土壤重金属污染是近年来国内外普遍关注的环境问题，2014年环境保护部和国土资源部共同颁布了《全国土壤污染状况调查公报》^[1]。公报指出，全国土壤污染严重，点位超标率为16.1%，农田土壤状况尤其糟糕，其点位超标率高达19.4%。在所有污染物当中，重金属污染最为严重，占比82.8%，其中镉排在第一位，我国土壤镉点位超标率达7.0%；耕地土壤中主要污染物排在第一位的也是镉，我国土壤镉污染越来越受到大家的重视。镉进入土壤后，会在土壤中积累，并可以通过食物链在动植物体内传递，镉在生物体内长期积累会对生物体造成极大的危害^{[2, 3, 4, 5]}，因此开展土壤镉污染研究已迫在眉睫。

欧美许多国家先后颁布了针对镉污染土壤的质量标准，我国也于1996年制定土壤镉污染三级标准，用于生态风险评估^{[6, 7, 8, 9]}。然而由于不同种类土壤的理化性质不同，重金属镉的毒性有很大差别^{[10, 11, 12]}。因此，及时开展基于不同类型土壤中镉生态毒理的研究，了解其毒性差异及作用机理，对于镉的生态筛选值制定及风险评估均有重要意义。

我国土壤种类众多，不同土壤之间性质相差很大，如土壤 pH 变化范围大致为 4.0~9.0，有机质含量也有很大差异，其含量范围大致为 3.0~132 g·kg^-1[13]。目前，基于我国不同土壤类型的污染物生态毒理数据还相对匮乏，已获得的可用于生态效应评价的数据多针对国外土壤和物种，对我国土壤和生物的适用性有待评估。因此，需要及时开展生态毒理试验，以便补充在环境标准修订过程中所缺失的毒理数据^[14]。目前我国土壤镉污染生态毒理研究主要集中在单一田间土壤或者人工土壤的急性实验研究^{[15, 16, 17]}。相比急性毒性试验的致死效应，慢性毒性试验对生物体繁殖的影响更能反映出土壤中重金属的实际毒性^{[18, 19]}，因为重金属进入土壤中，本身毒性稳定需要一个过程，而急性试验时间太短，不能准确反映出重金属的实际毒性。

作为土壤生态系统的重要组成部分，蚯蚓可以通过食物链吸收土壤中重金属^[20]并在体内大量积累，对生长和生殖产生影响，进而致死，因此蚯蚓已经成为监测土壤重金属污染的重要指示生物^{[21, 22]}。本研究选用我国18种典型土壤，测定镉在不同土壤中对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的慢性毒性，揭示土壤理化性质对镉毒性和生物有效性的重要影响，研究结果可为土壤镉污染生态风险评估提供数据支持。

试验所用Cd（Cl）₂·2.5H₂O为国产分析纯试剂。

试验用蚓为赤子爱胜蚓，购自江苏句容蚯蚓养殖基地，是ISO和OECD推荐使用蚓种，对污染物中度敏感。蚯蚓买回后放于人工培养箱中，在（20±2）℃于供试土壤中培养驯化两周，适当添加牛粪作为食物。实验选用行为活泼、体色鲜亮、体重300~600 mg、生长期2~3个月、个体相对均匀的成熟蚯蚓。

18种供试土样采集覆盖我国华东、西南、华南、华中、华北、东北六大地理分区，为0~20 cm耕层土壤，具体采样点分布和相应的土壤类型见图 1。样品采回后风干、研磨，过5 mm筛备用。土壤Cd背景浓度和土壤主要理化性质（pH、有机质、粘粒、阳离子交换量CEC、持水量）测定结果见表 1，具体分析方法参照《土壤农业化学分析方法》^[23]。

A鹰潭红壤；B乐山紫色土；C盱眙黄棕壤；D长沙水稻土； E韶关赤红壤；F肇庆砖红壤；G都江堰水稻土；H泉州水稻土； I河池红壤；J宜昌水稻土；K沈阳棕壤；L潍坊褐土；M崇左砖红壤； N合肥水稻土；O宁波水稻土；P贵阳黄壤；Q湘乡水稻土；R保定潮土 A-Red soil（Yingtan）；B-Purple soil（Leshan）；C-Yellow brown soil（Xuyi）；D-Paddy soil（Changsha）；E-Lateritic red soil（Shaoguan）；F-Latosol（Zhaoqing）；G-Paddy soil（Dujiangyan）；H-Paddy soil（Quanzhou）； I-Red soil（Hechi）；J-Paddy soil（Yichang）；K-Brown soil（Shenyang）；L-Cinnamon soil（Weifang）；M-Latosol（Chongzuo）；N-Paddy soil（Hefei）；O-Paddy soil（Ningbo）；P-Yellow earth（Guiyang）；Q-Paddy soil（Xiangxiang）；R-Calcareous soil（Baoding）图 1 试验土壤的类型和采集地点 Figure 1 Soil types and sampling sites

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表 1 试验土壤的主要理化性质 Table 1 Main physico-chemical properties of tested soils

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蚯蚓慢性毒性试验参考OECD（OECD Guideline 222）^[24]。试验之前蚯蚓需在玻璃皿中清肠24 h，然后用去离子水洗净，取10条称重，以保证加进去的蚯蚓质量基本一致。镉浓度设置参考急性毒性试验的数据，其最高浓度不超过急性试验最低致死浓度，每个土壤对应设置6个浓度，每个浓度设置4个平行。称取一定量的Cd（Cl）₂·2.5H₂O于50 mL抗凝管中配成水溶液，加入到含有500 g供试土壤的1 L塑料盆中，充分混匀，调节土壤水分含量为最大含水量的60%（定期称量容器来监测土壤的含水量，必要时添加适量水分，以保持一定的湿度），平衡一周后用于试验，土壤中镉的含量范围是0~1000 mg·kg^-1。每盆加10条蚯蚓，待蚯蚓爬进去以后，添加5 g牛粪于土壤表面，然后用保鲜膜封住盆口以防止蚯蚓爬出，并在保鲜膜上用医用小镊子扎几个小孔用以通气。温度设置为（20±1）℃，湿度控制在75%左右，光照强度设在400~800 lx。每周添加一次牛粪，每盆添加5 g。4周后将成蚓取出。用湿筛法将土壤中的蚓茧挑出和计数（上面2.0 mm和下面1.0 mm过两层筛），通过统计土壤中存在的蚓茧数来评估镉对蚯蚓繁殖的影响^[25]。在P=0.05的显著水平上采用Dunnett′s检验方法对处理组和对照组的繁殖输出进行多重比较，以确定最大无影响浓度NOEC^[26]，同时分析镉对蚯蚓产茧量的抑制率，以确定半数有效抑制浓度EC₅₀。

暴露后的蚯蚓用去离子水洗净，清肠24 h，再次用去离子水洗净，用滤纸吸干表面水分，放于-70 ℃冰箱中冷冻，然后用冻干机冻干，称量蚯蚓干重。取整条蚯蚓放于100 mL三角瓶中，加入15 mL浓硝酸并分3次加入2 mL双氧水，加上小漏斗，放置过夜；150 ℃消煮 2 h，在此期间加入一定量双氧水，升高温度到200 ℃左右消煮，直至瓶中只剩少量澄清溶液为止。稍冷后加入5 mL 2 mol·L-1 的盐酸定容至25 mL容量瓶中，用原子吸收分光光度计测定（F-AAS；Hitachi Z-2000，Japan）。同时测定龙虾标准物质（TORT-2，Notional Research Council Canada）中重金属镉的含量，回收率可以达到95%以上。

整个实验过程中，实验组和对照组均没有出现成蚓死亡现象。以产茧量作为参数可以看到，随着土壤镉浓度增加，蚓茧数逐渐降低（图 2）。镉在不同土壤中对蚯蚓产茧量的NOEC并不相同（表 2），以在鹰潭红壤中为最低（10 mg·kg^-1），在保定潮土中最高（100 mg·kg^-1）。镉在18种土壤中对赤子爱胜蚓产茧量的EC₅₀差异也比较大（表 2），在鹰潭红壤中为66.52 mg·kg^-1，而在保定潮土中为263.48 mg·kg^-1，两者之间相差约200.00 mg·kg^-1。可以利用镉对蚯蚓产茧量EC₅₀ 来判断镉对蚯蚓的慢性毒性大小，其结果为：鹰潭红壤>乐山紫色土>盱眙黄棕壤>长沙水稻土>韶关赤红壤>肇庆砖红壤>都江堰水稻土>泉州水稻土>河池红壤>宜昌水稻土>沈阳棕壤> 潍坊褐土>崇左砖红壤>合肥水稻土>宁波水稻土>贵阳黄壤>湘乡水稻土>保定潮土。

图中数据表示平均值±标准误；* 表示与对照相比差异显著，P < 0.05 Mean values are shown with standard deviation；* indicate significant decrease comepared with the control group，P < 0.05图 2 28 d时镉对赤子爱胜蚓产茧量的影响 Figure 2 Effect of cadmium on cocoon production of Eisenia fetida after 28 d exposure

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表 2 暴露28 d时镉对赤子爱胜蚓产茧量的 EC₅₀、NOEC（mg·kg^-1） Table 2 EC₅₀ and NOEC of cadmium for cocoon production of Eisenia fetida after 28 d exposure（mg·kg^-1）

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通过EC₅₀与土壤主要的理化性质逐步多元回归分析，发现pH值（P < 0.001）、有机质含量（P=0.006）、黏粒含量（P= 0.015）显著影响镉对蚯蚓的慢性毒性，其中pH值是最主要影响因素。以pH值、有机质含量、黏粒含量为因子，得出一个包含土壤理化性质的回归方程，此方程可以解释EC₅₀回归模型变异的89.1%（表 3）。同时，对EC₅₀的实测值和预测值作图（图 3，1∶1完全匹配），发现R2可以达到0.874 8。这表明，构建的预测模型能够准确预测不同土壤中镉对蚯蚓的慢性毒性。

图 3 镉对蚯蚓产茧量的实测EC50与预测EC50之间的关系 Figure 3 Correlation between measured and predicted EC50 of cadmium for cocoon production of Eisenia fetida

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表 3 土壤主要理化性质与镉对蚯蚓产茧量EC₅₀（mg·kg^-1）之间的简单和多元回归方程 Table 3 Simple and multiple linear regressions between EC₅₀（mg·kg^-1） of cadmium for cocoon production of Eisenia fetida and soil properties

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从上述18种土壤中选出鹰潭红壤、韶关赤红壤、沈阳棕壤、保定潮土4种土壤，分析28 d蚯蚓体内镉积累量。如图 4可见，蚯蚓体内镉积累量随着土壤中的镉浓度增加而增加，且体内镉含量与4种土壤添加镉的浓度均显著正相关（P <0.05），R2分别为0.979、0.988、0.991、0.993。同时比较这4种土壤添加同样浓度外源镉时蚯蚓体内镉含量，发现鹰潭红壤 > 韶关赤红壤 > 沈阳棕壤 > 保定潮土（图 5）。土壤pH和有机质显著影响Cd的生物有效性，土壤pH越高，有机质含量越高，其生物有效性就越低。这与我们前面研究18种土壤中镉对蚯蚓慢性毒性大小是一致的。蚯蚓体内镉积累量越高，对机体产生的毒性越大，蚯蚓的繁殖能力也就越低。

图 4 土壤镉浓度与蚯蚓体内镉浓度的回归关系 Figure 4 Regressions between cadmium concentration in soils and in Eisenia fetida

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图 5 同样浓度外源镉时4种土壤中蚯蚓体内镉积累量 Figure 5 Accumulation of Cd by Eisenia fetida exposed to four soils for 28 d

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关于不同类型土壤中重金属镉的毒性差异已有一些报道。宋文恩等^[27]研究了镉在8种不同性质的土壤中对T167水稻的生长毒性，发现镉在不同类型土壤中抑制根伸长的EC₁₀范围为1.40~5.25 mg·kg^-1，最大相差275.0%，EC₅₀为 17.83~46.93 mg·kg^-1，最大相差 163.2%。余淑娟等^[28]研究了8种不同性质的土壤中添加外源镉对番茄根系的毒害效应，发现镉抑制根伸长的EC₂₀为0.26~11.61 mg·kg^-1。本研究结果与先前的研究结果是一致的，18种土壤中镉对蚯蚓产茧量产生抑制作用的EC₅₀为66.5~263.5 mg·kg^-1（表 2）。

先前有学者发现，土壤pH、阳离子交换量、有机质含量是影响土壤镉毒性的主要因素^[27]。余淑娟等^[28]认为，土壤 pH 是影响番茄根长的主要土壤性质，土壤有机质含量是影响番茄根系生物量的主要土壤性质，这一观点在研究不同土壤中镉的有效态含量时得到了进一步证实^[29]。Rafiq等^[30]认为土壤 pH 是影响镉毒性和生物有效性的主要因子。本研究结果表明，pH值、有机质含量和粘粒含量是影响镉对蚯蚓慢性毒性的主要因素。

比较4种土壤中蚯蚓的体内镉积累量发现，蚯蚓体内镉积累量随着土壤中镉浓度的增加而增加，且体内镉含量与4种土壤添加镉的浓度均显著正相关（P <0.05），但是当土壤中镉浓度较高时，蚯蚓体内镉积累量降缓。这可能是蚯蚓暴露于高浓度的污染物中，其自身活性降低，进而减少了对污染土壤的摄入，这与先前的研究结果也是一致的。贺萌萌^[31]研究北京潮土中蚯蚓对镉的吸收和富集发现，随着土壤中镉浓度的升高，蚯蚓体内镉的含量先上升后趋于稳定或者略有降低。本研究比较这4种土壤添加同样浓度外源镉时蚯蚓体内含量发现：鹰潭红壤>都江堰水稻土>崇左砖红壤>保定潮土（图 5）。蚯蚓体内镉积累量越高，对机体产生的毒性越大，蚯蚓的繁殖能力也就越低。

土壤老化会对重金属毒性产生很大的影响，这一点已经得到普遍的证实。先前，刘彬等^[32]研究发现，经180 d老化后土壤中重金属镉对水稻生长毒性相对14 d老化处理显著降低^[32]。本研究土壤中外源添加镉以后只平衡一周用于试验，对于平衡不同时间（1、14 d、一个月乃至更长的时间）镉对蚯蚓的生殖毒性差异，有待于进一步研究。

土壤pH值、有机质含量和黏粒含量是影响镉对蚯蚓慢性毒性的主要因素，三者的变化解释了蚯蚓产茧半抑制浓度EC₅₀回归模型变异的89.1%。土壤pH和有机质含量等因素也显著影响镉的生物吸收，土壤pH越高，有机质含量越高其生物有效性就越低。