锶(Strontium,Sr)在土壤中主要以⁸⁴Sr²⁺、⁸⁶Sr²⁺、⁸⁷Sr²⁺和⁸⁸Sr²⁺四种稳定同位素存在^[1]。随着核能的广泛利用,大量的放射性核废物进入环境,其中⁹⁰Sr²⁺作为主要的放射性核废物,具有半衰期长(28.9年)、危害性大等特点^[2]。当环境中的⁹⁰Sr²⁺被植物根系吸收并富集到植物体内后,极易通过食物链进入动物或人体内。动物和人体内的⁹⁰Sr²⁺可替换骨骼中的Ca²⁺,形成内辐射,导致血细胞、骨细胞和皮肤细胞大量死亡,给健康带来危害^{[3, 4, 5]}。因此,放射性Sr²⁺的环境生物学效应已受到广泛关注。

近年来,筛选超富集植物(如向日葵、粗根大戟、毛蕊花和黄耆)并种植于重度污染区,通过植物的吸收和富集达到清除土壤中放射性核素(90Sr²⁺)的应用研究已取得一些成果^{[6, 7, 8]},但关于Sr²⁺对植物的遗传毒性及毒理机制的研究却鲜有报道。

依据Soudek等^[7]的研究结果,植物对Sr²⁺的放射性同位素(⁹⁰Sr²⁺)和稳定性同位素(⁸⁸Sr²⁺)的吸收无明显差异,本文以⁸⁸Sr²⁺作为外源处理因子,选择对Sr²⁺蓄积能力较强且对环境污染物敏感的蚕豆为试材^[9],通过蚕豆急性毒性实验(包括种子萌发、胚根伸长及幼苗生长)、微核实验和彗星实验,研究Sr²⁺对蚕豆的遗传毒性及毒理机制,为研究超富集植物耐受机理提供理论依据。

为了评价Sr²⁺对蚕豆的急性毒性大小、致毒效应特征、剂量-反应(效应)关系,亦为了合理设计后续研究必须考量的染毒剂量、选择适宜的观测指标,依据本研究室前期预实验结果,Sr²⁺处理组浓度设定为0.05、0.25、0.5、5.0、10.0 mmol·L^-1,对照组(CK)为0.01 mmol·L^-1,其依据是采用火焰原子吸收分光光度法(TAS-990)测定本研究室土培实验选用的土壤(土壤质地:壤土)中Sr²⁺含量为约合0.01 mmol·kg^-1。CK和处理组中Sr²⁺以SrCl₂·6H₂O (分析纯)添加,溶液均采用改良1/6霍格兰营养液。

蚕豆种子的染毒实验:蚕豆用蒸馏水漂洗2次,用2% H₂O₂浸泡消毒10 min,洗净后用蒸馏水浸种24 h,选择饱满程度一致的蚕豆放入培养皿(上下各垫一层滤纸),每皿10粒,分组编号,分别加入CK或ρ(Sr²⁺)0.05~10.0 mmol·L^-1处理液10 mL,25℃避光培养。当CK种子的芽长约2 cm时,终止培养,统计发芽率;随机选取各处理组中已萌发的种子5粒,将根、芽60℃烘至恒重,测定根、茎生物量和幼苗总生物量。

蚕豆种子经消毒、浸种和萌发后,选择胚根长度(根长约1 cm)一致的蚕豆放入培养皿,每盘6粒,分别加入CK或ρ(Sr²⁺)0.05~10.0 mmol·L^-1处理液10 mL,培养皿置25℃、光/暗比为12 h/12 h的培养室中培养24、48 h和72 h后,一部分蚕豆用蒸馏水浸洗3次,再置于湿纱布中恢复培养24 h,每一处理选取5个根尖,截取根尖分生区组织,采用孚尔根染色法观察和统计1000个根尖细胞中的有丝分裂细胞数、染色体畸变数和细胞微核数^[10]。

另选取培养72 h的蚕豆根尖,采用改良的彗星实验法检测细胞DNA断裂损伤效应^[11]。每一张载玻片随机选取50个彗星图像,用CASP软件测量分析彗星图像的三个参数,即:彗星尾长(Tail length,TL),在相同实验条件下,反映DNA损伤程度和DNA断裂片断的大小;尾部DNA含量(Tail DNA%,TD),在不同Sr²⁺处理浓度下,DNA损伤越严重,尾部DNA含量越高,头部DNA含量越低;尾矩(Tail moment,TM),尾部DNA含量和彗尾长度的乘积,是衡量DNA损伤的基本参数。测试、观察和分析均重复3次。

种子发芽率、有丝分裂指数(Mitotic index,MI)、染色体畸变率(Chromosomal aberration frequency,CAF)和细胞微核率(Micronucleus frequency,MCN)计算公式如下:

发芽率=已萌发种子数/每皿种子总数×100%

有丝分裂指数=有丝分裂细胞数/观察统计的细胞总数×100%

染色体畸变率=具有染色体畸变的细胞数/观察统计的细胞总数×100%

细胞微核率=细胞微核数/观察统计的细胞总数×1000‰

试验数据采用SPSS18.0进行方差分析(LSD多重比较)、相关性分析,Origin9.0作图。

不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05) Different letters above bars indicate a statistically signicant difference according to LSD test (P < 0.05) 图 1 Sr2+对蚕豆种子发芽率的影响 Figure 1 Germination rates of Vicia faba seeds exposed to Sr2+

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同一图例,不同字母表示各处理与对照比较差异显著(P < 0.05) Different letters within same part indicate significant difference between treatments according to LSD test (P < 0.05) 图 2 Sr2+对蚕豆根、茎和全苗生物量的影响 Figure 2 Biomass of roots,stems and whole seedlings of Vicia faba exposed to Sr2+

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由表 1可见,随Sr²⁺浓度的增加,处理24 h蚕豆根尖细胞有丝分裂指数(MI)呈先升后降的变化趋势;处理48 h和72 h后,MI均不同程度降低,且当ρ(Sr²⁺)>0.5 mmol·L^-1时,MI均显著低于CK (P < 0.05),表明随Sr²⁺处理浓度增加和处理时间延长,蚕豆根尖细胞有丝分裂活动受到抑制,导致蚕豆根生长缓慢,生物量降低。

表 1 Sr²⁺对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数(MI)的影响 Table 1 Mitotic indices (MI) in root meristem cells of Vicia faba exposed to Sr²⁺ for different times

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由图 3可见,Sr²⁺处理24、48 h和72 h,蚕豆根尖分生区细胞分裂间期出现较多的单微核(图 3a)、双微核(图 3b)和三微核(图 3c),细胞有丝分裂后期可观察到染色体桥(图 3d)和染色体断片(图 3e);有丝分裂末期也观察到染色体断片和染色体游离(图 3f)。染色体畸变率(CAF)统计结果显示,随Sr²⁺浓度增加,处理24 h和48 h,CAF呈上升趋势,均显著高于CK (P < 0.05);处理72 h后,CAF逐渐降低(表 2)。Sr²⁺处理24、48 h和72 h,细胞微核率(MCN)亦随Sr²⁺浓度增加而逐渐上升,当ρ(Sr²⁺)>0.5 mmol·L^-1时,MCN均显著高于CK (P < 0.05)(表 3)。Pearson相关性分析显示(表 4),MCN与Sr²⁺处理浓度、MCN与染色体畸变率均呈极显著正相关(R²=0.656和R²=0.707,P < 0.01)。结果表明,Sr²⁺可诱导蚕豆根尖分生区细胞出现明显的染色体结构异常和程度不同的染色体断裂,是细胞微核形成的主要原因。

a.单微核;b.双微核;c.三微核;d.染色体桥;e.染色体断片;f.染色体游离 a.Single micronucleus;b.Double micronucleus;c.Three micronucleus;d.Chromosome bridge;e.Chromosome fragments;f.Free chromosome 图 3 Sr2+诱导蚕豆根尖细胞出现多种类型的染色体畸变 Figure 3 Induction of various types of chromosome aberration in root meristem cells of Vicia faba exposed to Sr2+

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表 2 Sr²⁺对蚕豆根尖细胞染色体畸变率(CAF)的影响 Table 2 Induction of aberration rates in root meristem cells of Vicia faba exposed to Sr²⁺for different times

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表 3 Sr²⁺对蚕豆根尖细胞微核率（MCN）的影响 Table 3 Induction of micronucleus formation in root meristem cells of Vicia faba exposed to Sr²⁺for different times

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表 4 Sr²⁺处理浓度与微核率、染色体畸变率及有丝分裂指数间的Pearson相关分析 Table 4 Correlations between root tip micronucleus rate,aberration rate and mitotic index of Vicia faba under different Sr²⁺ concentrations

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由图 4可见,Sr²⁺处理72 h后,DNA断片迁移部分的光密度和迁移长度变化明显。采用SPSS的Explore频数统计彗星实验参数的结果显示,随着Sr²⁺浓度在ρ(Sr²⁺)0.05~5.0 mmol·L^-1范围内增加,TL、TD和TM的中位数及平均值逐渐增加,表明蚕豆根尖DNA断裂损伤愈发严重;当ρ(Sr²⁺)10.0 mmol·L^-1时,相比于5.0 mmol·L^-1的处理组,TL、TD和TM均有所降低(图 5),但仍高于CK,分析是由于根尖分生区处于分裂期的细胞数量减少,染色体复制停滞,DNA以较稳定的超螺旋结构存在,一定程度上缓解了Sr²⁺的损伤。此结果与有丝分裂指数的结果(表 1)具有一致性。方差分析结果显示,在ρ(Sr²⁺)0.25~10 mmol·L^-1范围内,TD显著高于CK (P < 0.05),是CK的0.86~2.3倍;当ρ(Sr²⁺)>0.5 mmol·L^-1时,TL和TM亦显著高于CK (P < 0.05),说明当Sr²⁺浓度超过0.5 mmol·L^-1时,可诱导蚕豆根尖DNA断裂(表 5)。

图 4 不同浓度Sr2+(0.05~10.0 mmol·L-1)处理72 h对蚕豆根尖DNA断裂损伤的彗星实验结果 Figure 4 DNA damages in root meristem cells of Vicia faba exposed to Sr2+for 72 h

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A、B、C分别表示TL、TD和TM的DNA损伤结果。箱图中的矩形和上下触须表示蚕豆胚根细胞的彗星试验参数值;矩形上下边缘分别代表25%~75%置信区间,矩形内部的细线、小三角形分别表示中位数和均值,上下触须分别表示最大、最小值 A:TL,tail length of comet;B:TD,tail DNA content;C:TM,tail moment.Box and whisker plots for comet assay values for radicle cells of Vicia faba.Outer edges of boxes represent the 25th and 75th percentiles,and horizontal lines within boxes represent median and small triangles represent sample mean.Whiskers on box plot represent minimum and maximum values 图 5 不同浓度Sr2+(0.05~10.0 mmol·L-1)处理72 h后蚕豆根尖细胞DNA损伤程度的彗星实验三个参数的变化 Figure 5 DNA damages in radicle cells of Vicia faba exposed to different levels of Sr2+

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表 5 Sr²⁺处理72 h对蚕豆根尖细胞DNA损伤的平均情况 Table 5 DNA damages in radicle cells of ^{Vicia faba} exposed to different levels of Sr²⁺ for 72 h

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当植物体内富集过量的Sr²⁺后,Sr²⁺与Ca²⁺产生竞争性吸收效应,导致胞内Ca²⁺稳态失调,抑制膜电位的形成,ATP水解酶活性和抗氧化酶活性降低^{[5, 12]}。已有研究表明,经ρ(Sr²⁺)>1.0 mmol·L^-1处理玉米幼苗7 d后,叶片中的叶绿素含量、根部和茎部组织中的Mg²⁺、Ca²⁺含量显著降低^[6],处理垂柳幼苗60 d后,丙二醛(MDA)含量显著升高^[13]。较高浓度的Sr²⁺处理油菜14 d后,活性氧累积量超过植物自身的清除能力,抗氧化酶SOD被破坏、POD和CAT活性降低,活性氧直接或间接地对膜脂、膜蛋白及DNA造成严重伤害^[14],植物表现出种子发芽率和生物量降低、光合作用下降等中毒症状^{[15, 16, 17, 18, 19]},表明Sr²⁺的毒性效应与Sr²⁺诱导的植物体内活性氧代谢失衡有一定关系。本文结果也显示,低浓度Sr²⁺处理下[ρ(Sr²⁺) < 0.05 mmol·L^-1]蚕豆发芽率提高、根和芽伸长加快、生物量提高,较高浓度Sr²⁺处理[ρ(Sr²⁺)>0.25 mmol·L^-1]呈现明显的抑制作用,表明中高浓度的Sr²⁺对蚕豆种子萌发与生长有一定的抑制作用。

细胞微核来源于整条染色体的部分丢失、染色体断片和滞后的染色体^[10],微核实验常用于评估环境污染物对植物染色体畸变的影响和基因毒性的大小。本文结果显示,Sr²⁺处理24、48 h和72 h后,可明显观察到蚕豆根尖细胞染色体断片和染色体游离(图 3 d、图 3e、图 3f)等畸变类型(图 3),细胞微核率(MCN)与Sr²⁺处理浓度、染色体畸变率呈显著的正相关性(R²=0.656和0.707,P < 0.01,表 4)。这与Sr²⁺处理的毒性诱导作用有密切关系,分析主要是染色体断片无法进入细胞主核,最终形成微核。

本研究采用彗星实验法,基于单细胞DNA的结构变化,通过测量分析彗星实验的三个基本参数(TL、TD和TM),检测蚕豆根尖细胞DNA的断裂损伤效应^{[20, 21]},进一步研究了Sr²⁺的遗传毒性及微核形成的原因。根据本研究结果,可初步确定Sr²⁺能够诱导蚕豆根尖DNA链的断裂,Sr²⁺与DNA损伤程度之间存在显著的"剂量-效应"关系,表现为在Sr²⁺处理72 h后,随Sr²⁺浓度增加[ρ(Sr²⁺)0.05~5.0 mmol·L^-1],TL、TD和TM均逐渐增加。此结果与显微观察到的染色体断片(图 3)结果一致,表明微核的形成主要来源于染色体DNA的断裂。

低浓度Sr²⁺[ρ(Sr²⁺) < 0.05 mmol·L^-1]可促进蚕豆种子萌发、根和芽的伸长;较高浓度Sr²⁺[ρ(Sr²⁺)>0.25 mmol·L^-1]可诱导蚕豆根尖细胞正常的有丝分裂受阻,出现DNA结构异常变化,如染色体断裂、形成染色体断片和微核。究竟Sr²⁺对蚕豆根尖DNA结构的影响是由于Sr²⁺的直接效应还是通过信号转导的间接诱导损伤,尚有待进一步研究。