烟草是世界范围内广泛种植的重要经济作物，其品质的提高和无公害生产一直是烟草行业关注的重点及热点^[1]。植烟土壤重金属污染是烟草安全生产的主要限制因子，烟草植株吸收过多的重金属，其生长发育受到抑制，产量和品质明显降低，且增大烟草烟雾中重金属浓度，引发多种人类疾病，对吸烟人群健康造成威胁^[2-3]。据报道，镉是我国烟叶中的主要重金属元素之一，其含量远高于铅、汞和砷等，且叶片平均镉含量达2.53 mg·kg^-1，最高可接近5 mg·kg^-1[4]。烟草对镉的敏感程度和吸收积累在基因型和品种之间存在明显的差异，且受遗传因素的严格控制^[5-9]。因此，从烟草自身出发，筛选和培育烟草镉低积累种质资源是保障烟叶安全生产的根本途径，也被国内外普遍认为是现实可行的途径。目前，已有不少学者通过筛选所得的镉低积累水稻^[10]、小麦^[11]等粮食作物以及白菜^[12]、花生^[13]和番茄^[14]等经济作物来降低其可食部分的镉含量，进而实现安全生产。Zhang 等^[15]基于146 份水稻亲本材料镉耐性评价，以镉含量为聚类指标进行筛选，获得4 份水稻镉安全材料。陈瑛等^[16]通过比较60 份小白菜地上部镉含量，获得12 份镉低积累小白菜，其在轻度镉污染土壤上种植安全系数较高。然而，目前对于烟草的筛选主要集中在抗病害^[17]和养分高效基因型烟草种质资源的筛选^[18]，而对烟草镉低积累材料的筛选还鲜见报道。因此，本研究以来源较为广泛的93 份烟草材料为研究对象，通过水培试验，对不同烟草材料进行镉耐性和镉积累差异评价，获取烟草镉低积累种质资源，并分析其镉积累特征，以期为进一步研究烟草镉积累遗传特性和培育烟草镉低积累品种提供材料。

由凉山州烟草公司提供的93 份烟草材料，其中烤烟70 份（T1~T70）和非烤烟23 份（T71~T93），主要包括西南烟区的主栽品种及部分国外引进品种，来源较为广泛且材料间存在较大的遗传差异。供试材料编号及名称见表 1。

表 1 供试烟草材料编号及名称 Table 1 Codes and names of tobacco species used in the experiment

表选项

试验设2 mg·L^-1（Cd2）和10 mg·L^-1（Cd10）两个镉处理，以不添加镉作为对照，镉以CdCl₂·2.5H₂O（分析纯）施入营养液，每处理重复3 次，完全随机排列。水培采用Hoagland 完全营养液^[19]。

烟草种子经浸泡、灭菌、消毒后于28℃黑暗条件下催芽，发芽后移入珍珠岩培养基中培养至6 叶1 心期，将长势一致的烟苗用去离子水洗净根部附着的珍珠岩后，转移到高密度聚乙烯塑料水培槽（长伊宽伊高：60 cm×40 cm×13.5 cm）中，每槽24 穴，每穴1 株，用海绵固定烟苗，进行营养液培养，预培养一周后开始添加镉处理，每5 d更换一次营养液，用0.1 mol·L^-1 的HCl 或NaOH 调节营养液pH 至6.0 左右并补充去离子水，用通气泵进行间歇性通气（通气2 h停止1 h）。试验于2015 年5月在有防雨设施的网室中进行。

于烟草团棵期（处理后30 d）采样，分为地上部和地下部。将地下部样品置于20 mmol·L^-1 的EDTANa₂中浸泡15 min，然后与地上部样品一并用自来水洗净，再用去离子水润洗，最后用吸水纸擦干。样品置于105℃杀青30 min，75℃烘干至恒重，将样品粉碎过筛，用于镉含量的测定。

植株镉含量测定：样品经HNO_3-HClO₄（V/V，5:1）消化，火焰原子吸收分光光度计测定（Analyst 800，Perkin Elmer，USA）^[15]。

耐性指数=镉处理下生物量/对照生物量^[20]

镉积累量=生物量伊镉含量

采用DPS（11.0）进行统计分析，选择LSD 法进行多重比较，离差平方和方法进行系统聚类；图表制作采用Excel（2013）和Origin（9.0）。

由表 2可知，两个镉处理下93 份烟草材料生物量及耐性指数均存在较大差异。在2 mg·L^-1处理下，各烟草材料地上部生物量最小值和最大值分别为0.27 g·株^-1 和1.65 g·株^-1，差异达6.11 倍，其平均值为0.93 g·株^-1（CV =31.84%）；相应的耐性指数为0.22~1.38，最大值为最小值的6.27 倍，平均值为0.59（CV=38.48%）。在10 mg·L^-1处理下，各烟草材料地上部生物量平均值为0.63 g·株^-1（CV=33.70%），其耐性指数平均值为0.40（CV=37.10%），地上部生物量最小值和最大值分别为0.23 g·株^-1 和1.25 g·株^-1，差异达到5.43倍；相应耐性指数为0.16~0.86，最大值为最小值的5.38 倍。这说明在镉胁迫条件下，各烟草材料地上部均受到不同程度的抑制，且对镉的耐性表现出明显的差异。在10 mg·L^-1镉处理下各烟草材料受镉的抑制作用较2 mg·L^-1处理更强。

表 2 不同烟草材料地上部生物量及相应的耐性指数差异 Table 2 Difference of biomass and relative tolerance index in shoot of different tobacco species(Cd2:n=93;Cd10:n=92)

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图 1 不同烟草材料地上部镉耐性聚类分析 Figure 1 Cluster analysis of cadmium tolerance in shoot of different tobacco species

图选项

以地上部耐性指数为聚类分析指标，采用离差平方和法进行聚类分析，对烟草材料进行耐性分类。由图员可知，当欧氏距离为13.98（2 mg·L^-1）和10.87（10 mg·L^-1）时，可将93 份烟草材料按镉耐性高低分为3类，即高耐性、中耐性和低耐性材料（表 3）。

表 3 不同耐性烟草材料的镉耐性及镉积累能力差异 Table 3 Differences in Cd tolerance and accumulation ability of tobacco species with different tolerance

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由表 3 可知，各类型烟草材料地上部生物量、耐性指数和镉积累量均随着镉处理浓度的增加而显著下降，其镉含量呈相反的变化趋势。两个镉处理下，各类型烟草材料地上部生物量及耐性指数存在显著差异，表现为高耐性和中耐性材料显著高于低耐性材料，其地上部镉含量差异在两个镉处理下有所不同。在2 mg·L^-1处理下，低耐性材料镉含量显著高于高耐性和中耐性材料；而在10 mg·L^-1处理下，3 类材料镉含量差异不显著。3 类材料地上部镉积累量变化与生物量表现出相同的趋势，即高耐性和中耐性材料显著高于低耐性材料，说明高耐性和中耐性烟草材料不一定具有低积累特性。目标材料的获取应以镉含量为聚类指标进行进一步评价，保证其耐性较高且镉含量和积累量均较低。

由表 4 可知，在2 mg·L^-1 镉处理下，烟草材料地上部镉含量和镉积累量变幅分别为75.86~160.82mg·kg^-1 和38.90~214.22 μg·株^-1，差异达2.12 倍和5.51 倍，其变异系数分别为17.34%和34.18%；在10mg·L^-1镉处理下，烟草材料地上部镉含量和镉积累量平均值分别为136.22 mg·kg^-1和94.76 μg·株^-1，其最大值为最小值的2.08倍和5.10 倍，变异系数分别为17.55%和32.90%。说明在两个镉处理下各烟草材料间镉积累能力存在明显差异。

表 4 不同烟草材料地上部镉积累能力差异 Table 4 Difference of biomass and relative tolerance index in shoot of different tobacco species（Cd2：n=53；Cd10：n=45）

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以地上部镉含量为聚类分析指标，用离差平方和法进行聚类分析，对两个镉处理下中高耐性烟草材料进行镉积累能力分类。由图 2 可知，当欧氏距离为7.02（2 mg·L^-1）和8.09（10 mg·L^-1）时，可将烟草材料按镉积累能力高低分为3 类，即低积累、中积累和高积累材料（表 5）。

图 2 不同烟草材料地上部镉积累能力聚类分析 Figure 2 Cluster analysis of Cd accumulation capacity in the upper part of different tobacco species

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表 5 中高耐性烟草材料镉积累差异分类 Table 5 Differential classification of Cd accumulation in middle and high tolerance tobacco species

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由表 5 可知，在2 mg·L^-1 镉处理下，获得低积累材料12份，中积累材料16 份，高积累材料25 份。在10 mg·L^-1镉处理下，获得低积累、中积累和高积累材料各10、20、15 份。其中编号为T02、T14、T26、T62、T67、T86 和T90 的7 份烟草材料在两个镉处理下均为低积累的材料，与本试验其余低积累材料相比，具有更好的稳定性。

从图 3可以看出，各类型烟草材料地上部生物量和耐性指数均随着镉处理浓度的增加呈现显著下降趋势，且耐性指数均小于1，说明3 类烟草材料生长均受到一定程度的抑制，且随着镉浓度增加抑制作用增强。在两个镉处理下，烟草镉低积累材料地上部生物量和耐性指数与其余两类材料相比差异不显著，说明在3类材料生长情况具有相似性，同时验证了进行镉积累评价材料镉耐性具有相对一致性。

图 3 不同烟草材料地上部生物量（A）及耐性指数（B）差异 Figure 3 Difference of biomass（A）and tolerance index（B）in different tobacco species 不同小写字母表示同一镉处理下不同材料间差异显著（P＜0.05），不同大写字母表示同一类型材料在不同镉处理间差异显著（P＜0.05） Data was mean ±SE. Different small letters indicate significant differences（P＜0.05）in different type materials. Different capital letters indicate significant differences among different Cd treatments（P＜0.05）

图选项

由表 6可知，各类型烟草材料地上部镉含量均随着镉处理浓度的增加而显著增加，而镉积累量则表现出相反的变化规律，即随着镉浓度的增加而明显降低。这是由于各类型烟草材料镉含量随镉浓度增加而增加的幅度（22.03%~27.20%）小于其生物量随镉浓度增加而降低的幅度（41.67%~55.26%）。此外，烟草镉低积累材料镉含量及镉积累量均显著低于其余两类材料。这说明烟草镉低积累材料地上部对镉积累能力较弱，有助于烟叶的安全生产。

表 6 不同烟草材料地上部镉含量及积累量差异 Table 6 Differences in Cd content and accumulation in shoot of different tobacco species

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植物对镉的吸收和积累受多种因素的影响。土壤中镉浓度及有效性^[21]、土壤pH^[22]、施肥^[23-24]和其他金属离子与镉的拮抗作用^[25]等环境因素均在不同程度上影响着植物对镉的吸收积累，但植物对镉的吸收积累及敏感程度受遗传因素严格控制，并在基因型和品种之间存在明显差异^[26]。Martin 等^[6]设计了烟草外显子数组，并将两种土壤种植条件下的45 份烟草根部和叶部进行外显子阵列分析，弄清了烟草镉积累的基因组成，表明镉高积累和镉低积累烟草品种叶片对镉的积累主要依赖于遗传因素和基因变异。本试验中，供试烟草材料来源于我国西南烟区的主栽品种及部分国外引进品种，来源较为广泛且材料间存在较大的遗传差异，为烟草镉积累评价提供了必要条件。此外，大量研究也表明，不同烟草种类和同一种类不同烟草品种对镉的敏感程度及吸收积累存在明显差异。雷丽萍等^[27]通过对我国南方烟区16 个烟草主栽品种进行水培试验研究发现，各烟草品种对镉毒性的敏感性分布频次具有明显差异，在50 mg·L^-1 镉处理下，烟草K326和K346 对镉的毒害最不敏感，表现出较强的耐性。本研究表明，在2、10 mg·L^-1镉处理条件下，93 份烟草材料地上部镉耐性指数均存在极显著差异，变异系数高达37.10%和38.48%，其中K326（T29）和K346（T31）烟草材料对镉的敏感程度较大，属低耐性烟草材料。这与上述结果有所不同，主要是由于本试验供试材料样本数量较多，且试验所设置的浓度有所不同导致的。王浩浩等^[9]对全国10 个烤烟主栽品种进行研究表明，在镉处理为3 mg·kg^-1时，不同烟草品种烟叶干物质积累量、镉含量及镉积累量存在较大差异，其中烟叶镉含量和镉积累量的最大值为最小值的1.09倍和1.29 倍。在本试验中，中高耐性烟草材料地上部镉含量和镉积累量也存在显著差异。在2 mg·L^-1镉处理下其最大值分别为最小值的2.12 倍和5.51 倍，在10 mg·L^-1 镉处理下分别为2.08 倍和5.10 倍，与上述研究结果具有相似性。但本研究供试材料间差异更大，主要是因为样本数量较大。

镉低积累作物的筛选和培育是镉污染土壤持续安全生产的一条经济、有效途径^[28]。为对作物做出合理的评价和筛选，评价时期和评价指标的选择尤为重要，应选择作物吸收镉的关键时期或是对镉吸收速率较大的时期进行评价，以便较好地体现材料间镉吸收积累的差异。张锡洲等^[29]在供试水稻材料处理后30d，即水稻吸收镉的关键时期，进行145 份水稻亲本材料镉耐性及镉积累的评价，获得15 份镉低积累种质资源。然而，烟草对镉吸收则表现出前期高后期低的双峰吸收型，烟草以团棵期和旺长期烟叶镉含量较高，是烟草镉吸收积累的敏感时期^[30]。贺远等^[31]通过盆栽试验对烟草镉积累规律进行研究也表明，烟草各器官镉积累速率变化规律为：快速积累-快速降低-缓慢积累，其中团棵期（移栽至移栽后30 d）为镉快速积累时期。本研究中评价时期为烟草团棵期（处理后30 d），该时期各烟草材料地上部镉耐性指数和镉含量变异系数大，较好反映了材料间对镉的耐性和吸收差异。再者，评价指标的选择依据目标材料的特性而定。唐忠厚等^[32]通过长期定位试验对31 份甘薯材料差异分析，指出钾敏感性和钾利用效率可作为钾高效利用型甘薯的筛选指标。同理，镉低积累种质资源对镉应具有较强的耐性，以保证植株的正常生长和经济产物的获得。同时，其对镉吸收应具有较强的阻抑能力，表现为镉含量和积累量均较低^[29]。Wang 等^[33]和Chen等^[34]也指出，镉安全卷心菜和镉低积累大麦的筛选应满足镉耐性较好和可食部分镉含量低两个标准。故本研究中以烟草地上部镉耐性指数和镉含量为评价指标，进行材料的系统聚类分析。评价所得镉低积累烟草材料对镉具有较好的耐性，其地上部生物量与中高积累材料相比差异不显著，且镉低积累材料地上部镉含量和镉积累量均显著低于中高积累材料。

不同烟草品种对镉的耐性及镉的积累能力与镉处理浓度具有相关关系，即同一烟草材料在不同的镉浓度下可能会表现出相似或相反的镉耐性和镉积累能力^[35]。王浩浩等^[9]研究指出，在0.6 mg·kg^-1 镉处理下，翠碧1 号、豫烟3 号和龙江851 叶片镉含量高于云烟87 和K326，且对土壤镉响应敏感性相对较强；而在3 mg·kg^-1镉处理下，翠碧1 号、豫烟3 号和龙江851 叶片镉含量低于云烟87 和K326，对土壤镉响应敏感性较弱。Iannone 等^[36]研究也发现，在100 μmol·L^-1镉处理下，野生型烟草材料（SR1）植株镉含量显著高于缺过氧化氢酶烟草材料（CAT1AS），而在500μmol·L^-1镉处理下则表现出相反趋势。本研究结果表明，在2 mg·L^-1镉处理下，Delhil 34（T55）、中99（T80）和Coker319（T69）为低积累烟草材料，而在10 mg·L^-1镉处理下，则为中积累材料，与上述研究结果具有相似性。本试验设置2、10 mg·L^-1两个镉处理，在保证供试烟草材料正常生长，且较好体现材料间的镉耐性和镉积累差异的基础上，对供试材料进行评价，获得较为稳定低积累材料。结果表明，在2、10 mg·L^-1镉处理下，分别获得12 份和10 份低积累材料，其中存在7份烟草材料在两个镉处理下均表现为低积累材料，分别为云烟85（T02）、中烟90（T14）、翠碧一号（T26）、CF986（T62）、RG11（T67）、91-5^8#（T86）和9601^16#（T90）烟草材料，且与本试验其余低积累材料相比，具有更好的稳定性。

在两个镉处理下，不同烟草材料地上部生物量均受到不同程度的抑制，且地上部耐性指数、镉含量和镉积累量在团棵期均达显著差异。以镉耐性指数和镉含量为指标进行聚类评价，可获得在两个镉处理下均表现出较高的耐性和低积累特性的材料7 份，分别为“云烟85”、“中烟90”、“ 翠碧一号”、“CF986”、“RG11”、“91-5^8#”和“9601^16#”。镉低积累材料地上部生物量和镉耐性与中高积累材料相比差异不显著，而镉含量和积累量均显著低于中高积累材料，表明评价所得的7 份材料既可作为烟草镉低积累遗传特性的研究材料，也可作为培育镉低积累烟草品种的优良遗传资源。