草甘膦，又称镇草宁、农达、草干膦、膦甘酸，1971年由Monsanto公司开发出在世界农业中具有划时代意义的广谱除草剂^[1]。草甘膦的作用机理是通过其有效成分抑制5-烯醇丙酮草莽酸-3-膦酸盐的合成酶活性^[2-3]。其通过茎叶吸收后传导到植物各部位，可防除单子叶和双子叶、一年生和多年生、草本和灌木等40多科的植物，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。随着转基因抗草甘膦作物的发展，它在全球的使用面积正以每年20%的速度递增，成为具有典型代表性的农药产品，因此草甘膦对环境及有益生物的影响受到广泛关注^[4-6]。学者调查发现，草甘膦对水生生物、两栖类动物、土壤生物及哺乳动物都具有相应的毒性影响^[7]。

大型溞（Daphnia magna）属于节肢动物门、甲壳纲、枝角类，是常见的小型浮游甲壳动物^[8]。它是水生浮游动物的代表，是连接水生食物链的重要中间体，对净化水体有重要作用，其初级生产量直接影响水生生态系统的结构功能^[9-10]。作为目前国内外水生生物毒理学研究的标准测试生物，大型溞被广泛应用于水生生物毒性试验和评价。

目前，国内关于草甘膦为代表的有机磷类灭生性除草剂的毒性研究多局限于对水生生物的毒性效应及环境安全性研究，如：对中华大蟾蜍的慢性毒性研究，以及对旋链角毛藻和盐生杜氏藻的毒性兴奋效应研究^{[3, 11-12]}。国外的相关研究主要集中在该类农药对斑马鱼的神经毒性效应研究，对土壤根际细菌群落的影响，在孕期和哺乳期草甘膦的暴露对小鼠后代的神经毒性研究^[13-15]等，鲜见对大型溞的长期慢性影响研究。本研究主要考察99.5%草甘膦原药对大型溞的急性毒性和21 d慢性毒性效应，观察大型溞各个繁殖和生长指标变化，为保护水生生态系统和人群健康与安全提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验生物

受试大型溞为本实验室培养的同一健康亲溞孤雌生殖3代以上的幼溞，溞龄24 h以内，要求个体状况健康、活泼、体型均匀。根据OECD211准则^[16-17]，用M4培养液培养大型溞使其状态稳定^[18]。培养液pH为（7.8±0.2），溶解氧保持80%左右，培养温度（20±2）℃，光强18 μE·m^-2·s^-1，光暗比16 h：8 h，培养密度为每只溞50 mL培养液^[19]。用绿藻及酵母作为饵料定期投放，喂食密度控制在每1 mL培养液含2.0×10⁵~3.0×10⁵个藻类细胞。每2~3 d更换一次培养液，同时清洗干净培养器皿^[20]。

在试验开始之前的三周内，选取20~30只体型较大、卵泡较多、反应敏捷的母溞放置在1 L的烧杯中，并用新鲜藻类喂食，毒性试验需选用这些母溞生产的2~5代并且溞龄在6~24 h内健康活泼的幼溞，其重铬酸钾敏感度测定结果符合ISO标准^[21]。

1.2 供试药剂

99.5%草甘膦原药，来自阿拉丁公司，白色粒剂，化学名称N-（膦羧甲基）甘氨酸，分子式C₃H₈NO₅P，分子量169.07，分析标准99.5%，CAS登录号：1071-83-6。

1.3 试验方法 1.3.1 急性毒性试验

根据OECD202标准方法^[22]进行48 h急性毒性暴露试验。通过预实验，得出99.5%草甘膦原药对溞类100%活动受抑制的最低浓度和全不抑制的最高浓度，进而确定正式试验的浓度范围。在100~225 mg·L^-1内以1.144 7为等比设置6个浓度组，分别为100、114.47、131.034、150、171.70、196.54 mg·L^-1。同时设置不加农药的空白对照组。将99.5%草甘膦原药取出0.25 g加入到250 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至标线配制成1 g·L^-1的母液。试验时，用100 mL的烧杯配置不同浓度的草甘膦原药溶液，每个烧杯中加入5只6~24 h的幼溞，每个浓度设置4个平行，于24 h和48 h后观察并记录大型溞的受抑制情况。饵料和试液在急性毒性暴露的过程中不需要投放与更换。重铬酸钾作为参比物质的实验结果符合《化学农药环境安全评价试验准则》^[23]规定的试验要求，其对大型溞的24 h-EC₅₀为0.94 mg·L^-1。

1.3.2 慢性毒性试验

参照OECD211标准方法^[17]进行21 d慢性毒性暴露试验。根据99.5%草甘膦原药对大型溞急性毒性的试验结果，获得供试农药对大型溞48 h的半数抑制浓度EC₅₀；综合各项因素，选择在浓度50 mg·L^-1内以2为等比设置6个浓度梯度，每个浓度设置10个平行，以曝气脱氯的自来水作为空白对照组。本次试验设置的浓度组分别为0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 mg·L^-1。试验前将室温调至20 ℃，打开光照，将99.5%草甘膦原药取出0.1 g加入到100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至标线配制成1 g·L^-1的母液。试验时，用100 mL烧杯配置不同浓度的草甘膦原药溶液，在每只烧杯中放入1只健康活泼的6~24 h的幼溞，于光暗比为16 h：8 h、（20±2）℃的条件下连续培养21 d，16 h在容器的水面上光照强度不超过15~20 μE·m^-2·s^-1。试验期间采用半静态试验系统^[24-25]，为保证试验期间药剂浓度为起始浓度的80%以上，需每隔1 d更换一次试验溶液。在慢性毒性试验过程中，大型溞的生存、蜕壳、怀卵和繁殖情况必须每天记录，并及时移除褪下的壳以及繁殖的幼溞。在试验期间，每天用一种或多种新鲜藻细胞喂食，或者一周喂食3次。慢性毒性试验结束时，将大型溞置于体视镜下观察并拍照，测量溞体的长度和记录其形态的变化，计算出大型溞的平均首次蜕壳时间、平均蜕壳次数、平均首次产幼溞时间、平均产幼溞数量和产幼溞胎数以及大型溞21 d的平均体长^[26]。

1.4 数据处理

用SPSS17.0统计软件处理48 h急性毒性试验数据，得到48 h-EC₅₀值。用SPSS17.0和Origin8.5统计软件处理慢性毒性试验数据，对各慢性毒性终点值变化做显著性分析，得到最敏感指标出现显著性变化的暴露浓度，并计算各个繁殖毒性终点指标的NOEC值。

2 结果与分析 2.1 99.5%草甘膦原药对大型溞的急性毒性

试验过程中试液溶解氧需在8.0 mg·L^-1以上，pH7.5左右。经试验观察，空白对照组的大型溞无死亡现象，生长状况良好。不同浓度受药处理组的大型溞，在接触99.5%草甘膦后都受到了不同程度抑制，抑制溞表现状态为白色胀大并沉于水底。

99.5%草甘膦原药对大型溞的48 h半抑制浓度为151.057 mg·L^-1（表 1）。按照国家环境保护局《化学农药环境安全评价试验准则》^[23]关于农药对大型溞的毒性分级标准，该药对溞类属于低毒农药。

2.2 99.5%草甘膦对大型溞慢性毒性 2.2.1 对大型溞初次脱壳时间的影响

由图 1可见，大型溞在各个浓度的初次蜕壳时间基本上都在第1 d，个别几只大型溞在第2 d初次蜕壳。在试验设定的这几个浓度范围中，99.5%草甘膦原药暴露对大型溞初次蜕壳时间影响不显著。

2.2.2 对大型溞蜕壳次数的影响

由图 2可见，大型溞在各个浓度的平均蜕壳次数在10次左右，在实验的这几个浓度范围中，99.5%草甘膦原药暴露对大型溞的蜕壳次数影响不显著。

2.2.3 对大型溞首次产幼溞时间的影响

由图 3可见，99.5%草甘膦原药暴露能延迟大型溞的首次产幼溞时间。从图上看，整体呈现一个缓慢上升的过程。当99.5%草甘膦原药的浓度为25 mg·L^-1时，大型溞首次产幼溞时间显著延长（P < 0.05）；浓度为50 mg·L^-1时，大型溞的首次产幼溞时间极显著延长（P < 0.01）。

2.2.4 大型溞存活个体产幼溞数量的影响

由图 4可见，99.5%草甘膦原药暴露能降低平均每只大型溞的产幼溞数量。从图上看，整体呈现一个下滑的趋势，在浓度为3.125~50 mg·L^-1时，大型溞产幼溞数量极显著减少（P < 0.01）。该项数据只统计了存活至实验结束时的大型溞所产幼溞的数量。

2.2.5 对大型溞存活个体产幼溞胎数的影响

由图 5可见，99.5%草甘膦原药暴露能降低平均每只大型溞的产幼溞胎数。当99.5%草甘膦浓度为12.5、25 mg·L^-1时，大型溞产幼溞胎数显著减少（P < 0.05）；浓度为3.125、6.25、50 mg·L^-1时，大型溞产幼溞胎数极显著减少（P < 0.01）。

2.2.6 对大型溞存活个体平均体长的影响

由图 6可见，99.5%草甘膦原药暴露缩短了平均每只大型溞的体长。当浓度为6.25 mg·L^-1时，99.5%草甘膦暴露21 d后大型溞的体长极显著缩短（P < 0.01）。

3 讨论

除草剂是具有选择毒性的农药，与杀虫剂相比对非靶生物的致死率普遍较低，导致人们不太关注除草剂对非靶生物的影响^[27]。然而在农业耕作过程中所施用的除草剂仅有少部分被植物吸收，大部分被喷施在与作物同一生境的动物体表或残留在土壤和水体中，对水体和农业生态系统造成污染^[28]。

许杨贵等^[29]研究了水环境中草甘膦和三价砷对大型溞的联合毒性，结果表明草甘膦对大型溞单一毒性的48 h半抑制浓度为49.62 mg·L^-1，属于低毒物质，与本研究草甘膦对溞类的毒性为低毒一致。根据Thai-Hoang Le等^[30]的研究结果，草甘膦对大型溞的CYP314细胞色素无明显影响，而CYP314细胞色素控制大型溞的脱壳机能。由本研究可知，草甘膦对大型溞的首次脱壳时间和脱壳次数的影响都不显著，与前者的研究结果一致。在本研究中，草甘膦暴露组浓度的大型溞21 d产幼溞数量整体呈下降趋势，同时首次产幼溞时间在浓度为25 mg·L^-1时呈显著性增加（平均首次产幼溞时间为6.5 d左右），在浓度为50 mg·L^-1时极显著性增加（平均产幼溞时间为6.8 d左右），说明草甘膦在一定浓度范围内减少大型溞的产幼溞数量，延长了首次产幼溞时间。这与Thai-Hoang Le等^[30]研究的草甘膦对大型溞卵黄蛋白原的影响相吻合，该研究表明草甘膦的使用降低了卵黄蛋白原的合成，而卵黄蛋白原是胚胎和幼体早期发育主要的营养来源。Thai-Hoang Le等^[30]还研究了草甘膦对大型溞血红蛋白、芳香烃受体核转位蛋白及CYP4的影响，结果表明随着草甘膦浓度的增加其值都呈显著下降趋势，进而对大型溞个体产生影响。本研究的结果也证实草甘膦对大型溞的个体生长存在抑制作用。本研究中，草甘膦暴露浓度为1.56、3.125 mg·L^-1时，大型溞的产幼溞时间间隔为1 d，浓度为6.25、12.5 mg·L^-1时产幼溞时间间隔为2 d，浓度为25、50 mg·L^-1时产幼溞时间间隔延长至3 d；而张欣等^[31]的研究中丁草胺、吡嘧磺隆和苄嘧磺隆三种除草剂不同浓度暴露下，大型溞的产幼溞时间间隔都是2.5～3.5 d，没有显著性差异，说明草甘膦能延长大型溞的产幼溞时间间隔。此外，有些除草剂则对大型溞的产幼溞时间间隔没有影响。

OECD准则虽然在水生生物毒性研究方面已形成了标准的测试方法，但在考虑后代的质量和胚胎发育的测试上具有一定的局限性^[32]。本试验结束后，慢性毒性处理组母溞无死亡现象，但母溞在产卵过程中，几个处理组都出现了幼溞死亡或畸形现象，从而推测草甘膦长期暴露会对大型溞产生不可逆的伤害。所以，如果大型溞生存于本试验浓度的自然环境中，其种群数量将受到影响。对于大型溞发生畸形和胚胎早脱的机理，还需要更进一步的研究。同样，人们也应该关注包括草甘膦在内的其他除草剂以及杀虫剂对生态环境产生的风险。

4 结论

99.5%草甘膦属于低毒农药其暴露对大型溞的首次蜕壳时间影响不显著，但在某种程度上增加了蜕壳次数，延迟了大型溞的首次产幼溞时间，降低了平均每只大型溞的产幼溞胎数和数量，影响了大型溞的个体尺寸。99.5%草甘膦原药暴露对大型溞的产幼溞数量和产幼溞胎数这两项指标很敏感，而对大型溞的体长比较敏感，首次产幼溞时间敏感度相对较差一些。因此，综合考虑各项繁殖毒性终点指标，该农药对大型溞的最低可观测有效应浓度（LOEC）值为3.125 mg·L^-1，无可观测有效应浓度（NOEC）值为1.56 mg·L^-1。鉴于草甘膦在我国使用非常广泛，虽然其对大型溞急性抑制毒性较低，但本研究表明草甘膦在较低浓度下便能显著影响大型溞的各项慢性毒性终点，因此建议对该农药登记大田使用前进行田间试验和环境生物影响风险评估，特别要关注其对浮游甲壳类生物的影响。