释放量。

CO₂-C（mg·kg^-1）=（空白耗酸量-土壤耗酸量）×CHCl×12×1000÷2÷20

土壤矿质态氮测定：每次称取土样 5.00 g,用1 mol·L-1 KCl浸提，振荡机 180 r·min^-1振荡 1 h后过滤，连续流动分析仪测定。

pH值测定：每次称取土样 10.00 g,水土比 2.5∶1,PHS-3C精密pH计测定。 1.4 数据处理

数据分析采用Microsoft Excel 2007,绘图采用Sigmaplot 12.0,方差分析采用SAS 8.0. 2 结果与分析 2.1 土壤pH值

由图 1可以看出，未灭菌条件下经过 46 d的培养，与不施氮肥相比（图 1a）,加入氮肥后（图 1b）不同类型土壤的pH值整体均有所降低；到培养结束时，不施氮与施氮的四种土壤pH平均值分别为 8.04 和 7.42,差异达显着水平（P < 0.05）.与起始pH值相比，培养结束时施氮的塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土的pH值分别降低了0.54、0.47、0.61、0.62个单位。灭菌后土壤pH值变化与未灭菌有所不同，在整个培养时间内施氮土壤与未施氮土壤相比pH值并无明显差异；培养结束时不施氮与施氮的四种土壤pH平均值分别为 7.75、7.51,虽然施氮土壤pH值也有所降低，但差异不显着（P>0.05）.相比起始pH值，培养结束时施氮的塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土的pH值分别降低了0.34、0.41、0.49、 0.41个单位（图 1d）.

图 1 未灭菌（a、b）和灭菌（c、d）条件下施氮、不施氮土壤pH 值变化 Figure 1 Soil pH in N fertilizer and no fertilizer treatments with（c，d）and without sterilization（a，b）

图选项

不加氮肥时，无论灭菌与否，四种土壤在整个培养过程中铵态氮含量极低，无显着变化，平均含量在1.55~8.10 mg·kg^-1（图 2a、图 2c）.不同土壤未灭菌加入氮肥后（图 2b）,在起始阶段铵态氮含量较高，前16 d四种土壤铵态氮平均值大小表现为风沙土>黑垆土>黄绵土>塿土，16 d之后铵态氮含量迅速降低，不同土壤已无显着差异，与氮素硝化作用的进行有关。灭菌后加入氮肥（图 2d）,不同土壤铵态氮在整个培养期内无明显变化，平均含量在209.1~299.5 mg·kg^-1,培养期间铵态氮平均值大小表现为黄绵土>风沙土>黑垆土>塿土。

图 2 未灭菌（a、b）和灭菌（c、d）条件下施氮、不施氮土壤铵态氮含量变化 Figure 2 Soil NH4+-N content in N fertilizer and no fertilizer treatments with（c, d）and without sterilization（a, b）

图选项

不施氮肥时，无论灭菌与否土壤硝态氮含量都较低（图 3a、图 3c）.未灭菌条件下施氮土壤随培养时间的延长，硝态氮含量整体呈增加趋势（图 3b）,前 5 d不同土壤含量无显着差异，5 d以后四种土壤硝态氮增幅显着，不同土壤相比表现为黄绵土>风沙土>黑垆土>塿土。与起始值相比，培养结束时塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土的硝态氮含量分别增加了 473%、685%、831%、598%.灭菌后虽然加入氮肥，但各土壤硝态氮含量并无明显增加（图 3d）,与未施氮结果差异未达显着水平，这与灭菌抑制铵态氮的硝化作用有关。

图 3 未灭菌（a、b）和灭菌（c、d）条件下施氮、不施氮土壤硝态氮含量变化 Figure 3 Soil NO3--N content in N fertilizer and no fertilizer treatments with（c, d）and without sterilization（a, b）

图选项

未灭菌条件下，不施氮土壤在 46 d培养期内CO₂ 累积释放量表现为塿土>黑垆土>黄绵土>风沙土（图 4a）.不同阶段相比，培养 13 d以后塿土释放量显着高于其他三种土壤（P < 0.05）,黄绵土和风沙土差异不显着；风沙土培养期间CO₂释放量始终最低。与不施氮相比，加入氮肥后四种土壤的释放量有了不同程度的提高（图 4b）;培养结束时，相比不施氮土壤，施氮后塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土累积CO₂释放量分别增加了26.9%、19.5%、68.8%、46.1%.与未灭菌相比，灭菌后无论施氮与否CO₂释放量都有所降低。灭菌不施氮各土壤在培养结束时平均释放量为 277.7 mg·kg^-1（图 4c）,施氮土壤平均为352.1 mg·kg^-1（图 4d）.相比灭菌不施氮土壤，灭菌施氮后塿土、黑垆土、黄绵土和风沙土在培养结束时释放量分别增加了7.3%、29.6%、56.3%、8.9%,平均增加 25.5%.

图 4 未灭菌（a、b）和灭菌（c、d）条件下施氮与不施氮土壤CO2累积释放量 Figure 4 Cumulative amount of CO2 releases in N fertilizer and no fertilizer treatments with（c, d）and without sterilization（a, b）

图选项

土壤的各种转化过程常受生物与非生物因素的影响，通常采用灭菌方法抑制微生物活性以达到区分土壤生物与非生物过程的目的。目前，应用的灭菌方法很多，包括高温高压灭菌、氯仿熏蒸、射线灭菌及HgCl₂ 固体灭菌等。但研究表明，不同方法或多或少的存在一些问题。如高温高压灭菌会导致土壤结构的变化并释放出铵态氮^[25],γ射线会影响土壤微生物体内的可溶性碳和胞外酶^[26];氯仿熏蒸虽常用于测定土壤微生物碳氮^[27],但其本身的挥发特性可能会造成灭菌的不彻底，同时其化学性质也会造成土壤可溶性有机碳氮的改变；乙烯和环氧丙烷也常用于灭菌，但会提高土壤pH值^[28];直接加入固体 HgCl₂ 又会因其本身的强酸性（pH < 3.2）而降低土壤pH值^[29].

相比之下，本试验采用 PIPES 缓冲后的 HgCl₂ 溶液进行灭菌对土壤性质的影响较小。结果表明，灭菌后施氮土壤pH值的降低幅度小于未灭菌的施氮土壤，且灭菌后施氮土壤与不施氮土壤pH值之间无显着差异；整个培养过程中硝铵态氮含量稳定，无明显变化，说明灭菌有效抑制了微生物硝化作用的进行。无论是否施氮，土壤CO₂释放量都明显降低，说明有机质矿化得到了抑制，证明该灭菌方法达到了预期效果。 3.2 土壤pH值的变化

本研究发现，未经灭菌时，施氮后四种土壤在培养结束时pH值均明显降低，其中黄绵土和风沙土的降低幅度较大，与两种土壤有机质含量低导致缓冲能力较低有关。在培养前期至中期各土壤pH值有部分升高，是由于四种土壤均为碱性土壤，加入硫酸铵后前期部分铵离子解离形成氨气，造成pH值升高^{[30, 31]},之后随着硝化作用的进行，pH值开始下降。值得注意的是，虽然本试验在培养条件下采用较高施氮量（0.3 g N·kg^-1）,但由于四种土壤均为石灰性土壤，碳酸盐的存在使其仍具有一定的缓冲能力，经过46 d的培养之后各土壤pH值仍处在碱性范围（7.42~7.51）.

相比未灭菌土壤，灭菌后土壤在培养起始阶段的pH值低于未灭菌土壤。由于HgCl2 灭菌，其固有的pH值很低（pH < 3.2）,因此本试验采用加入PIPES缓冲剂及0.1 mol·L^-1 NaOH微调的方法来缓解HgCl₂的酸性对土壤pH值的影响。但由于本方法对pH值的调节作用仅限7.2~7.7,相对于未灭菌土壤在起始阶段的pH值，加入灭菌溶液后土壤初始阶段的pH值有所偏低。 3.3 土壤矿质态氮的结果差异

未灭菌条件下加入硫酸铵，由于硝化作用的充分进行，四种土壤的铵态氮含量在两周内迅速降低，同时伴随着硝态氮的升高。黄绵土和风沙土的硝态氮增加幅度高于其他两种土壤，塿土的硝态氮含量最低，这与不同土壤有机质及矿物组成差异有关。塿土由于长期施用土粪，在原来褐土剖面基础上形成了厚为50~100 cm的覆盖层^[32],有机质含量相对较高，土壤对铵离子的生物固定作用强；同时，塿土的次生粘土矿物主要以伊利石和蛭石等2∶1型硅酸盐粘土矿物为主，对铵离子的非生物固定作用也强。黑垆土层粘土矿物以伊利石为主，对铵离子也具有固定作用。黄绵土和风沙土分布于陕北地区，由于常年受到侵蚀，耕层浅薄，相比于塿土与黑垆土，有机质含量低，且矿物组成中石英、长石等原生矿物占80%以上^[33],很少发生铵的固定，培养期间这两种土壤硝态氮含量增加幅度相对较高。 3.4 硫酸铵对不同土壤碳释放的影响

本研究发现，未灭菌条件下与不加硫酸铵相比，加入硫酸铵后各土壤CO₂释放量均有所提高。培养结束时塿土的累积释放量最大（806.4 mg·kg^-1）,四种土壤累积释放量相比不施肥土壤平均增加 40.3%,与氮肥为微生物提供充足氮源促进土壤有机质矿化有关。灭菌处理下，有机质矿化得到抑制，CO₂释放量显着降低，但相比不施氮土壤，施氮的四种土壤 CO₂最终释放量也分别增加了 7.3%、29.6%、56.3% 及 8.9%.灭菌条件下，肥料中硫酸根的存在可以与土壤H+ 结合成硫酸^[15],与土壤碳酸钙反应释放出CO₂.根据土壤溶液CO₂ 分压平衡式^[34]:

由于CaCO₃水溶度很小（0.001 5%）,在培养过程中产生的Ca²⁺饱和较快，导致在培养期间反应向左进行，也会释放出CO₂.灭菌条件下施氮，黄绵土的CO₂ 累积释放量最高，这与其表层碳酸钙含量最高有关（10.18%）,而风沙土无论灭菌与否释放量都最低，则与其表层有机质和碳酸钙含量均较低有关。

灭菌后不同土壤释放CO₂的结果表明，石灰性土壤密闭培养过程中释放的CO₂不仅能够来源于以往认为的有机质矿化，也可来源于无机碳释放，与其他学者的研究结果相似。Stevenson 等^[13]研究表明，用美国莫哈维沙漠的表层土壤（CaCO₃ 14.7%）进行 14 d培养后，有13%的CO₂来源于土壤非生物作用；Bertrand 等^[14]研究发现，对含CaCO₃ 74% 的表层土壤培养 91 d后，有 27% 的CO₂来源于无机碳；Tamir等^[15]研究显示，石灰性土壤经过 56 d培养约有 30% 的CO₂来自无机碳； Inglima等^[16]研究也发现地中海区域田间土壤释放的CO₂有15%~40% 来自无机碳。由于不同试验的土壤性质及培养条件、时间等的不同导致了结果的不同，但本试验及上述研究均表明，石灰性土壤培养过程中释放的CO₂也可来源于无机碳。若采用密闭培养评价土壤碳转化过程，忽略无机碳的作用则会造成对有机碳的矿化估计过高。因此，有必要在今后研究中采用δ13C丰度法或14C标记等方法进一步准确区分CO₂释放源于有机、无机碳的贡献比例。 4 结论

施用硫酸铵对不同土壤的CO₂释放量均有所提高。未灭菌条件下塿土释放量最高，灭菌条件下黄绵土释放量最高，与两种土壤有机质和碳酸钙含量分别最高有关。利用PIPES生物剂缓冲的HgCl₂溶液进行灭菌后，培养期间土壤矿质态氮含量稳定，说明该方法有效抑制了土壤微生物活性，阻止了硝化作用。无论灭菌与否，施用硫酸铵均提高了土壤CO₂释放量，硫酸根的酸化及土壤溶液CO₂分压作用都有可能促使无机碳转化释放。因此，施用生理酸性氮肥对我国无机碳储量巨大的西北干旱半干旱地区的影响值得重视。