1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)是应用最广泛的氯苯类化合物之一,同时也已经成为一种普遍存在的环境污染物。目前,在地下水废水、活性污泥、沉积物、蔬菜以及土壤中均已检测到了1,2,4-TCB。1,2,4-TCB具有难降解性和生物富集性。土壤受到1,2,4-TCB污染会造成可耕种土地面积的减少,进而造成粮食产量和质量的缩减。这种污染物最终还会通过食物链的传递进入人体。因此,对土壤中1,2,4-TCB降解的研究具有重要意义。许多学者研究了利用微生物降解土壤中1,2,4-TCB的方法。Schroll等^[1]从土壤中驯化分离出了以1,2,4-TCB为唯一碳源和能源的菌群,并发现该菌群对受1,2,4-TCB污染的土壤有一定的修复能力。Wang等^[2]研究了单一菌株E3和F2对土壤中1,2,4-TCB的降解效果,发现菌株F2对1,2,4-TCB有很好的降解效果。Wang等^[3]用陶土颗粒固定纯微生物和混合微生物两种方式降解土壤中的1,2,4-TCB,发现将微生物固定在陶土颗粒载体上有利于土壤中1,2,4-TCB的降解,且混合微生物效果更佳。

本文从土壤中筛选出以1,2,4-TCB为唯一碳源和能源的混合微生物,将其固着在椰壳活性炭上,形成固定化微生物。探寻由此构成的活性炭-微生物系统对土壤中1,2,4-TCB的降解效果以及活性炭对1,2,4-TCB的吸附特性。 1 材料与方法 1.1 菌种筛选

试验中所用的混合菌分离自受1,2,4-TCB污染的土壤,该土壤取自天津某化工厂生产车间的产品出厂处。培养条件见文献^[4]。最终筛选出能够以1,2,4-TCB为唯一碳源和能源的混合菌。 1.2 活性炭-微生物系统构建

先将保存的菌体接种于LB培养基中进行活化。然后收集一定量处于对数生长期的菌体制成菌悬液。称取0.4 g活性炭加入到菌悬液中,25℃、150 r·min^-1的条件下振荡,使菌体固定于活性炭上。将混合物过滤,使吸附有菌体的活性炭在室温下干燥,制备成固定化菌备用。

菌量的计量采用离心分离后的细胞湿重,通过对比吸附前后菌悬液的质量浓度来分析其吸附效果。

称取20 g含水率为10%的灭菌土壤置于250 mL具塞三角瓶中,加入12 mg·L^-1的1,2,4-TCB (甲醇助溶)8 mL,使土壤中1,2,4-TCB的含量为5 μg·g^-1。待甲醇挥发,溶液完全被土壤吸收后混匀。在无菌操作条件下,按含炭量20 g·kg^-1土壤计算,向装有含1,2,4-TCB的灭菌土壤的具塞三角瓶中分别加入0.4 g固定化混合菌和未固定化混合菌,混匀并将土壤压实,使得土壤密度为1.3 g·cm^-3,密封。将三角瓶置于25℃恒温培养。每隔2 d添加一次水,使土壤含水率达到60%,定时取样。取样后,样品经过萃取、离心、0.45 μm滤膜过滤,最后通过气相色谱进行测定。每个样品取3个平行样,并预先取定空白样。1,2,4-TCB的吸附降解率按下式计算:

称取20 g含水率为10%的灭菌土壤置于250 mL具塞三角瓶中,加入12 mg·L^-1的1,2,4-TCB (甲醇助溶)8 mL,使土壤中1,2,4-TCB的含量为5 μg·g^-1。待甲醇挥发、溶液完全被土壤吸收后混匀。按含炭量20 g·kg^-1土壤计算,加入0.4 g固定化菌的活性炭颗粒于上述三角瓶中,试验周期为23 d。每隔2 d添加一次水,使土壤含水率达到60%。每个样品取3个平行样,并预先取定空白样。取样后,样品经过萃取、离心、0.45μm滤膜过滤,最后通过气相色谱进行测定土壤中1,2,4-TCB的残留量。通过计算处理前后土壤中1,2,4-TCB的含量差与土壤中添加的活性炭量的比值来确定吸附量。采用膜传质模型、颗粒间扩散模型、准一级动力学模型和准二级动力学模型对动力学吸附结果进行拟合,模型公式如下:

膜传质模型方程:

颗粒间扩散方程:

准一级动力学方程:

准二级动力学方程:

与吸附动力学的实验条件相同,土壤中最初1,2,4-TCB的含量为5 μg·g^-1。通过加入不同体积的1,2,4-TCB使其在土壤中的最终浓度分别达到6、7.2、8.4 μg·g^-1和9.6 μg·g^-1。吸附平衡时间为5 d。每个样品取3个平行样,并预先取定空白样。取样后,样品经过萃取、离心、0.45 μm滤膜过滤,最后通过气相色谱进行测定1,2,4-TCB的残留量。通过计算处理前后土壤中1,2,4-TCB的含量差与土壤中添加的活性炭量的比值来确定吸附量。采用Freundlich吸附等温模型及Langmuir吸附等温模型对吸附等温线进行拟合,其表达公式分别为:

本试验中分别进行了24 h和48 h的吸附,结果发现24 h和48 h后活性炭对菌体的吸附量相等,均为0.75 μg·g^-1。故活性炭对菌体的吸附时间采用24 h。

为进一步确定活性炭对微生物的固定效果,对吸附菌体前后的活性炭进行电镜分析。用pH=7的磷酸缓存液对吸附有微生物的活性炭洗涤3次,每次10 min。最后一次洗涤结束后,将洗涤液和吸附有微生物的活性炭分离,再用pH=7的2.5%的戊二醛固定5 h,将固定后的附着微生物的活性炭置于室温条件下于真空干燥器中干燥2 h,最后喷金^{[5, 6]}。

图 1为吸附菌体前后活性炭的SEM电镜照片。从电镜照片可以看出活性炭在未吸附菌体时其表面干净无任何菌体,经过24 h的吸附后,活性炭表面吸附了一定量的白色菌体。

图 1 吸附菌体前后的活性炭 Figure 1 SEM images of activated carbon and activated carbon-mixed bacteria

图选项

由图 2和图 3知未固定化微生物(活性炭和游离微生物)对土壤中1,2,4-TCB的去除效果没有固定化微生物对其的去除效果好。在土壤中1,2,4-TCB初始浓度为5 μg·g^-1,反应温度为25℃,粒径1~2 mm的椰壳活性炭的条件下,利用固定在活性炭上的混合微生物对土壤中的1,2,4-TCB进行降解。经过23 d的降解,最终土壤中1,2,4-TCB的降解率可以达到48%。Wang等^[2]发现单一菌株F2在30 d内对土壤中1,2,4-TCB的降解率为39%。Schroll等^[1]的研究表明,利用土壤中的土著混合菌对1,2,4-TCB进行降解,30 d后其降解率达到62%。Wang等^[3]发现将混合菌固定在陶土颗粒上,有利于其对土壤中1,2,4-TCB的降解,但文章中没有给出具体的降解率。因试验条件不同,不同研究所得到的1,2,4-TCB的降解效率也存在差异。本试验条件下,1,2,4-TCB的降解率高于Wang等^[2]利用F2对土壤中1,2,4-TCB进行降解的降解率,可能是因为载体活性炭为微生物提供了良好的生存条件。本试验条件下,1,2,4-TCB的降解率低于Schroll等^[1]利用土壤中的土著混合菌对1,2,4-TCB进行降解的降解率,可能是因为本试验中的微生物是在实验室条件下驯化的。宋蕾等^[4]曾筛选到能够以1,2,4-TCB为唯一碳源和能源的纯菌硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens) J5-1,在1,2,4-TCB浓度为400 mg·L^-1时,J5-1对1,2,4-TCB的最大降解率接近90%。本试验条件下,1,2,4-TCB的降解率低于该值,可能是因为前者利用的是纯菌,而本试验利用的是活性炭-微生物系统。受1,2,4-TCB污染的土壤颗粒本身也可能吸附一部分1,2,4-TCB,导致这部分被土壤颗粒吸附的1,2,4-TCB很难被微生物获取利用。本研究中,降解第1~3 d,土壤中1,2,4-TCB的浓度基本没有变化。原因可能是在活性炭吸附微生物的过程中,微生物和活性炭之间的静电斥力作用已经远远超过了其间的疏水性相互作用、范德华力以及路易斯酸碱力,因此导致吸附在活性炭上的微生物较少^[7]。此时的微生物对1,2,4-TCB的降解作用不大;而且此时固定化微生物的菌体是固定在活性炭上,占据了活性炭的孔隙。Rosas等^[8]的研究表明:活性炭吸附能力的强弱与活性炭的表观表面积的大小呈正相关。此时的活性炭被微生物占据,没有更多的孔隙提供给氧气分子,不利于1,2,4-TCB的吸附。微生物也在这个反应过程中处于对土壤中污染物的适应阶段。从第3~14 d,固定化菌对土壤中1,2,4-TCB的降解进入到对数增长期,1,2,4-TCB的降解率从15%增加到45%。吸附在活性炭上的混合微生物表现出较强的存活能力,即活性炭为降解土壤中1,2,4-TCB的菌体提供了良好的生存条件。因为活性炭孔隙度大,微生物可以选择更适合自身生长的孔隙来躲避有害物质的毒害。同时微生物在代谢过程中产生胞外多糖也可躲避有害物质^[9]。吸附在活性炭上的微生物能产生一种有利于微生物之间内部沟通的信号分子,这种沟通也可能会使得固定化微生物对土壤中1,2,4-三氯苯的吸附降解度增大^[10]。第14~23 d,固定化菌对土壤中1,2,4-TCB的降解进入稳定期,微生物的量几乎不再增加,可能是因为达到一定深度的土壤中氧含量很低,不适合好氧功能菌群生存^[11]。最终土壤中1,2,4-TCB的降解率为48%,土壤中1,2,4-TCB的浓度为2.4 μg·g^-1。

图 2 固定化微生物对1,2,4-TCB的降解 Figure 2 Removal of 1,2,4-TCB by immobilized mixed bacteria

图选项

图 3 未固定化微生物对1,2,4-TCB的降解 Figure 3 Removal of 1,2,4-TCB by free mixed bacteria

图选项

以吸附量为纵坐标,时间为横坐标,得到附着微生物的活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附动力学曲线,如图 4所示。

图 4 活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附动力学曲线 Figure 4 Kinetics of 1,2,4-TCB adsorption by bacteria-activated carbon

图选项

由图可知,固着微生物的活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附降解刚开始较为快速,后期减慢。在降解的第1~3 d,固着微生物的活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附降解非常快;在降解第3~14 d时,固着微生物的活性炭对1,2,4-TCB的吸附降解速率有所下降。但在整个过程中仍表现为吸附量增加。第14~23 d,吸附量基本保持不变。

如果忽略吸附质分子从液相主体向生物吸附剂周围边界液膜的迁移过程,则一般多孔生物吸附剂的吸附过程基本上可分为三个连续的阶段:第一阶段是吸附质分子从液相向吸附剂表面扩散,也被称为膜传质;第二阶段是由吸附剂内孔隙或毛细孔中向吸附点位的扩散;第三阶段是在吸附位点上的吸附结合。上述三个过程究竟哪个过程是限速阶段,需要通过吸附动力学来进行判断。

(1)膜传质模型

以-ln(C_t/C₀)对t进行线性拟合,得到膜传质模型拟合曲线,如图 5所示。

图 5 膜传质模型拟合曲线 Figure 5 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by film mass transfer model

图选项

此时活性炭对土壤中1,2,4-TCB的降解速率常数为0.027 99。通过对相关系数的观察分析可知活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附速率受到膜间阻力的影响较大。也就是说,活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附不符合膜传质模型。这主要因为吸附了微生物的活性炭,其孔隙会被微生物占据一部分,导致活性炭上的孔隙体积减少。

(2)颗粒间的扩散模型拟合

以Q_t对t^1/2作图,进行线性拟合,得到颗粒间的扩散模型拟合曲线,如图 6所示。

图 6 颗粒间的扩散模型拟合曲线 Figure 6 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by inter-particle diffusion model

图选项

经过颗粒间传质模型的拟合,得出活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附降解速率常数为0.028 57。通过对相关系数的观察分析可知,活性炭对1,2,4-TCB的降解过程比较符合颗粒间传质模型。这说明在土壤中活性炭吸附的整个过程速度会受到颗粒间传质的影响。

(3)准一级动力学拟合

以-ln(1-Q_t/Q_e)对t进行线性拟合,得到准一级动力学拟合曲线图,如图 7所示。

图 7准一级动力学拟合曲线 Figure 7 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by pseudo-first-order kinetic model

图选项

从图中可以看出,准一级动力学模型不适合描述土壤中1,2,4-TCB去除的整个过程,只适合描述吸附刚开始和将要结束时活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附过程。对于中间反应天数中活性炭对1,2,4-TCB的吸附过程则不适合用一阶动力学模型来描述。此时的相关系数比较大,说明外部传质对于活性炭吸附土壤中的1,2,4-TCB有一定的控制作用^[12]。

(4)准二级动力学拟合

以t/Q_t对t进行线性拟合,得到准二级动力学拟合曲线,如图 8所示。

图 8 准二级动力学拟合曲线 Figure 8 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by pseudo-second-order kinetic model

图选项

通过拟合发现,活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附符合准二级吸附动力学模型。准一级动力学方程一般用于描述颗粒内的扩散,准二级动力学方程则主要描述吸附位点的吸附结合。所以,活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附速率主要受控于吸附位点上的吸附结合。一般情况下,符合准一级吸附动力学模型的吸附过程被认为是一个可逆反应,其吸附速度主要受到吸附质在吸附剂颗粒间扩散速度的限制。符合准二级吸附动力学模型的吸附体系则一般满足下列假设:吸附剂与吸附质之间通过电子共享或电子交换形成化学键,其产生的化学吸附是限制吸附速度的主导因素。因而,我们可以推断,在吸附降解的整个过程中,化学吸附是吸附速率主要控制因素。

综上所述,准二级动力学模型能更好地描述活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附过程。而准一级动力学模型则只能用来描述活性炭对土壤中1,2,4-TCB吸附的某个过程,在本试验中只能用来描述低浓度和高浓度的吸附,对于中等浓度的描述则不适用。这也说明土壤中1,2,4-TCB在活性炭上的吸附可能存在表面吸附和活性炭孔隙填充的共同作用^[13]。各动力学模型拟合参数见表 1。

表 1 各动力学模型拟合参数 Table 1 Fitting parameters of kinetic models

表选项

将一定量的固定化炭菌加入初始浓度为12.5~24 mg·L^-1的1,2,4-TCB污染土壤,使得土壤中其初始污染浓度为5~9.6 μg·g^-1。在该浓度范围内,探索活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附规律。图 9为活性炭对1,2,4-TCB的吸附等温线。

图 9 吸附等温线 Figure 9 Isotherm of 1,2,4-TCB adsorption by bacteria-activated carbon

图选项

由图可知,当加入的固定化炭菌一定、降解时间一定、温度一定的条件下,随着土壤中1,2,4-TCB浓度的增加,活性炭对其的吸附量持续增加。因此,预测当土壤中1,2,4-TCB的浓度再增大时,活性炭对污染物的吸附量还会增加。1,2,4-TCB吸附到材料表面的机理主要是由疏水效应引起的,此阶段的吸附应该是由微生物和活性炭共同引起^[14]。因为1,2,4-TCB是疏水物质,而微生物的疏水性比活性炭的疏水性大,故此时土壤中1,2,4-TCB的吸附主要由微生物的吸附引起。微生物先将1,2,4-TCB吸附到表面,再对其进行降解。

用两种吸附等温线模型进行拟合。由吸附等温线的形状和变化规律可以了解吸附质与吸附剂的作用强弱,界面上吸附分子的状态和吸附层的结构,因此,吸附等温线是描述吸附过程的一个重要参数。

(1)Freundlich模型以lnQ_e对lnC_e进行线性拟合,得到Freundlich模型拟合曲线,如图 10所示。

图 10 Freundlich 模型拟合曲线 Figure 10 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by Freundlich model

图选项

由图可知,Freundlich模型对活性炭吸附土壤中1,2,4-TCB的拟合度较差。Freundlich模型是一个经验模型,Freundlich等温吸附的基本假设是吸附发生在多分子层表面^[15]。这说明活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附不是发生在多分子层表面。被吸附的物质1,2,4-TCB的分子之间没有相互作用。

(2)Langmuir模型以C_e/Q_e对C_e进行线性拟合,得到Langmuir模型拟合曲线,如图 11所示。

图 11 Langmuir 模型拟合曲线 Figure 11 Fitting curve of 1,2,4-TCB adsorption by Langmuir model

图选项

由图可知,本试验条件下,活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附等温线与Langmuir模型拟合曲线相关性比较高。Langmuir吸附等温线的假设是物理或者化学的单层吸附,吸附剂表面是均匀的,被吸附的分子间互不影响,吸附所需要的能量是恒定的。本试验中固定化菌从SEM电镜扫描图上观察是均匀的,这可能是本吸附符合Langmuir吸附等温线的原因之一。由图可以看出,在初始浓度为18~24 mg·L^-1之间能更好地拟合Langmuir模型。而在较低浓度下所得到的试验点则偏离由18~24 mg·L^-1之间的试验点所生成的直线,这说明Langmuir模型对活性炭吸附土壤中1,2,4-TCB更适合中高浓度,在低浓度下则不适用。卢新成等^[16]发现活性炭吸附汞离子也属于单分子层吸附,符合Langmuir吸附等温线模型。 3 结论

(1)活性炭上发达的孔隙为微生物提供了良好的生存空间,使得本系统中活性炭-微生物系统对土壤中1,2,4-TCB的吸附效果优于活性炭和游离微生物。

(2)活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附过程比较符合准二级动力学模型。土壤中1,2,4-TCB在活性炭上的吸附可能存在表面吸附和活性炭孔隙填充的共同作用。活性炭对土壤中1,2,4-TCB的吸附速率主要受控于吸附位点上的吸附结合,在吸附降解的整个过程中,化学吸附是吸附速率的主要控制因素。

(3)活性炭对1,2,4-TCB的吸附过程能用Langmuir模型进行较好的拟合,尤其是当1,2,4-TCB的初始浓度为18~24 mg·L^-1时,说明颗粒活性炭对土壤中的1,2,4-TCB的吸附行为表现为单分子层的吸附过程。