近年来，我国土壤重金属污染形势十分严峻，近1/5的耕地受到重金属Cd污染，不仅造成了严重的经济损失，而且威胁着人们的健康^[1]，而部分污染土壤盐渍化^[2]及其中Fe、Zn元素的生物有效性低^{[3, 4]}都会影响植物对Cd的吸收，对我国农作物质量安全构成了进一步威胁。有研究表明，Fe、Zn均能与Cd产生交互作用影响植物对Cd的吸收累积^[5]，盐分离子不仅可以活化土壤中的Cd，也会改变植物吸收转运Cd的能力^{[6, 7]}，因此复合胁迫的条件下植物对Cd吸收累积的机制是亟待研究的课题。

植物通过转运蛋白来调节其对金属离子的吸收和体内分配以维持细胞内金属离子的平衡^{[8, 9]}。目前，已报道金属转运蛋白中研究最多的是ZIP家族（ZRT/IRT-like proteins），其中ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZNT1、IRT1等已经从植物中分离并鉴定^[10]。IRT1为铁离子转运蛋白，水稻OsIRT1蛋白能够转运Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺，拟南芥AtIRT1是根部Fe²⁺高亲和性吸收转运蛋白^{[11, 12]}。Cd为植物非必需元素，因而没有高选择性的蛋白通道，酵母试验表明AtIRT1具有广泛的底物特异性，为Cd进入植物体内提供了通道^[13]。IRT1可高效转运Fe²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺离子，相关研究表明铁转运蛋白IRT1可高效转运Cd^[14]。因此，从分子生物学角度探究缺Fe/Zn 及盐分胁迫等处理条件下，IRT1的表达量与Cd含量的关系，对揭示各种营养元素与Cd之间的交互作用机理具有重要意义。

苋菜在中国南方种植广泛，以其丰富的食用价值倍受广大菜农的青睐。但苋菜容易受到Cd污染^[15]，因此本研究选用苋菜作为实验材料，从分子生物学角度探索缺Fe/Zn及盐渍化条件下植物对Cd吸收累积的机制，以期对复合胁迫土壤的安全应用及植物对Cd蓄积机制的完善提供科学依据。

根据前期的筛选结果^[16]，选取Cd低累积品种白梗尖叶苋菜（B）（广州长合种子有限公司）和Cd高累积品种花红苋菜（H）（广州太和广联种苗行）2个广州市常见苋菜品种，供试种子购自广州市种子市场。

白沙：购自河源市英川有限责任公司。其理化性质：总Cd、Zn、Mg、Fe、Mn、Na 含量分别为1.038 μg·kg^-1和41.12、894.3、43.25、2.125、302.0 mg·kg^-1。

将育苗板用洗净灭菌的白沙铺满后置于塑料盆中，供试种子用30%双氧水浸泡10 min后用清水冲洗数次并播种于育苗板中，进行沙培育苗。种子发芽前浇灌适量的蒸馏水以保证种子能够正常发芽，发芽后叶面喷洒100%霍格兰营养液，在塑料盆中加入适量的蒸馏水。3 d后开始在塑料盆中浇灌100%霍格兰营养液，3周后选取长势均匀的苋菜幼苗移于水培盆进行水培试验。水培盆中加入100%的霍格兰营养液，3 d更换一次营养液，经过6 d的全营养液稳定培养后进行处理，共设4个处理。全液：全营养液+Cd；缺Fe：全营养液缺Fe（营养液中不添加Fe元素）+Cd；缺Zn：全营养液缺Zn（营养液中不添加Zn元素）+Cd；加盐：全营养液盐胁迫（添加含量为0.3%的NaCl）+Cd。其中全液为对照组，其余3组为实验组，Cd以Cd（NO₃）₂·4H₂O的形式加入，Cd浓度设置为0.25 μmol·L^-1。每个处理3个重复，3 d换一次营养液，6 d后收获植物。

将收获的植物样品用蒸馏水洗净，将茎叶和根部剪开，取部分根尖的鲜样速冻后置于-80 ℃冰箱保存，茎叶和根部分别用滤纸包好放在烘箱中60 ℃烘干至恒重。称取烘干的植物样0.1~0.4 g于消解管中，加入10 mL硝酸微波消解（CEM corporation，MARS5），消解后将样品定容到25 mL并用中速滤纸过滤，用于测定Cd、Fe、Zn、Na、Mn、Mg的含量。Cd的测定使用石墨炉原子吸收分光光度计（日本岛津公司，AA-7000），其余金属使用等离子发射光谱仪（美国PE公司，OPTIMA2000DV）测定。用Trizol试剂提取植物根部总RNA并通过凝胶电泳检验RNA的完整性，用cDNA反转录试剂盒合成cDNA的第一条链，通过实时荧光定量PCR仪（BioRad，CFX96）测定IRT1的表达量。引物根据苋菜IRT1基因序列利用Oligo 7设计并由上海生工生物工程有限公司合成。

利用SPSS 11.0对数据进行标准方差分析以及显著性差异分析，显著性差异分析选用邓肯统计方法。

缺Fe/Zn和盐胁迫处理下，苋菜生物量的变化如图 1所示。缺Fe、缺Zn及盐胁迫处理下2个苋菜品种生物量均明显低于对照组，缺Fe处理下生物量下降最为明显，在缺Fe处理下2个品种总生物量分别下降85.43%（B）和55.89%（H）；盐胁迫处理对植物生物量影响最小，2个品种总生物量分别下降29.83%（B）和17.21%（H）。由此可知3个处理中缺Fe对植物的生物量影响最大。B品种在3个处理组中生物量较对照组的下降率都比H品种高，缺Fe/Zn和盐胁迫对B品种生物量的影响作用都比H品种大。

图 1 苋菜的平均鲜重 Figure 1 Average fresh weight of amaranth

图选项

由图 2可知，缺Fe、缺Zn处理下2个苋菜品种茎叶和根部的Cd含量均显著高于对照组，而盐胁迫处理茎叶的Cd含量显著低于对照组。2个品种在缺Fe处理中，茎叶和根部Cd含量相对于对照组增幅均比其他处理组大，茎叶分别增加195%（B）和24%（H），而根部分别增加36%（B）和281%（H）（P < 0.05）；在缺Zn处理中，茎叶相对于对照组分别增加58%（B）和25%（H），而根部分别增加19%（B）和72%（H）；在盐胁迫中茎叶相对于对照组分别增加16%（B）和15%（H），而根部分别减少40%（B）和增加36%（H）。在相同处理组中，B品种茎叶Cd含量相对于对照组的增幅都较H品种高，但是根部却呈现相反的趋势。

不同大写字母代表相同品种不同处理间差异显著；不同小写字母代表相同处理不同品种间差异显著（P < 0.05）。下同 Different uppercase letters indicate significant difference between treatments within a cultivar；different lowercase letters indicate significant difference between cultivars within a treatment（P <0.05）. The same below图 2 苋菜根部和茎叶中的Cd鲜重含量 Figure 2 Cadmium content in roots and stems of amaranth

图选项

由表 1可知，在缺Fe处理中，2个品种茎叶Zn、Mg、Fe、Mn的含量都显著高于对照，且增加幅度较其他处理组大；缺Zn处理中Fe、Mg两元素的含量显著高于对照组，而Zn元素含量显著低于对照组；盐胁迫处理中Zn、Mg、Fe、Mn含量均显著高于对照组（P < 0.05）。H品种在4个处理中各矿质元素的含量均高于B品种。在盐胁迫处理中，H品种根Na含量显著高于B品种，但是B品种茎叶Na含量显著高于H品种（P < 0.05），并且两品种茎叶Na的鲜重含量较对照组分别增加44.20倍（B）和16.86倍（H），根部Na的鲜重含量较对照组分别增加11.52倍（B）和20.93倍（H）。B品种茎叶Na元素的鲜重含量较对照组的增幅大于H品种，而根部表现出相反的趋势。

表 1 两个苋菜品种茎叶、根部矿质元素的鲜重含量 Table 1 Content of mineral elements in stems and roots of amaranth

表选项

IRT1能够转运包括Fe和Zn在内的众多金属离子。根据图 3可知，3个处理组根部 IRT1的表达量都比对照组高。对照组中B品种IRT1的表达量低于H品种，但是缺Fe、缺Zn处理中B品种根部IRT1的表达量显著增加，并且高于H品种（P < 0.05）。H品种缺Fe、缺Zn处理中根部 IRT1的表达量与对照组差异不显著，而盐胁迫处理中根部 IRT1的表达量显著高于对照组（P < 0.05）。

图 3 苋菜根部IRT1的表达量 Figure 3 Expression of IRT1 in roots of amaranth

图选项

本研究发现，在缺Fe/Zn条件下2个苋菜品种的生物量都较对照组明显减少。由于Fe和Zn元素都是植物生长所必需的元素，并与植物的光合作用有关，它们的缺乏会影响植物的正常生长，且有研究表明Cd对植物的光合作用有一定的阻碍作用，因此，在Cd存在条件下，缺Fe/Zn会导致植物生物量的降低^{[17, 18, 19]}。实验过程中缺Fe处理新叶变黄，这可能是由于植物对Fe的需求量较其他必需元素大，故在缺Fe处理中因缺少Fe元素而阻碍了叶绿素的合成，新叶叶片变黄，光合速率降低^{[20, 21]}。缺Zn处理中，植物生物量减少的幅度明显小于缺Fe。虽然大量研究表明Zn元素的缺失也会影响植物正常的光合作用，阻碍植物的正常生长^[22]，但是因为植物对Zn元素的需求量小，并且实验中植物仅缺Zn 6 d，时间较短并未表现出明显的病症，所以生物量降低幅度不大。本研究发现，盐胁迫下2个苋菜品种的生物量较对照组都有所降低。赵可夫^[23]发现盐胁迫会对植物造成渗透胁迫和离子胁迫，其中渗透胁迫造成植物吸水困难，而离子胁迫对植物代谢功能产生毒害，从而影响植物的正常生长，导致生物量降低。因此，在Cd与缺Fe、Cd与缺Zn、Cd与盐胁迫对植物的双重毒害作用下，3个处理组的植株生长受到不同程度的抑制，生物量都比对照组明显减少。

通过对两个苋菜品种茎叶和根部Cd含量的测定，发现在缺Fe、缺Zn处理中植物茎叶和根部Cd含量较对照组显著增加。有研究表明Cd与Fe、Zn的吸收都存在拮抗作用，Cd可以通过Fe和Zn的转运通道进入植物体内^{[14, 24, 25]}，因此在缺Fe、缺Zn处理中Fe元素和Zn元素的缺失促使大量的Cd进入植物体内，使植物茎叶大量累积Cd。而研究发现在盐胁迫处理中两个品种茎叶Cd含量都较对照组有所降低。大量研究表明盐分离子可以通过增加土壤中Cd的移动性和生物可利用性来促进植物对重金属的累积^[26]，然而在水培条件下NaCl中的Cl-可以与Cd²⁺形成CdCl_n^2-n，植物对Cd²⁺的吸收效率比CdCl_n^2-n高，因此在盐胁迫中植物地上部Cd含量较对照组要低^[6]。在盐胁迫处理中，由于处于高盐度的环境中，植物通过大量吸收环境中的水分来降低体内的盐分浓度，植物体内水分可能进一步增加了金属的可移动性，从而促进了金属元素从根部向茎叶的转移，因此在盐胁迫处理中茎叶中Fe、Mg、Zn以及Mn等金属元素的含量绝大多数较对照组要高。本研究发现在盐胁迫处理中B品种茎叶Na、Cd的鲜重含量较对照组的增幅大于H品种，而根部表现出相反的趋势。相关研究表明植物把过量的盐分离子隔离在对其生命活动影响小的部位，从而减少盐分的毒害作用^{[27, 28]}。H品种将盐分和Cd截留在根部，减少向茎叶的转移从而减少盐分对其生长的毒害，因此H品种比B品种耐盐性更强。两个苋菜品种根部矿质元素的含量在不同处理组之间变化较为复杂，则是由于根部不仅是重金属吸收的部位也是重金属转移的部位，不同品种之间的重金属累积能力也存在诸多差异。

IRT1为Fe离子转运蛋白，定位于细胞质膜上，在缺Fe条件下主要在根部外皮层表达，将Fe和其他金属从根外转运至表皮细胞内^[30]。本研究对照组中 H品种IRT1的表达量高于B品种，是由于Cd通过IRT1进入了植物体内。有研究表明IRT1可能是苋菜吸收Cd的一个关键基因^{[31, 32]}。在本研究缺Fe、缺Zn处理中，2个苋菜品种根部IRT1的表达量都有所增加，并且这2个处理组中茎叶、根部Cd含量都显著增加。Lee等^[13]发现缺Fe胁迫能够诱导拟南芥根部IRT1的转录。故笔者认为缺Fe、缺Zn诱导了IRT1的表达。Nakanishi等^[11]发现IRT1的选择性低，可以转运众多二价金属离子，IRT1的大量表达也会引起植物对于其他金属元素的吸收增加，故本研究中缺Fe、缺Zn处理Fe、Zn、Mg、Mn元素的含量显著增加。盐胁迫处理中，茎叶与根部Na元素的含量急剧上升，其他的矿质元素含量显著增加但是幅度不大，而两个品种根部IRT1的表达量较对照组都显著增加（P < 0.05）。由此推论Na元素可能通过IRT1所控制的蛋白通道进入植物体，虽然大量Na离子的存在促进了植物IRT1的大量表达，但是Na离子占据了通道，因而矿质元素含量增幅不明显，Cd含量显著减少。

对照组中，H品种IRT1表达量高于B品种，在缺Fe、缺Zn处理组中，B品种IRT1表达量显著增加，其茎叶Cd累积量也较对照组显著增加，而H品种IRT1表达量增加不显著（P>0.05）。因此可以推断，IRT1的表达过量可以增加植物对Cd的吸收累积，但IRT1并非植物吸收转运Cd的唯一关键基因。陈艳芳等^[33]证明HMA4也是植物转运Cd的一个重要基因。在缺Fe、缺Zn处理组B品种IRT1大量表达，H品种中表达量增加幅度不大，因而缺Fe、缺Zn能够在更大程度上刺激Cd低累积品种IRT1的表达。

（1）Cd低累积品种苋菜（B）对缺Fe/Zn及盐胁迫的耐性较差，在缺Fe环境中种植会极大地增加作物的健康风险，且在受污染土壤中其生物量较少，不适宜污染地区农业种植。Cd高累积品种苋菜（H）的生物量受到复合污染的影响较小，并表现出了较高的耐盐性，可以在盐渍化土壤中种植。

（2）缺Fe/Zn可以促进Fe转运蛋白IRT1的表达，而IRT1的表达过量可以增加植物对Cd的吸收累积，因此在关注土壤Cd污染对农作物质量安全影响时，不仅要关注污染土壤中Cd的含量，也应该关注土壤中矿质元素的含量。

（3）盐分环境中大量Na元素占据IRT1，抑制了植物对Cd的吸收，但是在盐渍土壤中植物对Cd的吸收是一个复杂的过程，还需要进一步的研究。