近年来,由于人类活动(如矿产的开发、三废的排放、农药化肥的施用)及自然因素的影响,土壤镉污染状况越来越严重。我国镉污染的土壤面积已达20万km²,占总耕地面积的1/6^[1]。土壤镉污染使我国粮食作物、蔬菜等农产品质量下降,影响农业的可持续发展,严重威胁人类健康^[2]。

植物修复技术是目前经济有效的重金属污染土壤修复方法之一,植物修复(Phytoremediation)是指将某种特定的植物种植在重金属污染的土壤上,而该种植物对土壤中的污染元素具有特殊的吸收富集能力,将植物收获并进行妥善处理(如灰化回收),通过多次种植富集植物后使土壤重金属含量降低到可接受的水平^[3],达到污染治理与生态修复的目的。籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)是苋科(Amaranthus)苋属(Amaranthceae)的一年生草本植物,是粮、饲、肥菜兼用型的优质、高产的多功能作物^[4]。Fan等^[5]研究显示,苋科植物中很多品种具有Cd富集特征,如苋属植物天星米(Amaranthus mangostanus L.)在土壤Cd浓度为25 mg·kg^-1条件下,其地上部Cd富集量可达到234 mg·kg^-1。Chunilall等^[6]也发现食用红叶苋菜(Amaranthus dubius L.)和绿叶苋菜(Amaranthus hybridus L.)对Cd有极强的富集能力。张小川^[7]发现籽粒苋具有明显的富集镉的能力,可用于土壤镉污染的生态修复。但目前,有关籽粒苋耐受富集镉的分子机理尚无相关报道。本实验首次将技术成熟的差异显示PCR技术应用于籽粒苋Cd胁迫下差异表达基因的筛选,以期为今后籽粒苋耐镉分子机理的研究提供一定的理论依据。

本实验材料是由四川农业大学环境学院筛选的具有镉耐受和富集能力的籽粒苋。

采用温室盆栽实验,选用饱满籽粒苋种子,用0.1% NaClO浸泡消毒30 min,再用蒸馏水冲洗干净,进行播种、育苗。待苗达到一定大小(3~4片新叶,株高为5~6 cm)后,选择长势良好,且生长一致的幼苗进行盆栽试验。实验盆(40 cm×20 cm×15 cm)中装入6.0 kg供试土壤,盆栽土壤设两个Cd处理浓度,分别为0、100 mg·kg^-1,将Cd以CdCl₂·2.5H₂O的形式加入土壤并混匀,平衡4周后,将筛选的长势好的幼苗移栽到盆中,每盆各6株苗,每个处理3次重复。为保证生长所需营养物质,施相同底肥。生长90 d后,收集籽粒苋根、叶、果3部分,保存在非冻型组织RNA保存液中,冻存于-70℃低温冰箱中备用。

采用北京天恩泽基因科技有限公司的90404柱式植物RNA提取试剂盒提取空白对照组和镉胁迫处理组根、叶、果总RNA。使用90318柱式DNA清除剂(北京天恩泽)去除基因组DNA。用质量浓度1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用核酸蛋白测定仪测定其纯度。

采用Fermentas公司的cDNA第一条链反转录试剂盒完成。

以反转录合成的cDNA第一链为模板,用3条锚定引物(AP1、AP2和AP3)与24条随机引物(RP1~RP24)(序列见表 1)组成72个引物对组合,分别进行RT-PCR扩增反应。扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性50 s,35℃退火45 s,72℃延伸90 s,共30个循环。PCR反应结束后,产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色,拍照记录实验结果。

表 1 引物组成和性质 Table 1 Composition and nature of primers

表选项

使用BioFlux公司的Biospin聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收差异片段,以回收的差异条带为模板进行二次PCR扩增。所用的引物对组合及扩增条件与上述DDRT-PCR分析相同,扩增产物用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。筛选仅有一条扩增产物且片段大小与回收产物相同的目的片段,使用上海生工的UNIQ-10DNA胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。

利用T-Vector (pMD-19)载体(TaKaRa Biotechnology)连接二次扩增PCR产物,随后转入感受态细胞DH5α(天根生化科技有限公司)。筛选重组克隆进行测序(华大基因公司测序)。测序结果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blastn和Blastx序列比对。

重新提取自然对照组和镉胁迫处理组的RNA,反转录合成cDNA第一链。利用Primer Premier 5.0软件对差异基因设计引物,进行RT-PCR扩增,PCR反应参数为:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,50~60℃退火45 s,72℃延伸30 s,共30个循环。产物用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

提取的总RNA经纯化后,在核酸蛋白测定仪上测定A260/A280的比值,结果显示,根对照:A260/A280=1.039/0.529=1.964 8,根处理:A260/A280=0.725/0.364=1.992 8;叶对照:A260/A280=0.258/0.134=1.922 2,叶处理:A260/A280=0.516/0.270=1.911 1;果对照:A260/A280=0.148/0.074=2.000 0,果处理:A260/A280=0.143/0.071=1.999 8。RNA纯度检测均在1.8~2.0范围内,说明RNA提取纯度好。电泳检测结果显示(图 1),28S与18S条带明亮、清晰、条带锐利,5S带几乎不可见,说明总RNA完整性较好,可用于后续试验。

1、2:根对照和处理材料;3、4:叶对照和处理材料;5、6:果对照和处理材料 1,2:Control and treatment materials of roots;3,4:Control and treatment materials of leaves;5,6:Control and treatment materials of fruits 图 1 籽粒苋RNA提取 Figure 1 RNA extract of Amaranthus hypochondriacus

图选项

将随机引物与锚定引物组合进行PCR,电泳检测。从24个随机引物中筛选出适用叶部位的5条引物(RP18、RP19、RP20、RP23、RP24),适用于根和果部位的7条引物(RP8、RP14、RP18、RP19、RP20、RP23、RP24)(图 2)。通过比较对照组和处理组扩增结果,共18个引物对扩增出有明显差异的cDNA片段。这些差异片段在镉胁迫下呈现两种类型:下调表达(EST-1、EST-2、EST-4)和上调表达(EST-3)。对差异片段回收进行二次PCR扩增和电泳检测,结果显示:差异片段EST-1、EST-2、EST-3和EST-4的二次PCR扩增产物为1条片段,且碱基数目与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中一致。说明4条差异片段为阳性。

图中C为对照,T为处理 Letter C indicates control,and letter T shows treatment 图 2 籽粒苋叶对照组与处理组锚定引物(AP1、AP 2、AP3)与随机引物(由左至右依次RP18、19、20、23、24)组合PCR产物图及根和果对照组与处理组锚定引物(AP1、AP2、AP3)与随机引物(由左至右依次RP8、14、18、19、20、23、24)组合PCR产物图 Figure 2 PCR products of anchor primer (AP1,AP2,AP3) and random primer (RP18,19,20,23,24) of A.hypochondriacus leaves,and PCR products of anchor primer (AP1,AP2,AP3) and random primer (RP8,14,18,19,20,23,24) of A.hypochondriacus roots and fruits

图选项

利用Blastn对EST序列进行同源比对(表 2)。EST-1与土人参26S核糖体RNA基因部分序列(GB|HQ843466.1)一致性为99%,EST-2与虎耳草26S核糖体RNA大亚基基因部分序列(GB|AF 036498.1)一致性为93%,EST-3与大肠杆菌菌株TW14359 DNA聚合酶Ⅲα亚基基因(ECs0186)完整CDS (GB|EU906049.1)一致性为97%,EST-4与米曲霉RIB40 β-葡萄糖苷酶基因(XM_001816779.2)一致性为99%。

表 2 差异表达序列的Blastn比对结果 Table 2 Results of comparing differentially expressed sequences with Blastn

表选项

利用Blastx对EST序列比对,结果表明(表 3)。EST-1与假定蛋白MTR_5g051030[苜蓿](XP_003614386.1,795aa)548~609aa比较,相同和相似残基为16个(Positives=16/62),氨基酸序列相似性为26%;EST-2与假定衰老相关蛋白[柏杉](GB|ACA30301.1,98aa)14~75aa比较,相同和相似残基为61个(Positives=61/62),氨基酸序列一致性为98%;EST-3与DNA聚合酶Ⅲα亚基[大肠杆菌OP50](ZP_06935700.1,376aa)3~69aa比较,相同和相似残基为67个(Positives=67/67),氨基酸序列一致性为100%;EST-4与β-葡萄糖苷酶[黄曲霉NRRL3357](XP_002383240.1,861aa)334~451aa比较,相同和相似残基为116个(Positives=116/118),氨基酸序列一致性为99%。

表 3 差异表达序列的Blastx比对结果 Table 3 Results of comparing differentially expressed sequences with Blastx

表选项

RT-PCR鉴定得到的4个差异表达片段(图 3),在对照组及处理组中差异表达片段条带清晰,EST-1、EST-2和EST-4在镉胁迫下下调表达,EST-3在镉胁迫下上调表达。

C为对照,T为处理 Letter C indicates control,and letter T shows treatment 图 3 RT-PCR结果 Figure 3 RT-PCR results

图选项

本研究采用DDRT-PCR技术,在mRNA水平分析了籽粒苋镉胁迫下相关基因的差异表达情况。镉胁迫下,本研究共获得了3个下调表达片段和1个上调表达片段。

在Blastn序列比对中,EST-1和EST-2均与26S核糖体RNA的部分基因序列相似,26S核糖体RNA参与核糖体的组成,而核糖体是蛋白质合成的场所,此基因表达下调说明在镉胁迫下,根和叶细胞内的蛋白质代谢受到一定的抑制。在Blastx序列比对中,根中EST-1与假定蛋白MTR_5g051030[苜蓿](XP_003614386.1)有较低的氨基酸序列一致性(26%),假定蛋白MTR (Hypothetical protein MTR,5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶,5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase,MTR)是叶酸代谢通路上的一个酶^[8]。叶酸作为一种甲基供体,对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用^[9]。叶中EST-2与假定衰老相关蛋白[柏杉]的氨基酸序列一致性为98%,假定衰老相关的蛋白质,来源豌豆,它的功能与1-氨基环丙烷基-1-羧酸(ACC)合酶和ACC氧化酶息息相关,ACC合酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成途径中的重要限速酶^[10]。镉胁迫下,叶中假定衰老相关蛋白表达下调,诱发了ACC合成酶和ACC氧化酶的表达量降低,直接抑制乙烯的生物合成^[11],进而抵御叶在Cd胁迫下带来的生物活性的降低和衰退。

EST-3和EST-4在Blastn和Blastx的序列比对中分别与DNA聚合酶Ⅲα亚基、β-葡萄糖苷酶有较高的序列一致性。DNA聚合酶Ⅲα亚基是DNA聚合酶Ⅲ的一个组成单位,DNA聚合酶Ⅲ全酶(DNA polymerase Ⅲ holoenzyme)是DNA复制中关键酶,能够进行引物链的延伸并完成DNA的前导链和后随链合成的酶,全酶是一个多亚基酶,具有很高的复制速率和延伸能力^{[12, 13]}。叶中DNA聚合酶Ⅲ表达量上调,机体遗传分子复制机制更加活跃,弥补镉胁迫带来的损伤。β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶,它属于纤维素酶类,是一种能催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶^[14]。β-葡萄糖苷酶参与生物体的糖代谢,对维持生物体的正常生理功能起着重要作用^[15]。果中β-葡萄糖苷酶表达下调,说明镉胁迫下,籽粒苋果实中糖代谢缓慢,进而造成能量代谢减慢。

利用植物修复技术治理土壤镉污染是今后土壤生态修复的研究热点,本研究利用DDRT-PCR技术,以期在mRNA水平揭示籽粒苋的镉富集耐受能力。由于差异显示技术的局限性(假阳性高、可重复性差、扩增片段短等)^[16],本研究未能获得较多的与镉耐受富集相关的基因。但根据研究结果结合相关文献,本实验获得的4个差异片段的确参与了籽粒苋对镉胁迫的应答,这不仅有助于籽粒苋抗镉胁迫分子机制的深入研究,也为今后在分子水平筛选耐镉胁迫植物奠定了一定的基础。

(1)筛选出了适合于籽粒苋根的随机引物(RP18、RP19、RP20、RP23、RP24)与锚定引物(AP1、AP2和AP3)组合,适合于叶和果的随机引物(RP8、RP14、RP18、RP19、RP20、RP23、RP24)与锚定引物(AP1、AP2和AP3)组合。

(2)经过DDRT-PCR分析、生物信息学分析和RT-PCR验证,得到了3条下调表达片段(EST-1、EST-2和EST-4)和1条上调表达片段(EST-3)。

(3)镉胁迫下,籽粒苋根中蛋白质代谢受到一定抑制。叶中假定衰老相关蛋白活性降低,抑制叶中的细胞生物活性降低和衰退;叶中DNA聚合酶Ⅲ表达量上调,叶中遗传分子复制机制更加活跃,细胞代谢旺盛。果中β-葡萄糖苷酶活性降低,引起糖代谢缓慢,果实中能量代谢受到一定抑制。