黑麦草（Loliumperenne L.）因生长迅速、生物量大、再生能力强等特点，被认为是适合普遍种植的优质牧草和草坪草。研究报道，黑麦草是一种相对耐重金属的代表植物，可在Pb、Cd、Cu等重金属污染土壤中生长和吸收重金属，并对Pb有一定的富集能力^[1-2]。因其生物量高且有较强的重金属耐性，被认为是一种很有潜力的重金属修复植物。然而，植物对重金属表现出富集能力的同时，也会引起植物体内一系列生理生化过程的紊乱。研究发现，高浓度Pb可降低黑麦草各项生理指标，如光合色素含量、植物抗性酶活性等^[3-4]，使其生长受阻，对黑麦草具有很强的毒性效应。因此，研究缓解Pb胁迫对植物毒性效应的方法，促进植物在含Pb土壤中生长，对植物修复效率的提高具有重要意义。

目前，利用有益菌来提高植物的耐Pb特性已有相关报道。扁豆根部接种4种耐Pb细菌可提高植物在Pb胁迫下叶片的3种抗氧化酶（CAT、SOD和POD）活性，促进植物生长^[5]；含Pb土壤种植的水稻接种一株内生真菌（EF0801），可增强Pb胁迫下叶片的抗氧化酶活性，降低Pb胁迫产生的丙二醛的含量，缓解Pb胁迫对植物的伤害^[6]。然而，关于利用放线菌增强植物在Pb胁迫下的耐受性的研究很少，尤其对黑麦草在Pb污染土壤中的抗性生理罕有报道。而放线菌是土壤中三大类微生物之一，是抗生素的主要产生菌，其中密旋链霉菌具有促进植物根系发育、抗病促生等多种功能^[7-8]。

本文以耐Pb性植物黑麦草为研究对象，采用盆栽试验，探索不同水平Pb胁迫下，一株放线菌对黑麦草根系生长和根系抗性生理的影响。通过测定在不同Pb胁迫下的根系生长情况，分析根系抗氧化酶活性、丙二醛含量和根系活力，阐明放线菌提高植物对Pb的耐受性机理，从而为提高植物修复Pb污染的效率提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试放线菌为一株密旋链霉菌（Streptomyces pactum，Act12），是由西北农林科技大学微生物资源研究室从青藏高原、黄土高原土壤极端生境下的近万株微生物中分离筛选而来，该放线菌具有防病、促生、抗旱等多种功能^[8]。将该菌通过固态发酵制成菌粉，用于本研究的盆栽试验，其活菌数量为4.6×1010 CFU·g^-1。

黑麦草种子千粒重2.2 g，出苗率90%，在种植前先用0.5% NaClO室温下消毒10 min，再用蒸馏水冲洗后，均匀种植在花盆中，种子覆土约1 cm厚。

供试土壤采自长安区农田表层30 cm土壤，农田当季作物为小麦，风干后过5 mm尼龙筛备用。参照鲍士旦^[9]的方法测定土壤基本理化性状，详见表 1^[10]。

1.2 试验装置

选用直径23 cm、高度21 cm的塑料花盆，为防止花盆底部小孔漏水，装土前盆内套两层塑料薄膜。每盆装土3 kg（风干土），土层填充高度约19 cm。

1.3 试验设计

试验设2个处理：不接菌对照（CK）、菌剂接种。根据中国土壤Pb含量及分布情况、中国土壤环境质量标准（GB 15618-1995），并结合黑麦草对修复Pb污染的相关文献，每个处理设5个Pb胁迫浓度梯度，分别为0、200、300、500、1000 mg·kg^-1，每个浓度水平设置3个重复。用硝酸铅[Pb（NO₃）₂]配制10 g·L^-1的Pb原液，分别向5个大烧杯中加入0、360、540、900、1800 mL的Pb原液，补充蒸馏水至3600 mL。然后将烧杯中的Pb溶液分别均匀喷洒在5堆风干土壤中（每堆土重18 kg），搅拌均匀，使土壤与Pb溶液充分混匀（预试验中3600 mL的溶液加入18 kg风干土中，土壤湿度约为20%，接近田间土壤含水率），即得到实验设计所需的5堆Pb浓度梯度的土壤。用塑料薄膜密封，置于黑暗处保存3个月，使金属与土壤平衡稳定。装盆前将土样风干，每个Pb浓度土样等分成两份，不接菌对照按试验设计称重装盆，每盆装土3 kg；接菌处理5个Pb胁迫水平土样中，分别按1.5 g·kg^-1干土的量加入菌剂，使菌剂与土样充分混匀后称重装盆。

黑麦草种子每盆种50粒，出苗后每盆统一保留15株。试验在日光温室进行，温度控制在22～25 ℃，每天夜间浇水一次（用称重法计算水分差），保持土壤湿度约为20%，观察记录生长情况，60 d后将地上部分和根系分开收获。植物根系先用自来水反复冲洗干净后，再用去离子水冲洗3遍，最后用吸水纸吸干根系表面的游离水，称总重。根鲜样保存在液氮中用于测定根系生理生化指标。

1.4 测试指标和方法

超氧化物歧化酶（SOD）活性：参照Marklund等^[11]的方法，由抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定，一个酶活单位以抑制NBT光还原的50%表示。

过氧化氢酶（CAT）活性：根据测量240 nm下吸光率的变化速度来反映过氧化氢分解，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位^[12]。

过氧化物酶（POD）活性：按照Polle等^[13]的方法测定。

丙二醛（MDA）含量：利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛发生显色反应，生成红棕色的三甲川，分别在532、600、450 nm波长处测定其吸光度，计算出丙二醛的含量^[12]。

根系活力：称取根尖样品0.5 g，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液，37 ℃暗保温约2 h，加1 mol·L^-1硫酸停止反应，将根取出，吸干水分后加4 mL乙酸乙酯研磨，提取液在485 nm测定吸光度，求出TTC还原量，用四氮唑还原强度表示根系活力^[14]。

1.5 数据处理

相对增率（Δctrl%）是表示接菌处理与不接菌对照的差值占不接菌对照比值的百分数。

数据统计分析采用SPSS20.0（IBM，USA）软件，用Duncan法做差异显著性检验，在P < 0.05水平（表示差异达显著性水平）下进行分析。

2 结果与分析 2.1 Pb胁迫下放线菌对黑麦草根系生长的影响

由表 2可知，随着土壤Pb胁迫水平的升高，对照和接菌处理黑麦草根分蘖数和根鲜重均呈先增加后降低的趋势，在Pb含量为300~500 mg·kg^-1时测定值最大。然而不同Pb胁迫水平下，土壤接入放线菌后，黑麦草根分蘖和根鲜重较对照分别增加了12.3%～44.2%和19.2%～94.6%，其中根分蘖数在土壤Pb加入量为200 mg·kg^-1时增率最大，根鲜重在土壤Pb加入量为300 mg·kg^-1时增率达最大。方差分析结果显示，放线菌Act12、Pb处理及其交互作用对黑麦草分蘖和根鲜重都有显著性影响，根分蘖除了500 mg·kg^-1处理，其他Pb胁迫水平处理加菌均显著高于对照，根鲜重不同Pb胁迫下接菌均显著高于对照（P < 0.05）。这表明不同Pb胁迫下，土壤接入放线菌Act12增加了黑麦草根分蘖和根鲜重，对根系生长有显著的促进作用。

2.2 Pb胁迫下放线菌对黑麦草根系抗氧化酶活性的影响

由表 3可知，对照和加菌处理下，黑麦草根系抗氧化酶CAT和POD的活性随Pb胁迫水平的升高而呈降低趋势，而SOD的活性呈先升高后降低的趋势。但土壤接入放线菌Act12后，在不同的Pb胁迫下3种抗氧化酶活性较对照都有一定程度的增加，CAT增加了13.0%～49.1%，SOD增加了14.6%～61.3%，POD增加了11.6%～50.6%；在土壤Pb加入量为500 mg·kg^-1和1000 mg·kg^-1时，3种抗氧化酶活性的增加均达显著性水平（P < 0.05）。方差分析显示，放线菌Act12、Pb处理及其交互作用对黑麦草根系3种抗氧化酶活性都有显著性影响（P < 0.05），表明根系抗氧化酶活性的变化与Pb胁迫水平有关，Pb胁迫增大可降低部分抗氧化酶活性。然而，放线菌Act12加入土壤后，不同程度地增强了抗氧化酶活性，特别是在高浓度Pb胁迫下，放线菌Act12对抗氧化酶活性作用明显，对缓解胁迫带来的氧化伤害非常重要。

2.3 Pb胁迫下放线菌对黑麦草根系MDA含量和根系活力的影响

由表 4可知，放线菌Act12、Pb处理及其交互作用对黑麦草根系MDA含量和根系活力都有显著性影响（P < 0.05）。随着Pb胁迫水平的升高，对照和接菌处理黑麦草根系中MDA含量均呈增加的趋势。与对照相比，接菌显著降低了根系MDA含量，降幅达19.2%～35.3%（P < 0.05）。说明了Pb胁迫能引起细胞脂质过氧化，胁迫程度越大，脂质过氧化产生的MDA量越大，而土壤加入放线菌Act12能极大地降低这种脂质过氧化作用。

由表 4可知，对照处理黑麦草根系活力在低水平Pb胁迫下呈增加趋势，在高水平Pb胁迫下降低，300 mg·kg^-1Pb胁迫时根系活力达最大；接菌处理也呈类似的变化趋势，但在200 mg·kg^-1Pb胁迫下达最大值。与对照相比，接菌显著增加了黑麦草根系活力（P < 0.05），增幅达30.9%~166.8%，且在Pb加入量为200 mg·kg^-1时增幅最大。说明了根系活力受Pb胁迫程度的影响很大，低水平Pb胁迫能刺激根系生长，但超过根系的耐受性后生长受阻，而放线菌Act12加入土壤后，对提高根系活力有积极的作用。

3 讨论

Pb是植物生长的非必需元素，与根系作用直接影响植物的生长和生理状态。研究发现Pb易于在黑麦草根部吸收和积累，根中Pb浓度和积累均大于地上部^[2]。因此，Pb对黑麦草根系的胁迫强度大于地上部，研究Pb胁迫下根系的生长和抗性生理具有重要意义。已有研究表明，低浓度Pb（ < 500 mg·kg^-1）对黑麦草生长有促进作用，高浓度时有显著的抑制作用^[3]，与本研究结果一致。这可能与黑麦草对Pb胁迫的耐受性有关。

Pb胁迫下土壤接入放线菌Act12后，促进了黑麦草根的分蘖，显著增加了根鲜重，对根系生长表现出明显的促进作用。这可能与该菌首先具有较强的Pb耐受性，能在含Pb土壤中良好繁殖有关；其次，放线菌在繁殖时，可能会产生如抗生素、有机酸、氨基酸、维生素、酶等代谢产物，分枝状的菌丝体能够产生各种胞外水解酶^[8]，这些物质本身可刺激植物根系发育及养分吸收。此外，放线菌Act12可调整植物根域土壤微生态平衡，抑制有害微生物的生长，促进有益微生物的繁殖，改善微生物区系^{[7, 15]}。以往的研究中放线菌Act12对多种作物如甜瓜、黄瓜等均表现出良好的促生效果^{[8, 14]}，进一步证实Act12可能是一种广谱的促生菌。然而，在Pb胁迫下放线菌Act12对黑麦草生长的影响没有报道，我们将进一步深入研究该菌在Pb胁迫下的促生机理。

植物抗氧化酶（POD、SOD、CAT）能够维持自由基在植物体内产生和清除的动态平衡，它们是维持和提高植物耐重金属胁迫的物质基础之一，SOD可以将有活性和有毒性的超氧自由基转化成H₂O₂，随后H₂O₂可被CAT和POD转化为H2O和O2而清除^[16-17]。本研究中黑麦草CAT和POD活性随着Pb胁迫水平增加而降低，而SOD活性呈先增加后降低。这表明CAT和POD活性受到Pb胁迫的抑制，其活性降低主要由Pb胁迫增强引起，这种抑制作用导致了黑麦草体内受Pb胁迫产生超氧自由基的积累。在低浓度Pb（ < 500 mg·kg^-1）胁迫下，黑麦草的抗氧化系统可产生适应性诱导反应，Pb能激活SOD活性和促使SOD活性快速升高，以减缓或消除Pb污染引起的氧化胁迫，使黑麦草对铅胁迫产生了一定的耐受性；然而当Pb胁迫强度增加，Pb在黑麦草体内的积累超过一定量时，细胞内的抗氧化防御系统就遭到了破坏，SOD活性降低，其防御功能也会下降。这与刘慧芹等^[18]对黑麦草，刘碧英等^[19]对沿阶草受到铅胁迫后SOD活性变化的研究结果一致。

土壤加入放线菌后提高了Pb胁迫下黑麦草体内3种抗氧化酶活性，尤其是在高浓度Pb胁迫下（500～1000 mg·kg^-1），放线菌的增强作用显著。其可能的作用机理是：放线菌的代谢产物含有有机酸、氨基酸等小分子化合物，能以与根系中游离态的Pb形成螯合物的方式解毒^[20]，或者放线菌的加入促进了Pb从黑麦草根系向地上部转移，来缓解Pb胁迫对根系的毒害作用，因此CAT和POD活性受Pb胁迫的抑制程度降低；此外，放线菌在促进黑麦草在Pb污染土中生长时，也可能提高了黑麦草自身对Pb的耐受性，增强了抗氧化酶系统，使3种抗氧化酶活性均提高。Li等^[6]对水稻接种内生真菌（EF0801），Jebara等^[21]对扁豆（Lens culinaris）联合接种3种细菌，在Pb污染土壤中，提高了植物体内3种抗氧化酶活性，与本研究结果一致。而阎岩等^[22]报道，4%的Act12可显著提高丹参毛状根中活性氧的含量，对丹参毛状根生物量产生抑制作用，与本研究中Act12对黑麦草的作用结果相反。这可能与植物的种类和根际土壤环境有关。本研究Act12的加入促进了黑麦草根系生长，而黑麦草根系在Pb的刺激下有机酸的分泌量增加^[23]，这种弱酸性环境能缓解Pb胁迫下活性氧的积累；而丹参受Act12刺激，培养基中pH上升，表现为细胞外碱化，进而引起了细胞内活性氧的积累，这种积累诱导了丹参酮的合成。

本研究中，Pb胁迫水平越高，黑麦草根系中MDA积累越多。MDA是质膜过氧化损伤的产物，是反映逆境胁迫下细胞膜受伤害程度的一个重要指标，其含量的高低可反映出细胞质膜过氧化的水平，重金属离子浓度越高，MDA积累越多，对植物毒害效应越强^[24]。放线菌加入缓解了植株膜脂过氧化，可能是因为放线菌增强了黑麦草根系抗氧化系统，对Pb胁迫产生的自由基的清除能力增强，中断了自由基链式反应，降低了细胞质膜氧化损伤。

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根系活力是根系生理的主要指标之一，直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。本研究中，低水平Pb（ < 500 mg·kg^-1）胁迫对黑麦草根系有刺激作用，高水平Pb（1000 mg·kg^-1）胁迫下根系活力降低。放线菌Act12加入土壤对提高根系活力有显著的作用。这可能与放线菌既能促进根系养分吸收，又能改善根际环境有关，如调整根域微生态环境^[7]；另外，与根系抗氧化系统的增强和MDA积累降低直接相关。已有研究表明，根系活力的增加对根系生长和提高根系对Pb的吸收能力具有重要的贡献^[25]。

4 结论

（1）随着土壤Pb胁迫水平的升高，黑麦草根分蘖数和根鲜重呈先增加后降低的趋势，而土壤接入放线菌Act12后，增加了黑麦草根分蘖和根鲜重，对根系生长有显著的促进作用。

（2）黑麦草根系抗氧化酶CAT和POD的活性随Pb胁迫水平的升高而呈降低趋势，而SOD活性在低水平Pb胁迫的增加可能是植物应对胁迫自身的应答机制。但土壤接入放线菌Act12后，通过提高抗氧化酶活性，清除了Pb胁迫所产生氧自由基，增强根系耐毒性。

（3）随着Pb胁迫水平的升高，黑麦草根系中MDA积累增加，放线菌Act12接入显著降低了MDA含量。放线菌接入提高了根系活力，是放线菌接入引起根系抗性生理增强的综合体现。