水体中使用消毒剂可能导致水生生物的急性毒性效应,长时间接触可能致癌,如二氧化氯、次氯酸钠能造成氧化应激、遗传毒性(Genotoxicity)及生理指标的影响^[1]。当鱼体所处的水环境受化合物污染时,机体内抗氧化系统会被调动起来,从而保护自身免受不断升高的活性氧簇带来的损伤,其中重要的抗氧化因子包括还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等抗氧化清除剂以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等Ⅱ相解毒酶和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等^[2]。总抗氧化能力(T-AOC)代表机体在受到胁迫后的防御能力。生物体内的抗氧化系统是抵御污染胁迫的第一道屏障,抗氧化因子中的活性成分及其含量可随污染物胁迫而做出迅速响应^[3],能够间接反映环境中污染物胁迫的存在,是表征生物体健康变化的良好生物标记。近年来,利用生物机体抗氧化因子作为反映污染物对鱼类等机体损伤程度的分子生态毒理指标已被国内外学者广泛应用^{[4, 5]}。水体中部分药物会通过呼吸、摄食进入鱼体,然后再通过血液循环进入其他组织器官,进而对鱼体产生影响^[6],药物可能对血液的生化指标产生影响,主要在于血液是鱼体内药物的输送通道。徐维娜等^[5]研究结果表明,在异育银鲫血浆中,当敌百虫为1、45 mg·L^-1时,SOD活性升高。Husak等^[7]研究结果表明,嗪草酮对金鱼血浆生化指标会产生影响。

二溴海因(1,3-dibromo-5,5-dimethylhydantoin,DBDMH)是具有高效性、广谱性、长效性、高适性、低残性的环保广谱消毒杀菌药剂。目前,二溴海因被美国环保局批准并取得FDA认证,得到美国、日本、西欧多国的青睐,并已在水产养殖中广泛使用,被认为是最具有前景的消毒杀菌剂。毒理学试验表明,二溴海因对藻类、细菌、鱼虾蟹都能产生影响^{[8, 9]},且二溴海因对水生动物具有高毒性,对吉富罗非鱼的96 h LC50为3.8 mg·L^-1。周全耀等^[10]初步证实水产用消毒剂二溴海因能够对罗非鱼的肝胰脏造成损伤。目前,关于二溴海因对水生动物影响的研究主要集中在急性毒性,低剂量长期暴露对水生动物生理生化方面的研究则很少见报道。

本试验选择抗氧化因子(GSH、GSSG、GST、SOD、CAT、GR、GPx、T-AOC)作为二溴海因对鱼体损伤程度的生物标记物,研究在不同暴露质量浓度和暴露时间下,二溴海因对吉富罗非鱼血浆抗氧化因子的影响,旨在从生理生化方面了解环境相关浓度二溴海因对鱼类生长健康的潜在危害,为吉富罗非鱼养殖病害防治提供一些理论数据,为分析评估二溴海因的生态安全性提供毒理学资料。

试验用吉富罗非鱼均来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地,转入室内养殖箱中驯养2个月。为保证试验的代表性和同一性,从中选取健康、体表完整的个体作为试验对象,规格为:平均全长(19.57±2.08) cm,平均体重(126.45±29.31) g。驯养期间定时定量进行投喂(按体重3%)且无死鱼现象。

试验条件:光暗比为12 h:12 h,试验用水为经24 h自然曝气的自来水,水温(27.8±0.8)℃,pH值6.3~8.1,溶氧4.4~6.7 mg·L^-1,试验用水符合渔业水质标准(GB 11607-1989)。

渔药二溴海因购自无锡中水渔业科技有限公司,其消毒溶液在试验时现用现配。GSH、GSSG、GST、SOD、CAT、GR、GPx、T-AOC试剂盒、氰化高铁血红蛋白试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

本课题组前期研究结果表明二溴海因对吉富罗非鱼幼鱼96 h LC50为3.8 mg·L^-1,在实际生产中,二溴海因施药剂量为0.3~0.4 mg·L^-1[11],本研究将试验浓度设置为:0、0.06、0.3、1.5 mg·L^-1。整个试验持续26 d,分为16 d的暴露试验和10 d的恢复试验两个阶段^[12],设置高浓度及清水恢复期的目的旨在观察二溴海因对罗非鱼抗氧化因子的损伤是否可逆,每个浓度梯度设3个重复。在体积为300 L的水族箱中分别配制上述各浓度染毒液200 L,每个浓度组随机放入雄性罗非鱼20尾。采用更新式静态水质接触试验法进行试验。试验期间每天换水50%,并补足受试药物至原有浓度,其他条件与驯养期间相同。

暴露结束后,将每个浓度剩余的罗非鱼分别转移到不含有二溴海因的清水中,进行染毒物释放试验,试验期间每天换水50%,以降低药物重吸收概率。其他饲养条件与染毒试验时保持一致,整个试验期间没有出现自然死鱼现象。

分别在染毒后第1、2、4、8、16、26 d采样。采样前24 h停止喂食。测定鱼体长、体重后,用注射器尾静脉采血约0.8 mL。血液加ACD抗凝剂(柠檬酸钠1.32%,柠檬酸0.48%,葡萄糖1.47%,m/m),在4℃、3500 r·min-1下冷冻离心10 min,制备血浆于-80℃保存。试验中的每个浓度组取吉富罗非鱼9尾(每个平行取样3尾,3个重复合计9尾),将9次测定的平均值作为最终结果。

血浆中各抗氧化因子的检测按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行^{[13, 14]}。简单来说,血浆组织T-GSH和GSSG含量测定采用DTNB法测定,并按公式计算。

GSH=T-GSH-2GSSG

GPx以每0.1mL血浆在37℃反应5 min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol·L^-1为一个酶活力单位，单位为U;GST以每毫升血浆在37℃反应1 min，扣除非酶促反应，使反应体系中的GSH浓度降低1μmol·L^-1为一个活力单位，单位为U·mL^-1;GR以每升血浆每分钟使体系中底物NADPH的浓度改变1 mmol·L^-1所需的酶量为一个酶活力单位，单位为U·L^-1;SOD以在反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个活力单位,单位为U·mg^-1 Hb;CAT以每毫升血浆每秒钟分解1 μmol H₂O₂的量为一个活力单位,单位为U·mg^-1 Hb;T-AOC以在37℃,每分钟每毫升血浆使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时,为一个总抗氧化能力单位,单位为U·mL^-1;血红蛋白含量采用HICN比色法测定,单位为g·L^-1。

实验数据用平均值±标准误表示,使用SPSS 17.0软件在P=0.05的置信水平对抗氧化酶活性进行单因素方差分析(Duncan′s test),Origin 6.0软件绘图。

罗非鱼血浆SOD、GR活性测定结果如图 1和图 2所示。二溴海因各浓度组在胁迫初期SOD、GR活性与对照组相比显著(P < 0.05)降低,在第2 d降至最低,分别为对照组的56.38%和33.33%;从第4 d开始SOD、GR活性升高,与对照组相比差异不显著。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,0.06 mg·L^-1 DBDMH恢复组与对照组SOD活性差异不显著,0.3、1.5 mg·L^-1 DBDMH恢复组SOD活性显著(P < 0.05)低于对照组。各DBDMH恢复组与对照组GR活性差异不显著。

不同小写字母表示不同暴露剂量在同一时间下差异显著；显著水平为P < 0.05。下同 Different lowercase letters indicate significant difference between DBDMH concentrations within an exposure period at P < 0.05.The same below 图 1 二溴海因对吉富罗非鱼血浆SOD活性的影响 Figure 1 Plasma SOD activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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图 2 二溴海因对吉富罗非鱼血浆GR活性的影响 Figure 2 Plasma GR activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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罗非鱼血浆CAT活性测定结果如图 3所示。二溴海因胁迫第1 d CAT活性显著(P < 0.05)升高,高于对照组;随胁迫时间的延长,低、中浓度组CAT继续升高,高浓度组CAT活性降低;到第8 d CAT活性显著(P < 0.05)降低,低于对照组;各浓度组胁迫第16 d CAT活性与对照组相比显著(P < 0.05)升高。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,各DBDMH恢复组与对照组CAT活性差异不显著。

图 3 二溴海因对吉富罗非鱼血浆CAT活性的影响 Figure 3 Plasma CAT activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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罗非鱼血浆GST活性测定结果如图 4所示。二溴海因各浓度组第1 d与对照组相比GST活性显著(P < 0.05)升高,从第2 d开始GST活性与对照组相比显著(P < 0.05)降低,到第16 d与对照组相比GST活性又显著(P < 0.05)升高,高浓度诱导率为450%。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,0.06、1.5 mg·L^-1 DBDMH恢复组与对照组GST活性相比有显著(P < 0.05)降低的趋势,0.3 mg·L^-1 DBDMH恢复组与对照组GST活性相比无显著变化。

图 4 二溴海因对吉富罗非鱼血浆GST活性的影响 Figure 4 Plasma GST activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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罗非鱼血浆GPx活性测定结果如图 5所示。二溴海因各浓度组在第1 d与对照组相比GPx活性显著(P < 0.05)上升,最高浓度组GPx活性升至387.60 U;从第2 d开始GPx活性下降与对照组相比无显著差异,到第16 d GPx活性与对照组相比显著(P < 0.05)上升。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,0.06、0.3 mg·L^-1 DBDMH恢复组与对照组相比GPx活性无显著差异,而1.5 mg·L^-1 DBDMH恢复组与对照组相比GPx活性显著(P < 0.05)下降。

图 5 二溴海因对吉富罗非鱼血浆GPx活性的影响 Figure 5 Plasma GPx activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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罗非鱼血浆T-GSH活性测定结果如图 6所示。在第1、2 d二溴海因低浓度组0.06 mg·L^-1 DBDMH与对照组相比T-GSH活性显著(P < 0.05)上升至487.80 μmol·L^-1,0.3、1.5 mg·L^-1 DBDMH组与对照组相比略有上升;从第4 d开始各浓度组与对照组相比T-GSH活性显著(P < 0.05)降低,到第16 d T-GSH活性上升,与对照组相比无显著差异。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,0.06、0.3 mg·L^-1 DBDMH组与对照组相比T-GSH活性显著(P < 0.05)降低,而1.5 mg·L^-1 DBDMH组与对照组相比T-GSH活性无显著差异。

图 6 二溴海因对吉富罗非鱼血浆T-GSH含量的影响 Figure 6 Plasma T-GSH content in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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罗非鱼血浆GSH/GSSG值测定结果如图 7所示。二溴海因各浓度组在第1、2 d与对照组相比GSH/GSSG值显著(P < 0.05)升高,从第4 d开始GSH/GSSG值与对照组相比显著(P < 0.05)降低。二溴海因0.06 mg·L^-1 DBDMH组在第16 d GSH/GSSG值显著(P < 0.05)升高,为对照组的385.19%,而0.3、1.5 mg·L^-1 DBDMH组与对照组相比,GSH/GSSG值无显著差异。当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,各DBDMH恢复组与对照组相比,GSH/GSSG值显著(P < 0.05)升高。罗非鱼血浆T-AOC活性测定结果如图 8所示。二溴海因各浓度组从第1 d开始T-AOC活性降低,与对照组相比差异显著(P < 0.05),且在同一时间随二溴海因浓度增加T-AOC活性降低越显著(P < 0.05);随着时间的延长,到第16 d T-AOC活性显著(P < 0.05)升高。

图 7 二溴海因对吉富罗非鱼血浆GSH/GSSG值的影响 Figure 7 Plasma GSH/GSSG ratios in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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图 8 二溴海因对吉富罗非鱼血浆T-AOC活性的影响 Figure 8 Plasma T-AOC activity in GIFT tilapia exposed to DBDMH

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当暴露在各浓度组的罗非鱼被转移到不含二溴海因的清水中恢复10 d后,各DBDMH恢复组与对照组相比,T-AOC活性显著(P < 0.05)降低。

将相关酶活性作为生物体功能和器官损伤的标记,即使用生物学标记方法,不仅能指示生物体对污染物的暴露,还能指示污染物的毒性效应,具有很好的预警作用。SOD是清除自由基的第一酶,能将O^-₂·转化为H₂O₂^[15],CAT则因继续分解H₂O₂而被诱导,这是机体面临氧化胁迫时一个十分重要的代谢途径。除CAT外,GPx也能利用GSH作为电子供体参与H₂O₂分解,生成GSSG,而GSSG可被GR还原成GSH^[16]。GST为一种重要的第Ⅱ阶段解毒酶,能催化GSH的-SH结合到疏水化合物上,使疏水化合物变成亲水物质,从而易于由胆汁或尿液排泄。

本研究中,各DBDMH浓度组吉富罗非鱼血浆内SOD活性、GR活性与对照组相比,随时间延长均表现先抑制后稳定不变的趋势。这与罗义等^[17]研究鲫鱼的生态毒性,Petrache等^[18]研究鲫鱼肾脏抗氧化还原酶影响结果相似。一种可能是进入罗非鱼体内的二溴海因不能完全排出体外,在体内产生积累,并与SOD、GR结合,从而降低其浓度^[19];还有一种可能是产生的O₂^-·、H₂O₂过多导致机体不能及时清除而积累,进而导致SOD、GR活性降低^[20]。而在暴露4、8、16 d后,吉富罗非鱼可能通过体内调节,实现活性氧之间的动态平衡,使SOD活性、GR活性恢复正常水平^[21]。

各浓度组吉富罗非鱼血浆内CAT、GST呈先升高后下降的趋势,且16 d时出现显著性升高现象,与Zhao等^[22]和Li等^[23]分别对鲤鱼和虹鳟鱼的研究结果一致。CAT和GST的诱导可能由于二溴海因激发了大量的H₂O₂,当H₂O₂积累不能被及时清除,或二溴海因在机体产生的积累与CAT和GST结合时,CAT和GST活性将降低。而在16 d时出现的显著升高现象,可能由于GPx等补偿性升高所致。

在特定时间内生物体受到有毒物质胁迫时,机体GPx活性可受到明显的诱导作用,之后随着时间的延长GPx活性保持稳定不变趋势^[24]。二溴海因胁迫下,各DBDMH浓度组吉富罗非鱼血浆内GPx活性与对照组相比在整个暴露期间表现第1 d和第16 d被诱导。外源性污染物引起大量的过氧化物产生,激发GPx活性升高保护机体免受损伤,吉富罗非鱼通过体内的调节,实现活性氧之间的动态平衡,保持GPx活性稳定,并回到正常水平,达到保护抗氧化系统的目的^[21]。本试验中第16 d GPx活性再次上升,可能是由于CAT、GST代偿性升高,再次诱导了GPx的活性。

T-GSH、GSH/GSSG、T-AOC是机体抗氧化系统功能的综合性指标,其中T-AOC大小可代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态。各DBDMH浓度组吉富罗非鱼血浆内T-GSH、GSH/GSSG与对照组相比,在整个暴露期间表现先升高后下降的趋势,且在第16 d出现显著升高现象。这与Piner等^[25]研究多杀菌素胁迫下尼罗罗非鱼肝脏T-GSH值的变化结果类似,但与Guzman-Guillen等^[26]研究肝毒素胁迫下尼罗罗非鱼肝脏和肾脏GSH/GSSG值的变化结果不同,可能是污染物种类或暴露浓度存在差异所致。GSH除了与GPx、GST和GR有关外,还与氨基酸转运酶有关^[27]。随着时间的延长,二溴海因胁迫下,各浓度组吉富罗非鱼血浆内T-AOC活性与对照组相比在整个暴露期间仅在第16 d被诱导,与章承军等^[28]在缢蛏方面的研究结果类似。原因可能是暴露初期鱼类受二溴海因胁迫产生了大量的自由基,T-AOC水平下降,在暴露一段时间后,CAT、GST和GPx活性代偿性升高,造成T-AOC水平升高以便清除体内自由基。然而长时间暴露会使机体整体抗氧化还原系统受损,造成机体损伤。

恢复试验主要用于研究污染因素被消除后生物体中各目标参数是否能够恢复到正常状态,用于评价污染物对生物体造成的毒性效应是否具有可逆性。本研究中各浓度组除CAT、GR外,解除胁迫10 d后各抗氧化指标均未恢复到正常水平,与Danion等^[29]、Meng等^[20]在虹鳟和罗非鱼上的研究类似,结果表明0.06~1.5 mg·L^-1二溴海因会对吉富罗非鱼造成不可逆损伤。从不同浓度二溴海因处理罗非鱼在16 d时数据以及高浓度组恢复期的数据来看,本研究结果还表明随二溴海因浓度增加,不可逆损伤加重。

在0.06、0.3、1.5 mg·L^-1三个DBDMH暴露浓度下,二溴海因对吉富罗非鱼血浆抗氧化因子产生显著影响。这是由于机体抗氧化因子的变化表示机体内活性氧的大量增加,并已扰乱机体抗氧化系统的正常功能。浓度高于0.06 mg·L^-1的二溴海因能够对吉富罗非鱼抗氧化系统产生显著的氧化损伤。二溴海因暴露浓度与吉富罗非鱼血浆T-AOC活性抑制率之间具有显著的剂量-效应关系,考虑可以将T-AOC作为水体中二溴海因类药物污染的生物标志物。0.06~1.5 mg·L^-1二溴海因会对吉富罗非鱼造成不可逆损伤,且随二溴海因浓度增加，不可逆损伤加重