重金属镉（Cd）是植物生长的非必需元素，容易被植物吸收富集，具有极强的生物毒性。2011年的统计结果显示，随着世界范围内环境污染的加剧，每年进入土壤的镉有2.2万t，被镉污染的耕地超过1.3×10⁴ hm^{2 [1]}。植物首先通过根系吸收土壤中的镉，然后转运到植株的地上部，所以植物根系是最先受到镉毒害的部位，也是损伤最严重的器官之一^[2]。高浓度的Cd处理能对大麦根系造成严重氧化损伤，膜脂过氧化产物（丙二醛）积累，进而使根部的细胞膜透性增加，而长时间的Cd胁迫会导致植物根部的渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖含量下降^[3]。杨颖丽等^[4]对Cd影响小麦叶片渗透调节物质的研究也表明，低浓度Cd处理时，小麦叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量显著升高以维持细胞渗透势；随着 Cd处理浓度继续升高，叶片中脯氨酸含量基本保持不变，可溶性糖持续积累，而可溶性蛋白含量降低。可见Cd胁迫过程中，为了应对胁迫造成的细胞膜透性增大、避免大量的电解质渗漏导致细胞死亡，植物细胞会通过改变渗透调节物的含量来维持细胞正常渗透压。

最近几年的研究表明，H₂S作为一种气体信号分子，在植物抵抗各种环境胁迫过程中起到了重要的保护作用。关于H₂S对植物重金属胁迫的缓解作用已有一些报道，在植物受到重金属胁迫时，植物体内的H₂S合成增加，进而促进还原型谷胱甘肽、抗坏血酸的合成，并提高一系列抗氧化酶的活性来维持细胞内氧化还原状态的平衡，降低胁迫造成的氧化损伤^{[5, 6, 7]}。调控重金属离子的吸收和在植物体内的转运也是H₂S作为信号分子缓解重金属对植物毒害的一种方式。研究^{[6, 7, 8]}表明，H₂S可通过提高Na⁺-ATPase、K⁺-ATPase 和H+-ATPase的活性来抑制植物对重金属离子的吸收，同时增加植物对S、P、Ca、Mg和 Fe的吸收。H₂S还可以抑制受H2O2调控的Ca通道来阻挡Cd2+进入质膜，并且激活液泡膜上的转运通道，将胞质中Cd2+转运至液泡，从而降低胞质内重金属离子的浓度^[9]。外源H₂S可通过提高油菜的叶绿素含量、光合作用强度，以及促进细胞内叶绿体内囊的发育，增加线粒体数目来缓解Cd胁迫^[10]。本实验室前期的研究还发现，H₂S与其他信号分子和多种激素的相互作用可缓解重金属对植物造成的伤害^{[11, 12]}。

本文以白菜（Brassica rapa pekinensis）幼苗为实验材料，探究H₂S能否减轻Cd胁迫对植物根系造成的损伤，增加植物的含水量，以及这种对根系透性的保护作用是否通过调节体内多种渗透调节物质的合成来实现，旨在完善H₂S抵抗重金属胁迫的生理机制，为提高农作物抗逆性的应用提供理论基础。

实验选用“津育75号”白菜，选择大小均匀、饱满的种子，浸种24 h，摆于培养皿中，每皿30粒，黑暗萌发2 d，然后在温度23 ℃、相对湿度60%、光照度3000 lx、光周期16 h/8 h (昼/夜)条件下生长，每皿每天补充1/2 MS培养液2 mL。2 d后进行实验处理，每一处理设三个重复。

向培养皿中加CdCl₂溶液使其终浓度分别为2.5、5 mmol·L^-1，分别处理0、12、24、36、48 h，取根测定丙二醛（MDA）含量和相对电导率。

以NaHS作为外源H₂S供体，将各组幼苗置于等体积的密闭玻璃罩内，用ddH₂O配制1、5、10、50、100 μmol·L^-1 浓度的NaHS溶液，置于玻璃罩内熏蒸幼苗24 h，然后向培养皿中加CdCl₂溶液使其终浓度为5 mmol·L^-1，48 h后测定白菜幼苗根部的相对电导率。

5 μmol·L^-1 NaHS熏蒸幼苗24 h，向培养皿中加CdCl₂溶液使其终浓度为5 mmol·L^-1，CdCl₂处理时间为0、12、24、36、48 h，测定根部相对电导率、相对含水量，以及可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱含量。

在培养皿中加入HA溶液使其终浓度为1 mmol·L^-1，24 h后向培养皿中加CdCl₂溶液使其终浓度为5 mmol·L^-1。CdCl₂处理时间为0、12、24、36、48 h，取根测定脯氨酸和可溶性糖含量。

MDA的测定用硫代巴比妥酸法^[13]；细胞膜透性、可溶性蛋白含量以及脯氨酸含量测定参考李合生^[14]的方法；可溶性糖含量测定参考文献[15]；相对含水量测定参考Coleman^[16]的方法；甜菜碱的测定参考崔艳红等^[17]的方法。

统计分析采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，实验数据用平均值±标准误表示，Duncan′s测验分析组间差异性。

CdCl₂处理48 h 后白菜幼苗的生长表型如图 1a所示。MDA是脂质过氧化的产物，同时也是膜脂氧化损伤的重要指标。结果显示（图 1b），2.5 mmol·L^-1和5 mmol·L^-1的CdCl₂处理12 h都能引起白菜幼苗根部的MDA含量升高，随着处理时间的延长，MDA含量处于较高的水平，且5 mmol·L^-1 CdCl₂处理引起的MDA含量升高幅度大于2.5 mmol·L^-1 CdCl₂处理。CdCl₂胁迫后造成白菜幼苗根中MDA的大量积累，表明CdCl₂对细胞膜造成氧化损伤，导致细胞内的物质外渗，引起根部相对电导率的增加，所以可通过测定根部相对电导率来反映Cd胁迫对细胞膜透性的影响，结果如图 1c所示。2.5 mmol·L^-1和5 mmol·L^-1 CdCl₂处理12 h和24 h，白菜幼苗根部的相对电导率与对照相比没有显著变化；CdCl₂处理36 h和48 h引起白菜根部相对电导率增大，且5 mmol·L^-1 CdCl₂处理组的相对电导率增幅高于2.5 mmol·L^-1 CdCl₂处理组。

*和**分别表示与同一处理时间的对照相比差异显著(P < 0.05)和极显著(P <0.01) *and**indicate significant difference at P <0.05 and P <0.01图 1 CdCl2处理后白菜幼苗生长型以及根系MDA含量 和细胞膜透性的变化 Figure 1 Effects of Cd on phenotypes of cabbage seedlings, and MDA content and cell membrane permeability in cabbage roots

图选项

如图 2a所示，1、5 μmol·L^-1和10 μmol·L^-1的NaHS预处理能够明显（P < 0.05）降低Cd造成的白菜根系相对电导率增加，缓解Cd胁迫对根细胞的伤害；50 μmol·L^-1 NaHS预处理没有缓解作用，NaHS浓度增加到100 μmol·L^-1时，相对电导率增加到89.51%，与单独CdCl₂处理相比升高显著（P < 0.05），即加重了CdCl₂对细胞膜的损伤。根据以上结果，选取5 μmol·L^-1作为后续实验的NaHS预处理浓度，以相对电导率和相对含水量作为衡量H₂S缓解Cd胁迫对根细胞膜透性影响的指标，结果如图 2b所示，CdCl₂胁迫时间为36 h和48 h时，经NaHS预处理的Cd胁迫下的幼苗根部的相对电导率低于未经NaHS预处理的Cd胁迫幼苗，即H₂S表现出缓解作用。NaHS预处理组的相对含水量在CdCl₂胁迫36 h和48 h的下降速度减缓，与未经NaHS预处理组相比差异显著（图 2c）。以上结果表明H₂S能够缓解Cd胁迫引起的白菜幼苗根细胞膜透性升高。

不同字母表示用Duncan′s测验分析组间的显著性差异。下同 Different letters indicate significant difference between treatments. The same below图 2 外源H2S处理对Cd胁迫下白菜幼苗根系的细胞膜透性和相对含水量的影响 Figure 2 Effects of exogenous H2S on cell membrane permeability and water content in cabbage roots under Cd stresses

图选项

如图 3a、图 3b所示，单独CdCl₂胁迫和经NaHS预处理的CdCl₂处理组相比，可溶性蛋白和甜菜碱含量均没有显著变化。图 3c显示，CdCl₂胁迫24 h和36 h的白菜幼苗根部脯氨酸含量升高，胁迫48 h的脯氨酸含量恢复到对照水平；NaHS预处理后CdCl₂胁迫12、24、36、48 h的白菜幼苗根部脯氨酸含量都高于对照组和未经NaHS预处理CdCl₂胁迫下的幼苗。图 3d显示，CdCl₂胁迫12、24、36、48 h白菜幼苗根部可溶性糖含量极显著下降；NaHS预处理后，CdCl₂胁迫36 h下幼苗的可溶性糖含量有所回升，在48 h恢复到对照水平，高于未经NaHS预处理CdCl₂胁迫下的幼苗。综合上述实验结果，H₂S通过增加白菜幼苗根部脯氨酸和可溶性糖的含量来缓解Cd引起的渗透胁迫。

图 3 外源H2S对Cd胁迫下白菜幼苗根系渗透调节物质含量的影响 Figure 3 Effects of exogenous H2S on osmoticum in cabbage roots uder Cd stresses

图选项

如图 4a所示，CdCl₂胁迫12、24、36 h均引起白菜幼苗根部脯氨酸含量升高，脯氨酸含量在CdCl₂胁迫48 h恢复到对照水平；HA预处理后CdCl₂胁迫没有引起脯氨酸含量升高。图 4b所示，CdCl₂胁迫和HA预处理后CdCl₂胁迫都引起白菜幼苗根部可溶性糖含量的下降；HA预处理后CdCl₂胁迫36 h和48 h的白菜幼苗根部可溶性糖含量比单独CdCl₂处理组下降50% 左右。以上结果进一步表明，H₂S通过增加白菜幼苗根部渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的含量来缓解Cd引起的渗透胁迫。

图 4 HA处理对Cd胁迫下白菜幼苗根系脯氨酸和可溶性糖含量的影响 Figure 4 Effects of HA on proline and soluble sugar in cabbage roots uder Cd stresses

图选项

植物在遇到干旱、高盐、低温以及重金属等逆境胁迫时，能够直接或间接地发生水分胁迫。植物为了适应逆境，会在短时间内迅速大量地合成如脯氨酸、可溶性糖、 甜菜碱、可溶性蛋白、有机酸等一系列渗透调节物质，来增强其对渗透胁迫的防御能力，以提高植物抗逆能力^[18]。重金属胁迫引起的植物体内各种渗透调节物质含量的变化，被认为是植物对重金属胁迫的解毒机制之一^{[19, 20]}。本研究发现，H₂S作为一种生理性的气体信号分子参与了白菜幼苗根部Cd诱导的渗透胁迫，一定范围内的外源H₂S能降低Cd胁迫时白菜根系的渗透性增加，提高保水能力，并且通过增加渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的积累，降低胁迫造成的细胞膜透性增大。

随着Cd胁迫时间的持续和处理浓度的增加，MDA含量和细胞膜透性均增大，而且二者的变化规律基本一致，MDA含量在胁迫12 h后增加显著，但是CdCl₂处理组的相对电导率在12 h和24 h时与对照相比没有显著差异，处理时间达到36 h时，才与对照组有显著的差异，表明细胞膜的损伤滞后于植物体内MDA含量的增加。推测可能是植物在细胞膜受到氧化损伤后，结构和功能遭到破坏，由于机体内存在渗透调节机制，可以帮助细胞维持一定的渗透压，暂时抵御细胞内物质的大量外渗。但是当植物受到的胁迫继续加重，超出这一作用的调节范围时，相对电导率则会增大。

众多的研究表明H₂S参与了植物抵抗重金属胁迫的过程^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]}。本研究用NaHS作为H₂S的供体预处理白菜幼苗时，发现1、5、10 μmol·L^-1的NaHS预处理后再经Cd胁迫，白菜幼苗根系的相对电导率会降低（P < 0.05），而浓度为50 μmol·L^-1时相对电导率与对照相比则没有差异；当NaHS浓度达到100 μmol·L^-1时，相对电导率显著高于对照组（P < 0.05），表明H₂S在提高植物抵抗逆境时具有一定的浓度范围（图 2a）。尽管众多的结果显示不同实验材料、不同研究系统所确定的浓度范围不同，但这符合气体信号分子的特点，即在生理浓度下才具有明确的生理功能，而且也可以解释为什么H₂S对生物体具有生理和毒理的双重作用^{[21, 22]}。

脯氨酸是一种水溶性的氨基酸、渗透调节物质和细胞质渗透物质，可保持植物受环境胁迫时的膨压^[23]。可溶性糖作为一种小分子溶质也参与了植物抵抗渗透胁迫，还可能在维持植物蛋白质稳定方面起到重要作用^[24]。从实验结果可以看出，NaHS预处理没有改变Cd胁迫后脯氨酸先升后降的变化趋势，但是增加了白菜根系中脯氨酸的含量。白菜根系中可溶性糖在处理的0~24 h期间受到Cd的影响急剧下降，与张义贤等^[3]的研究结果相符。但是NaHS预处理组根系中脯氨酸含量下降以后可溶性糖却迅速积累，说明 H₂S在Cd胁迫早期主要促进了脯氨酸的生成，而到了胁迫后期则主要引起可溶性糖的积累，这时可溶性糖代替脯氨酸成为主要的渗透调节物质，保护细胞免受伤害。

综上所述，H₂S对Cd胁迫下植物体内脯氨酸和可溶性糖含量有调节作用，对提高植物的抗逆能力是有益的。但是这种调节作用是通过何种途径，何种方式实现的，将作为我们后续的研究内容。

（1）1、5、10 μmol·L^-1的NaHS预处理后再经Cd胁迫，白菜根系的相对电导率降低，含水量增加，而较高浓度NaHS和Cd则可对白菜根系造成双重伤害。因此，通过外施H₂S提高植物的抗逆能力时，要注意施用浓度的选择。

（2）H₂S提高Cd胁迫下白菜根系抵抗渗透胁迫的能力，主要是通过增加根部渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的积累来实现的。

（2）H₂S提高Cd胁迫下白菜根系抵抗渗透胁迫的能力，主要是通过增加根部渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的积累来实现的。