2015, Vol. 34文章信息
- 王婷, 刘丽丽, 张克强, 沈仕洲, 冯洁, 王风, 杜会英, 高文萱
- WANG Ting, LIU Li-li, ZHANG Ke-qiang, SHEN Shi-zhou, FENG Jie, WANG Feng, DU Hui-ying, GAO Wen-xuan
- 牛场肥水灌溉对土壤氨氧化微生物的影响
- Effects of Cattle Farm Effluent Irrigation on Community Structure and Abundance of Ammonia-Oxidizing Bacteria in Soil
- 农业环境科学学报, 2015, 34(9): 1737-1746
- Journal of Agro-Environment Science, 2015, 34(9): 1737-1746
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2015.09.016
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文章历史
- 收稿日期: 2015-03-16
2. 天津师范大学生命科学学院, 天津 300387;
3. 天津大学化工学院, 天津 300072
2. Tianjin Normal University, College of Life Sciences, Tianjin 300387, China;
3. Tianjin University, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin 300072, China
施肥是影响土壤质量及其可持续利用最深刻的农业措施之一,会对土壤结构、生物肥力和生产力产生重要影响[1]。施肥制度的不同也可导致土壤微生物种群数量和活性不同[2],氨氧化微生物作为硝化过程的主要驱动者不可避免地会受到其影响[3]。氨氧化细菌被认为是影响硝化作用速率的主要因素[4],是研究土壤微生物生态学的模式生物[5]。因此,在微生物生态学研究中氨氧化细菌受到了广泛关注[6, 7, 8, 9]。2005年Treusch等[10]在土壤环境中发现了具有氨氧化功能的泉古菌amoA基因,首次揭示了土壤中存在难培养的中温泉古菌氨氧化基因之后,氨氧化古菌也成为研究土壤硝化速率的重要土壤微生物。所以研究长期不同施肥制度下土壤氨氧化细菌和古菌群落结构多样性及丰度的变化,将为提高氮素利用效率、检测土壤质量变化提供重要依据。
1997年Rotthauwe等[11]用amoA-PCR方法研究了自养氨氧化细菌群落的结构,此后amoA基因被广泛用于各种生态型自养氨氧化细菌群落结构的研究。Chu等[12]、辜运富等[13]运用 PCR-DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis,变性梯度凝胶电泳)方法研究了长期施用无机肥料和有机肥料对土壤氨氧化菌群落结构的影响,结果表明无机氮肥与有机氮肥配施、磷肥、钾肥对氨氧化细菌群落的影响不同,氮、磷、钾肥配施可促进可耕土壤的硝化作用。Colloff等[14]的研究显示,施用尿素的土壤中amoA基因的多样性未见增长。程林等[15]用PCR-RFLP(Restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)方法研究长期施肥定位试验的土壤,发现长期单施氮肥和长期种植作物均增加了土壤中氨氧化细菌的多样性和丰富度,单施磷肥和氮磷共施降低了土壤中氨氧化细菌的多样性和丰富度。武传东等[16]运用PCR-RFLP的方法研究长期施用氮肥和磷肥对土壤氨氧化古菌多样性的影响,结果表明不同施肥方式下氨氧化古菌多样性变化较大,而系统进化定位没有显著变化。
目前关于施肥方式对氨氧化微生物的研究,主要集中在施肥种类,单施化肥、单施有机肥以及化肥有机肥混施等施肥方式对氨氧化微生物的影响[17, 18, 19, 20],很少有研究施肥次数对氨氧化微生物的影响。而且大多数研究的都是固体施肥方式,几乎没有液态牛场肥水灌溉对氨氧化微生物的影响。本文着重研究牛场肥水不同灌溉次数以及浓度对氨氧化微生物的影响。
1 材料与方法 1.1 研究区概况本实验以河北省徐水县梁家营长期定位施肥试验田为研究对象,地处太行山东麓,河北省中部,北纬38°09'~39°09',东经115°19'~115°46'。属大陆性季风气侯,年平均气温11.9℃,年均降水量546.9 mm,年日照时数平均2 744.9 h。
实验田每个小区长9 m、宽6 m,面积54 m2,四周1 m土体内用塑料布隔开,种植方式为冬小麦-夏玉米。共设5个处理,施肥方式及灌溉肥水沼液原液成分见表 1和表 2。
土壤样品在小麦收割后(6月中旬)进行采集,每个小区随机选取5点采集0~5 cm的表层土,去除根系、杂草、土壤动物和石块等杂质后混匀,于-20℃冰箱保存。
1.3 土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌群落丰度分析 1.3.1 主要试剂FastDNA®SPIN Kit For Soil(MP Biomedicals,LLC)试剂盒,Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0(TaKaRa)试剂盒,Premix TaqTM(EX TaqTM Version 2.0 plus dye),限制性内切酶HhaI(TaKaRa)、MspI(TaKaRa),pMD19®-T Vector,大肠杆菌(Escherichia coli),PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 土壤微生物总 DNA提取土壤总DNA提取采用FastDNA® SPIN Kit For Soil(MP Biomedicals,LLC)试剂盒。称取500 mg土壤样品,按试剂盒说明书进行土壤总 DNA提取。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取 DNA片段大小,并用NanoDrop核酸蛋白仪(ND-1000)测定 DNA的浓度及质量,于-20℃冰箱中保存。
1.3.3 末端限制性酶切片段多态性(T-RFLP)按照表 3进行PCR扩增,扩增产物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0(TaKaRa)试剂盒进行纯化回收,用NanoDrop核酸蛋白仪(ND-1000)检测纯化产物浓度及质量。产物回收后,对氨氧化古菌 (AOA)和氨氧化细菌(AOB)amoA基因扩增产物分别用内切酶Hha I(TaKaRa)和内切酶Msp I(TaKaRa)进行酶切[21],反应体系和条件按各内切酶说明书进行。将酶切产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。
通过Shannon-Wienner、Simpson和Pielou多样性指数模型获得AOA和AOB群落多样性指数[22, 23]。
1.3.4 克隆及测序分析挑选T-RFLP片断较丰富的样品(T4的0~5 cm土层样品)进行克隆文库构建。选用不带荧光标记的引物进行基因克隆PCR扩增,将有目的条带的PCR扩增产物,用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0(TaKaRa)试剂盒进行纯化,纯化后的产物与pMD19®-T Vector载体进行连接反应。
连接后将10 μL连接产物转化到100 μL大肠杆菌JM109感受态细胞中,涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上,37℃过夜培养后进行蓝白斑筛选,挑取白斑克隆子,用通用引物M13F(5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3',TaKaRa),M13R(5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3',TaKaRa)进行菌落 PCR扩增,选取大约 100个克隆子扩大培养后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。
1.3.5 amoA基因序列测定及系统发育树的构建将测序所得序列利用Vector NTI 11.5.1软件分析检查去除嵌合及怪异序列,处理后的序列在GeneBank数据库(http://www.ncbi.com)进行 Blast对比,获取相似度较高的基因序列;再分别以典型氨氧化细菌和氨氧化古菌Blast结果相似性大于90%的序列为参比序列,利用Clustal X和 Mega 5.0软件多重比对,采用Mega 5.0软件中 Neighbor-joining法分别构建氨氧化细菌和氨氧化古菌的系统进化树[23],自展系数为 1000。
2 结果与分析 2.1 氨氧化细菌amoA基因的 T-RFLP分析从MspI酶切 AOB amoA基因 T-RFLP分析结果(图 1)T-RFLP特征片段(T-RFs)可以看出,酶切后所有样品均得到 5个主要片段长度(60 bp、66 bp、156 bp、235 bp和 256 bp),其中:60 bp片段在各个样品中平均约占35.98%,最多不超过 46%,最少不低于25%;66 bp片段在各个样品中平均约占 13.8%,最多不超过 15%,最少不低于7%;156 bp片段在各个样品中平均约占 10.7%,最多不超过 13%,最少不低于5%;235 bp在各个样品中平均约占 10.1%,最多不超过13%,最少不低于7%;256 bp片段在各个样品中平均约占 11%,最多不超过 17%,最少不低于7%。说明这5个片段代表的类群是构成土壤 AOB的优势微生物种群,且不同施肥处理对土壤氨氧化细菌优势菌群的影响不明显。
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| 图 1 不同处理氨氧化细菌（AOB）amoA的T-RFs片度百分比 Figure 1 Relative abundance of AOB amoA T-RFs in different fertilization treatments |
分析表 4可知,Shannon-Wiener指数(H')T5>CF>T4>CK>T11,优势度Simpson指数(Ds) CF>T4>T5>CK>T11,物种均匀度Pielou指数(E)T5>CF>CK>T4>T11。3个指数T11均最低,说明T11处理一定程度上降低了土壤氨氧化细菌的多样性。Shannon-Wiener指数(H')与Pielou指数(E)表明T5处理能够增加土壤中氨氧化细菌的多样性和丰富度,T4处理与 CK差异不大。
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氨氧化古菌 AOA的amoA功能基因用HhaI内切酶酶切后,得到3个主要片段,64 bp、68 bp、133 bp。对T-RFs片段进行分析后得到图 2,与图 1比较可以看出,AOA的 T-RFs数目比AOB少,分布相对更加均匀。分析图 2可知:64 bp片段在各个样品中平均约占24.38%,最多不超过35%,最少不低于15%;68 bp片段在各个样品中平均约占55%,最多不超过 65%,最少不低于40%;133 bp片段在各个样品中平均约占7.1%,最多不超过 5%,最少不低于5%。说明这3个片段代表的类群是构成土壤 AOA的优势微生物种群,不同施肥处理对土壤氨氧化古菌优势菌群的影响不明显。
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| 图 2 不同处理氨氧化古菌（AOA）amoA的T-RFs片度百分比 Figure 2 Relative abundance of AOA amoA T-RFs in different fertilization treatments |
分析表 5可知,Shannon-Wiener指数(H') T11>T5>T4>CK>CF,Simpson指数(Ds) T11>T5>CK>T4>CF处理,Pielou指数(E)T11>T5>CF>CK>T4。3个指数中均以T11处理最高,说明T11处理能够增加土壤中氨氧化古菌的多样性。CF处理的Shannon-Wiener指数(H')和Simpson指数(Ds)均最低,说明CF处理一定程度上降低了土壤氨氧化古菌的多样性。
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对于氨氧化细菌克隆文库,一共挑选了110个阳性克隆子进行测序分析,通过NCBI网站的 BLAST比对分析,剔出了假阳性克隆,结合酶切分型分析最终获得了29个有代表性的操作分类单元(OTU),与典型氨氧化细菌进行比对,构建系统发育树(图 3)。
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| 图 3 基于amoA序列的氨氧化细菌系统发育树（邻接法） Figure 3 Neighbour-joining tree of β-ammonia oxidizing bacteria based on analysis of amoA sequences |
氨氧化细菌系统发育树构建所使用的 Cluster命名形式为此前研究报告中所普遍接受的命名形式。从系统发育树可知,测得的多数序列属于β-变形菌门,主要包括Nitrosospira cluster 3a、Nitrosospira cluster 3b和Nitrosomanas cluster 6三个属。结合氨氧化细菌的T-RFLP结果与OTUs序列的模拟酶切比对结果分析(表 6),其中属于Nitrosospira cluster 3a的片段包括 60 bp、156 bp和256 bp,属于Nitrosospira cluster 3b的片段包括 60 bp和 235 bp,而235 bp剩余部分属于Nitrosospira cluster 11和Nitrosomanas cluster 6,60 bp片段则分布在 3个 Cluster中。为进一步将属于Nitrosospira和Nitrosomanas这两个属的氨氧化细菌分开,选用TaqI内切酶对测得的序列作进一步分析。发现属于Nitrosomanas cluster 6酶切后得到的主要片段为209 bp,而Nitrosospira属酶切后的片段主要为285 bp。利用MspI和TaqI这两种内切酶对测序结果进行统计分析,可以将氨氧化细菌Nitrosospira和Nitrosomanas两个属的片段加以区分。
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对于氨氧化古菌克隆文库,一共挑选了100个阳性克隆子,NCBI网站的 BLAST比对分析,剔出了假阳性克隆,结合酶切分型分析最终获得了22个有代表性的操作分类单元(OTU)。通过Mega软件将这些序列构建系统进化树(图 4)。
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由图 4可以看出,本实验的氨氧化古菌大部分属于Cluster S,它们分别与来自耕地土壤、保护地土壤和湖泊沉积物等的氨氧化古菌聚集在同一分支上,结合氨氧化古菌的T-RFLP结果与OTUs序列的模拟酶切比对结果分析(表 7),发现占克隆子比例28.6%的AR-3与来自中国荷斯坦奶牛瘤胃样品的氨氧化古菌Clone属于同种,推测这可能由于本研究灌溉用的牛场肥水增加了土壤的氨氧化古菌的群落多样性。少数氨氧化古菌序列属于Unclassified-Archaea(未分类古菌),与 NCBI数据库中序列同源性较低。
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本文采用 T-RFLP的方法,研究了不同施肥制度下氨氧化细菌和氨氧化古菌的群落结构变化。分析氨氧化细菌群落多样性结构指数可知(表 4),Shannon-Wiener指数(H')为T5>CF>T4>CK>T11,物种均匀度Pielou指数(E)为T5>CF>T4>CK>T11,说明T5处理增加了氨氧化细菌的群落多样性,T11处理一定程度上降低了氨氧化细菌的群落多样性。这两个处理的灌溉方式分别为:T5两次肥水(清水:沼液=2:1)灌溉(小麦越冬期和拔节期);T11两次肥水(清水:沼液=1:1)灌溉(小麦越冬期和拔节期)。说明同样灌溉时间多次灌溉肥水,过高浓度的牛场肥水灌溉不利于氨氧化细菌的群落多样性发展。同时施加的氮肥过低(CK)也不利于氨氧化细菌的群落多样性发展。
结合各处理T-RFLP结果(图 1),发现235 bp片段的百分比含量在各处理间为T11>CK>CF>T4>T5,T11中含量最多,CK次之,T5则最低。这与各处理的群落多样性相反,同时发现施加高含氮量的肥水(T11)或无机肥(CF)与不施氮肥(CK)235 bp片段含量差别不大,说明235 bp片段代表的氨氧化细菌在群落中所占比例相对稳定。这可能是由于这类菌对铵浓度敏感性较差,当施加高浓度氮肥和低浓度的氮肥甚至不施加氮肥对该类菌的影响均不大,而在氮肥过高或者过低的条件下,其他对铵浓度敏感的菌除了受到铵浓度的影响,还会受到铵浓度不敏感菌的抑制,从而影响群落多样性。一般认为不同氮素浓度会引起氨氧化细菌种属的改变,这种改变是由于不同类型氨氧化细菌对基质[24]和铵浓度的敏感度不同所致[25]。这与本研究结果一致。
结合氨氧化细菌系统发育树可知,235 bp片段代表的是Nitrosospira cluster 3b和Nitrosomanas cluster 6。先前Kowalchuk等[26]的研究中发现施用氮肥刺激了Nitrosospira cluster 3的生长,导致其成为土壤中的优势菌属,而Avrahami等[27]指出Nitrosospira cluster 3不一定需要在较高铵浓度下才能成为优势菌属,Chu等[28]发现在不施肥处理下Nitrosospira cluster 3也是优势菌属。王亚男等[17]亦证实,Nitrosospira cluster 3不仅在施用高氮条件下是优势菌属,即使在氮肥施用适中,甚至不施氮肥的对照处理中也是优势菌属。说明Nitrosospira cluster 3对铵浓度不敏感,与本研究结论相符。此外,本研究还发现Nitrosomanas cluster 6也与Nitrosospira cluster 3类似,对铵浓度不敏感,而这在之前几乎没有报道过。系统发育树显示不同施肥方式的长期定位试验土壤中氨氧化细菌的优势菌为Nitrosospira cluster 3属,也包括有少量的Nitrosomanas cluster 6属,这与汪峰[29]、王亚男[17]等的结论是一致的。
3.2 施肥处理对土壤氨氧化古菌群落多样性的影响分析氨氧化古菌群落多样性结构指数(表 5),Shannon-Wiener指数(H')T11>T5>T4>CK>CF,Simpson指数(Ds)T11>T5>CK>T4>CF,可见T11处理Shannon-Wiener指数(H')和Simpson指数(Ds)均最高,CF处理均最低,说明T11处理增加了土壤氨氧化古菌的多样性,CF处理一定程度上降低了土壤氨氧化古菌的多样性。先前 Di等[30]的研究中,氨氧化菌选择在不同氮素水平土壤中生长,但氨氧化古菌群落在过高浓度的氮素土壤中的生长被抑制,而由表 1可知各个处理施肥的氮含量为T11>CF>T5>T4>CK,T11处理和CF处理施肥的氮素含量最高,CF处理氨氧化古菌的多样性最低,而T11处理氨氧化古菌的多样性最高,说明同样高浓度氮素水平下,牛场肥水相比无机肥料,能够增加土壤氨氧化古菌的多样性。
结合各处理的T-RFLP结果分析,发现 68 bp片段代表的最大优势菌,在各处理中随着所占比例的降低,群落的多样性和均匀度反而增加。68 bp片段在各处理所占比例为T4>CF>CK>T5>T11,虽然T11处理的最大优势菌群所占比例最小,但种群的多样性和均匀度高。这可能由于68 bp片段代表的优势菌群大量生长繁殖,抑制了其他菌群的生长,影响了氨氧化古菌的群落多样性。同时T-RFLP结果显示,64 bp、116 bp和133 bp片段在各处理中所占比例为T11>T5>CK>CF>T4,与68 bp的分布成反比,推测这3个片段代表的菌群可能受到68 bp片段代表的最大优势菌抑制,从而影响群落结构多样性。结合氨氧化古菌的T-RFLP结果(图 2)与OTUs序列的模拟酶切比对结果分析(表 7)以及氨氧化古菌系统发育树(图 4),推测68 bp片段代表的最大优势菌即为克隆子AR-3代表的菌属。
目前,按照amoA基因序列将氨氧化古菌分为Cluster S和 Cluster M两大类,前者主要分布在陆地土壤/淡水沉积物环境中,后者主要存在于海洋/海底沉积物中[31, 32]。根据氨氧化古菌amoA基因序列构建的系统发育树看出,土壤中优势氨氧化古菌绝大多数序列隶属于土壤/淡水沉积物分支,少数属于Unclassified-Archaea(未分类古菌)[32],其中最大优势菌与来自中国荷斯坦奶牛瘤胃样品的氨氧化古菌Clone属于同种,推测牛场肥水灌溉增加了土壤的氨氧化古菌的群落多样性。
4 结论(1)同样灌溉时间多次灌溉肥水,过高浓度的牛场肥水(清水:沼液=1:1)灌溉不利于氨氧化细菌的群落多样性发展;施加的氮肥过低(CK)也不利于氨氧化细菌的群落多样性发展。
基于amoA基因建立的系统进化树显示,土壤氨氧化细菌大部分属于Nitrosospira(占87%),少数属于Nitrosomanas(占13%)。
(2)同样高浓度氮素水平下,牛场肥水灌溉有利于增加土壤氨氧化古菌的多样性,而施用无机肥则会降低群落多样性。群落中的最大优势菌的生长繁殖可能会对其他菌产生抑制,从而影响群落的多样性。
氨氧化古菌系统发育树显示,供试土壤中大部分氨氧化古菌amoA序列与Cluster S聚为一类,少数属于Unclassified-Archaea(未分类古菌)。最大优势菌与来自中国荷斯坦奶牛瘤胃样品的氨氧化古菌Clone属于同种,推测牛场肥水灌溉增加了土壤的氨氧化古菌的群落多样性。
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