我国秸秆资源丰富，秸秆年产量近8亿t，其中，小麦秸秆产量为10 718.95万t，占全国秸秆总产量的12.73%^[1]。利用小麦秸秆来进行厌氧发酵产沼气能够有效缓解能源紧张状况。但由于秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素形成了结晶度和聚合度较高的晶体结构，在自然条件下晶体很难被打破，从而限制微生物对秸秆的利用，导致秸秆发酵启动慢、产气量低^[2]。国内外多项研究表明，利用NaOH预处理秸秆有很好的效果^{[3, 4]}。丁凯扬等^[5] 和何艳峰等^[6] 用6％ NaOH对秸秆进行预处理，产气量显著提高，但高浓度的碱会腐蚀设备和造成二次污染，增加了处理成本。因此，选用环保添加剂与低浓度的NaOH联合对秸秆进行预处理显得尤为必要。本试验选用新型造纸助剂绿氧作为添加剂，其较强的润湿、渗透能力可以促进NaOH迅速将纤维表面润湿并渗透到内部，加速胶质溶解及木素脱除反应^[7]。同时，绿氧本身无毒无害，在自然界中能够自动生物降解，不造成环境污染。王荣等^[8]和董昭等^[9]研究发现，在NaOH中添加0.05%的绿氧可以加速细胞间木素的脱除，使纤维分离点提前。王苹等^[10]利用2%NaOH和不同浓度的绿氧对玉米秸秆进行预处理后厌氧发酵，发现2%NaOH和0.05%绿氧联合预处理组的产气量比单独碱预处理组的产气量高1.1倍。另外，不同的季节发酵温度差异较大，且温度是影响厌氧发酵的重要因素，楚莉莉等^[11]研究发现，小麦秸秆在10～40 ℃（以5 ℃为一个梯度）下进行厌氧发酵，原料产气速率随温度的上升而上升。李金平等^[12]研究也表明，在35 ℃左右，秸秆的沼气产量和甲烷的体积分数随着环境温度增长而提高，在15 ℃左右，沼气产气量显著性降低。李秀辰等^[13]研究发现，中温（35 ℃）发酵产气潜力和系统稳定性优于高温（55 ℃）发酵。故本试验选择最佳绿氧处理浓度0.05%和不同浓度的NaOH在低温（15 ℃）、中温（35 ℃）、高温（55 ℃）下，对秸秆进行联合预处理，旨在探寻不同温度下最佳的NaOH和绿氧组合预处理浓度，以期在提高小麦秸秆产气率和减少NaOH用量的同时，为不同气候条件下秸秆预处理后发酵产沼气提供理论依据和技术支持。

风干的小麦秸秆取自西北农林科技大学试验田，用切割机将麦秆切成2～3 cm的小段。接种物沼液取自西北农林科技大学附近沼气示范村正常运行的厌氧发酵池，沼气池运行时间为3年，主要以牛粪、猪粪等为原料，沼气池的池温在12~18 ℃之间。试验中所用沼液均在相应的试验温度下驯化7 d，以保证微生物的适应性。其中，试验所用绿氧试剂是含有氮、氧等配位原子的高分子类表面活性剂，购买于河南省道纯化工技术有限公司，各原料初始理化性质如表 1所示。

表 1 原料和接种物初始理化性质 Table 1 Initial characteristics of wheat straw and inoculum solution

表选项

试验所用装置为陕西省循环农业工程技术研究中心自行设计的可控型恒温厌氧发酵装置，如图 1所示^[14]，主要由控温装置、发酵装置及集气装置三部分组成，各装置间用玻璃管和橡胶管连接。控温装置是以温控仪和继电器来显示和控制发酵温度，温度波动范围±1 ℃。发酵装置为橡胶塞密封的1 L三角瓶，橡胶塞上带有导气孔，三角瓶瓶身有出样口。集气装置是由1个1 L三角瓶和1个2.5 L集水壶用导气管连接而成，集气三角瓶用带有进气孔和导水孔的橡胶塞密封，利用可防止水分挥发的小口集水壶来收集产气所排水，然后用量筒测量。

图 1 恒温厌氧发酵装置图 Figure 1 Device for anaerobic digestion at constant temperature

图选项

将0.05%的绿氧分别和质量分数为1%、2%、3%、4%的NaOH配制成混合液，分别将不同配比的混合液倒入装有300 g小麦秆的小塑料桶中，保持固液比为1∶8（W/V），秸秆拌匀后盖上塑料桶盖。分别在三个温度下（15、35、55 ℃）进行四种混合液处理，处理时间为7 d，每天搅拌一次。为阐述方便，将在15 ℃下0.05%的绿氧和1%、2%、3%、4% NaOH组合预处理的样记为A1、A2、A3，A4，35 ℃下处理的样记为B1、B2、B3、B4，55 ℃下处理的样记为C1、C2、C3、C4，三个温度下未做预处理的秸秆样分别记为CK1、CK2、CK3。不同温度下预处理后的秸秆再在对应的预处理温度（15、35、55 ℃）下进行厌氧发酵试验，在发酵瓶中装入预处理后的秸秆和水的混合物500 g，保持总的固体浓度为8%，接种物200 g，每组试验设3个重复。

以下指标所测样均由发酵瓶身的出样口处取出，整个过程保证发酵样不和空气接触。其中，总碱度、挥发性脂肪酸（VFA）、pH值、还原糖均为每5 d测定一次。

（1）产气量：采用排水集气法，待所产气体点燃呈淡蓝色火焰后，每天早上10：00测量水的体积。

（2）总碱度：溴甲酚绿-甲基红指示剂滴定法。

（3）VFA含量：采用比色法测定。

（4）pH值：智能pH计（pHS-3CT型，武汉四方光电科技有限公司）。

（5）甲烷成分：沼气分析仪（Gasboard-3200L，武汉四方光电科技有限公司）。

（6）还原糖：DNS比色法。

（7）干物质（TS）和挥发性干物质（VS）：烘干法和马弗炉焚烧法。

（8）电镜观察：扫描电镜（JSM-6360LV，日本电子株式会社）

绘图用 Origin 7.5 软件，方差分析用SPSS Statistics 17.0进行。

根据表 2可知，在相同的处理条件下，绿氧和NaOH联合预处理样与NaOH单独预处理样的VFA、还原糖含量之间差异性显著（P<0.05）。其中，联合预处理的还原糖含量显著高于NaOH单独预处理。说明添加绿氧能够加快秸秆的水解酸化过程，为后期厌氧发酵提供原料。故本试验未选择单独NaOH预处理的样进行厌氧发酵试验，而是重点研究联合预处理的效果。由表 2可知，各处理的pH范围为6.8～8.1。李杰等^[15]研究表明，产甲烷菌的最适生长pH范围为6.8～7.8。故除A3、A4外其余各处理的pH均在适宜的范围内。各处理的VFA范围为365.08～1 940.04 mg·L^-1。其中，15 ℃处理下A1～A4的VFA均较小，35 ℃处理下B1～B4的VFA范围为1 174.60～1 428.57 mg·L^-1，55 ℃处理下C1～C4的VFA范围为1 167.22～1 940.04 mg·L^-1。35、55 ℃处理后的秸秆中VFA含量均较15 ℃高，说明在预处理过程中不同温度下处理的水解酸化程度不同。牛华^[16]的研究发现，在较高的预处理温度下，绿氧可大幅度降低NaOH溶液的表面张力，加速NaOH向秸秆内部的润湿和渗透，使秸秆更易被水解酸化，为产甲烷微生物提供更多的VFA，从而改变系统的pH。由于VFA是厌氧发酵过程中生物代谢的重要中间产物，甲烷菌主要利用VFA中的乙酸生产甲烷^[17]，说明预处理可以影响发酵初始环境并缩短停滞时间。各处理的还原糖含量的范围为0.314～0.510 g·L^-1，其中，相同温度不同浓度的处理之间还原糖含量有显著性差异（P<0.05），说明NaOH浓度对于秸秆水解产生还原糖有显著性影响；相同温度下各处理的TS含量之间差异不显著，各处理高浓度和低浓度之间的VS差异显著（P<0.05），高浓度处理组的VS含量较低，说明预处理过程中VS转换成还原糖等营养物质较多。以上数据说明，秸秆预处理能改变秸秆发酵初始环境和提供发酵所需中间产物，为秸秆进入厌氧发酵阶段提供很好的条件。

表 2 预处理后秸秆的基本特性 Table 2 Basic characteristics of wheat straw after different pretreatments

表选项

各处理组的日产气量变化如图 2所示，不同温度下各处理组的产气趋势不同。15 ℃下，除A3外，其余各组的日产气量呈先升高后下降的趋势，A3在发酵后期达到产气高峰；35 ℃下，各处理组的变化趋势类似，均呈波动状态，并且都经历了几个明显的波峰，各处理的产气主要集中在发酵前期；55 ℃下，各处理组的日产气量在短暂的升高后均出现产气停止，在20 d后，C2、C3、C4的产气量急速增加，产气主要集中在发酵后期。

图 2 不同处理下秸秆日产气量变化 Figure 2 Variations of methane production rates in different pretreatments

图选项

在15 ℃下，A3产气趋势稳定，在31 d出现第一个产气高峰，产气量为192 mL，A1、A2、A4、CK1在20 d后均不产气。不产气的原因可能有两个，第一，在较低的温度下，绿氧和NaOH作用不明显，使秸秆的破坏程度有限（图 2），且预处理后的VFA较低（表 2）。第二，低温条件下菌种的活性降低，系统中不产甲烷菌产生了大量的有机酸，使发酵罐内pH下降，抑制了产甲烷菌的活性，使发酵提前停止^[11]。

在35 ℃下，除CK2外，B1、B2、B3、B4的最大日产气量都在10 d左右出现，其值分别为710、940、830、860 mL，且各处理组的产气主要集中在发酵前期。这是由于在该温度下，各处理组初始pH在7.0~7.3之间，初始VFA在1 174.60～1 428.57 mg·L^-1之间（表 2），适宜的pH值和较高的VFA含量为厌氧发酵产甲烷菌提供适宜的发酵条件，使甲烷菌在前期能快速地将VFA在产乙酸阶段转换为甲烷菌所需的原料，最终转换为甲烷。这与庞云芝等^[18]的研究一致，其发现中温条件下NaOH处理玉米秸秆的产气量提高了263.6%。本试验结果与前人研究均表明把中温消化和化学预处理结合在一起，可显著提高秸秆的厌氧消化效率和产气量。

在55 ℃下，各处理组的产气均在5 d后停止，产气较好的处理组主要集中在厌氧发酵后期产气，这主要与进入发酵阶段后，大量VFA积累使甲烷菌活性受到抑制有关。由表 2可知，C4的初始VFA达到1 940.04 mg·L^-1，说明在55℃下较高浓度NaOH和绿氧可加速秸秆的分离和破坏（图 7），直到30 d左右，C2、C3、C4的产气量急速增加，峰值分别达到1020、930、1060 mL，这是由于好氧菌与兼性菌不断消耗装置中的氧气，使得发酵环境逐渐符合沼气发酵微生物的厌氧需求^[19]，VFA 被利用消耗，发酵液中酸浓度降低，pH值回升至7.3～7.8。Fernández-Cegrí等^[20]也研究发现，相对于常温下利用NaOH对秸秆预处理后进行发酵，较高的温度下NaOH预处理秸秆能够显著提高秸秆厌氧发酵产气速率。

累积甲烷产气量是衡量秸秆厌氧发酵产沼气效果的最重要指标，各处理组厌氧发酵的累积甲烷产量如图 3所示。在15 ℃下，A3的累积甲烷产量最大，为11.4 mL·g^-1 VS，A1、A2、A4的产气均不理想，这可能由以下原因造成：第一，在15 ℃下，NaOH和绿氧对秸秆的处理效果不理想（图 7），宋籽霖等^[21]研究也发现低温下NaOH的处理效果不如较高温度下明显。第二，在低温条件下甲烷菌的活性不高，使得生物降解速度有限，导致产气量低^[22]，这与本试验研究一致。但本试验所证明绿氧在低温下对秸秆处理效果不理想的结果与王苹等^[10]的研究不一致。

图 3 不同处理下累积甲烷产量变化 Figure 3 Variations of cumulative methane production in different pretreatments

图选项

在35 ℃下，累积甲烷产量在95.85~122.35 mL·g^-1 VS之间，B2的累积甲烷产量最大，为122.35 mL·g^-1 VS，其后依次为B3、B1、B4，其值分别为99.92、99.23、95.85 mL·g-1VS。各处理组的产气效果均较好，这与在35 ℃下预处理对秸秆的有效破坏和发酵环境适宜有关。由表 2可知，在该温度下各处理的pH和VFA均满足甲烷菌的要求，使得各处理组的累积甲烷产气量高。其中，B2的累积甲烷产量较CK2提高93%。同时，B2达到80%甲烷产气量的时间较B1、B3、B4分别提前5、6、8 d，说明B2能显著提高产气速率，缩短发酵周期。Zheng等^[23] 研究发现，在35 ℃下，2% NaOH处理的小麦秆的累积甲烷产气量比未处理组的高73.4%。本试验也证明了2% NaOH和绿氧联合预处理可使累积甲烷产量显著提高。

在55 ℃下，累积甲烷产量在12.22~68.15 mL·g^-1 VS之间，C2的累积甲烷产量最大，为68.15 mL·g^-1 VS，其后依次为C4、C3、C1，其值分别58.15、47.07、12.22 mL·g^-1 VS。其中，C2的累积甲烷产量较CK3提高87%，55 ℃下，产气主要集中在发酵后期，主要由于在高温条件下，绿氧和NaOH对秸秆的破坏作用较15、35 ℃明显（图 7）。牛华等^[16]研究表明，在较高的温度下，由于绿氧可以使处理液的氧化还原电位迅速下降，而脱木质素的速度和处理液的还原性相一致，加速了木质素的降解，木质素与碳水化合物之间的键被破坏，纤维素大分子被降解为小分子，从而使发酵系统中的VFA大量积累，造成前期各处理组出现酸抑制现象，但发酵后期大量的VFA被产甲烷菌利用转化为沼气，产气量急速增加。因此，针对高温下前期易酸化的特点，可以在生产实践中调节系统pH，促进产气高峰的提前。试验结果表明，在15 ℃下，A3处理效果最好，在35 ℃下，B2的处理效果最好，在55 ℃下，C2的处理效果最好。

根据本试验结果，由于15 ℃的几个处理中，只有A3产气较好，因此无法做线性回归分析，本试验分别对35、55 ℃下各处理的累积甲烷产量F（x）和NaOH、绿氧处理浓度x进行回归分析，所得到的累积甲烷产量F（x）与处理浓度x的回归方程均达到显著水平，如表 3所示。

发酵过程中，料液碱度对发酵过程中出现的过酸过碱物质，能起到一定的缓冲作用。VFA是甲烷菌利用的主要中间产物，但VFA的积累会导致pH值的下降，使甲烷菌活性被抑制。因此，VFA和碱度的比值（VFA/碱度）可以较好地反映系统的缓冲能力。当VFA/碱度<0.4时，系统缓冲能力强；当VFA/碱度在0.4～0.8之间时，系统缺乏缓冲能力；当VFA/碱度>0.8时，系统即将发生酸化^[24]。由图 4可知，在15 ℃下，A3的VFA/碱度始终<0.4，说明A3发酵液的缓冲能力较强，故A3在整个发酵过程中产气最稳定。而A1、A2、A4、CK1的VFA/碱度均在0.4～0.8之间变化，这可能是由于各处理组发生不同程度的酸化，导致VFA大量积累，削弱系统自身缓冲能力，甲烷菌的生长受到抑制，从而使各处理组在15 d后出现了产气停止现象。在35 ℃下，各处理组发酵初始时VFA/碱度均>0.4，这是由于初始时各处理组发酵液中的VFA含量较高（表 2）。但在5 d后，除CK2外，各处理的VFA/碱度均<0.4，且产气进入高峰期，说明在35 ℃下B1、B2、B3、B4的发酵液缓冲能力较强，这与Song等^[25]的研究一致。发酵液的环境满足微生物的繁殖，使前期所积累的VFA迅速被大量微生物分解利用产生甲烷，各处理组在5 d后先后达到产气高峰，迅速进入集中产甲烷阶段。在55 ℃下，各处理组的VFA/碱度在发酵后始终>0.4，说明发酵液中有大量的酸积累，使发酵系统出现酸抑制现象，各处理组的产气均停止，在发酵20 d以后，C2、C3、C4的VFA/碱度<0.4。说明系统自身的缓冲能力使得发酵环境逐渐满足甲烷菌的生长要求，前期累积的VFA被甲烷菌大量分解，使后期产气量迅速提高，达到产气高峰。而C1、CK3的VFA/碱度增加到0.7左右，说明系统缓冲能力弱，且VFA在不断积累，严重抑制甲烷菌的活性，导致产气终止。

图 4 不同处理VFA/碱度的变化 Figure 4 Variations of VFA/ total alkalinity in different pretreatments

图选项

如图 5所示，各处理组的还原糖变化呈波动趋势。在发酵5 d时，各处理的还原糖含量达到最大值，15、35、55 ℃的最大值分别为0.68 g·L^-1（A2）、0.91 g·L^-1（B4）、0.83 g·L^-1（C1），还原糖含量增加是由于经过预处理的小麦秸秆的比表面积明显增加，更有利于纤维素酶的吸附和水解，从而提高了酶水解液中还原糖的得率，为厌氧发酵提供原料。在15 ℃下，发酵5~15 d之间，除A3外，A1、A2、A4、CK1的还原糖降低到0.22～0.30 g·L^-1之间，A3的还原糖达到最大值为0.63 g·L^-1，而A3后期产气稳定，可能与A3前期还原糖含量高有关。Mechichi 等^[26] 研究发现，随着发酵的进行，发酵液中微生物不断利用还原糖产生各种挥发性酸，从而促进产气的增加。在35 ℃下，发酵5～15 d之间，各处理的还原糖含量急速减少到0.24～0.33 g·L^-1之间，而该时期为产气的高峰期，还原糖含量减少是由于水解酸化产生的还原糖用于微生物生长代谢和产能代谢，经发酵微生物作用不断被利用合成挥发性酸，促进产气量的增加^[27]。在15 d后，还原糖含量波动较平缓。在55 ℃下，发酵5~10 d期间，各处理组的还原糖含量降低到0.30～0.41 g·L^-1之间，而VFA含量增加，说明还原糖被利用转化为挥发性酸。在10~25 d之间，还原糖的含量变化较小，这是由于系统中由还原糖所转化的VFA不能迅速被甲烷菌利用产生甲烷，导致系统中各微生物的活动相互不协调，使降解率下降。在25 d后，C2、C3、C4的还原糖含量有所减少，而产气量增加，这与杨洋等^[28]的研究一致，即随着发酵的进行，系统中水解产生的还原糖被发酵细菌所利用，转化成VFA、醇类、有机酸等物质，最终转换成甲烷菌可以直接利用的底物，从而恢复产气。

图 5 不同处理还原糖的变化 Figure 5 Variations of sugar in different pretreatments

图选项

由图 6可知，在15 ℃下，A3的VS去除率最高（9%），比对照CK1高出89%。而A1、A2、A3的去除率则较低。在35 ℃下，B2的去除率最高（24%），比对照CK2高出83%。B1、B3、B4比对照CK2分别高出75%、80%、75%。在55 ℃下，C2的去除率最高（22%），比对照CK3高出77%。由试验结果可知，VS去除率和累积甲烷产气量的变化趋势相一致。这是由于在发酵过程中，绿氧和NaOH共同作用使秸秆中的纤维素、半纤维素等被水解为还原糖，而还原糖在发酵过程中不断被微生物利用产生挥发性酸，为产甲烷菌提供产甲烷前提物质，促进产气量的增加。在15 ℃下，A3的VFA和还原糖含量均在后期有较小程度的降低，而A3的累积甲烷产量也有一定程度的增加，A1、A2、A4的去除率较低主要是由于系统中的VFA等物质没有被甲烷菌利用转换为沼气。在35 ℃下，发酵5 d后，各处理组的VFA和还原糖含量较大幅度较少，而在5 d后各处理组先后达到产气高峰，说明该过程中秸秆的挥发性干物质等被微生物转化为生物气，导致VS去除率增加。贾丽娟等^[29]研究表明，35 ℃是中温厌氧发酵系统中功能微生物生长、新陈代谢的最适合温度。这可能是35 ℃下去除率均较高的原因之一。在55 ℃下，高温预处理效果明显，主要是由于在高温下绿氧对NaOH的促进作用显著，可加速木质素的脱除和胶质溶解，使发酵前期VFA大量积累，在发酵前期因酸积累影响产气，在酸化阶段，由于产甲烷菌不能将VFA转换为甲烷，故该阶段VFA和还原糖的量均维持在较稳定的范围内，在25 d后，C2、C3、C4系统中的发酵环境满足甲烷菌，三个处理组的产气量急速增加，是由于系统中大量VFA被产甲烷菌转化为沼气，这也是该阶段VFA含量迅速下降的原因，产气量的增加也使得VS去除率增加。

图 6 不同处理VS去除率的变化 Figure 6 Variations of different pretreatments on VS degradation

图选项

根据不同温度下的各预处理筛选得到15、35、55 ℃下的最佳处理分别为A3、B2、C2。为了更直观的反映预处理对秸秆结构的影响，对秸秆样进行电镜扫描，如图 7所示。未经预处理的小麦秸秆CK表面结构致密，纤维排列比较整齐，没有明显的破损和孔隙。经预处理后A3、B2、C2的结构都遭到不同程度的破坏、分离，纤维和纤维束变得柔软疏松，排列凌乱。而原来光滑的表面上出现了片状的物质，这可能是溶出的半纤维素和木质素。其中，B2、C2的处理效果比A3明显，且C2的处理效果最好。由表 2可知，A3的VFA显著小于B2、C2，且A3的还原糖含量大于B2、C2，说明在35、55 ℃下秸秆的木质素破坏更完全，纤维素、半纤维素裸露出来，还原糖更快地转换为产甲烷菌所需的VFA，这与电镜扫描结果一致。B2和C2的电镜扫描结果也表明在相同的处理浓度下，温度对于预处理效果也有显著性的影响，这与王小韦等^[30]在高温下利用NaOH对秸秆进行预处理后的电镜图一致，其发现秸秆中的纤维素在高温下会受到明显的破坏，同时，经过与王小伟论文中55 ℃下2%NaOH预处理后的秸秆扫描电镜图比较发现，NaOH和绿氧联合预处理的秸秆的破坏程度更为明显。这进一步证明绿氧可以促进NaOH迅速将纤维表面润湿并渗透到内部，加速胶质溶解及木素脱除反应。王苹等^[10]研究表明，添加绿氧后，秸秆的木质素破坏更完全，纤维素、半纤维素裸露出来，更易于被厌氧菌消化，从而有更多的有机物被转化为沼气，与本试验结果一致。

图 7 预处理样的电镜扫描图 Figure 7 SEM images of wheat straw after different pretreatments

图选项

（1）在15、35、55 ℃下，最佳的预处理组合分别为A3、B2、C2，且三个最佳处理较对应温度下的未处理组的累积甲烷产量分别高86%、93%、87%。

（2）35、55 ℃下的累积甲烷产量和处理浓度的回归方程均达显著水平。

（3）在最佳预处理组A3、B2、C2的秸秆结构受到不同程度的破坏，其中，B2、C2结构破坏严重，C2甚至出现结构分离现象。