铜类杀菌药物及肥料的使用造成养殖水体重金属铜污染，并通过生物富集和生物放大效应对水生态系统产生重要影响，特别是对鱼类等水生生物有较强的毒性^{[1, 2]}。作为水生生物食物链的顶层类群，鱼体内污染物水平和鱼对污染物产生的生物效应可客观反映水环境的状况。研究表明长江沉积物中重金属铜的富集系数较高^[3]，关于重金属铜在草鱼（Ctenopharyngodon idella）组织中的积累与分布和毒性效应的研究文献报道较多，铜对草鱼存活率和生长^[4]、体内酶活性、抗氧化功能、遗传物质^[5]等方面的影响已有相关研究。但目前关于铜暴露导致草鱼幼鱼代谢及行为变化的研究尚鲜见报道。

鱼类生理生态行为对环境因子变化的适应性最先表现为行为上的改变^[6]，临界游泳速度（U_crit）在某种程度上反映了动物的有氧运动能力，代谢率范围（Metabolic rate range）用于评价鱼类的有氧代谢能力^{[7, 8]}。本文通过研究不同浓度水体铜暴露对草鱼幼鱼游泳能力与代谢范围以及组织（鳃、肝、肌肉）铜累积量的影响，考察其幼鱼因水体铜浓度变化而引发的运动和代谢方面的改变，从而评估铜污染对草鱼幼鱼潜在的生态毒性，为水生态毒理学基础研究提供参考，对水体重金属污染、水产品养殖及环境治理决策具有实际意义。

实验用草鱼幼鱼于2015年1月购于宜昌养殖场。实验前将鱼在实验室鱼缸（420 L）中驯化2周。每2 d投喂饲料1次，饲料成分：蛋白质>38%，脂肪>5%，纤维素<5%，灰分<12%，湿度<11%。驯养用水为曝气后的自来水，驯养期间充气使水体溶氧水平接近饱和，日换水量约为水体的1/3，自然水温（15±1）℃，自然光照。在实验前48 h停止喂饵料。

驯养结束后，选取健康幼鱼60尾，随机平均分配至各浓度梯度组，实验鱼体长、体重参数如表 1。根据急性毒性试验结果，本研究共设5个铜（Cu²⁺）浓度梯度，分别为0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L^-1，暴露时间为96 h。暴露期间不投饵，每日定时换水并补充相应浓度的硫酸铜溶液以保持水体铜浓度基本恒定，实验条件与驯养期间保持一致。

表 1 草鱼幼鱼的体长、体重参数（平均值依标准差） Table 1 Body length and weight parameters of juvenile grass carp（mean±SD）

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采用鱼类游泳能力测定装置^[9]测定草鱼U_crit。将每个处理实验鱼在暴露96 h后转入游泳能力测定装置中驯化2 h（流速为0.1 m·s^-1）。适应结束后，采用逐步递增法，直至实验鱼运动疲劳，其判定标准为：实验鱼被水流冲到游泳区后面筛网上贴网不能游泳，则视为疲劳^[9]。U_crit计算公式：

实验中时间步长T₂=30 min，流速增量U₂=1 BL·s^-1。

实验过程中每间隔5 min测定一次水中溶解氧含量，利用充氧泵进行内外水槽水的交换，使密封水槽溶解氧量不低于饱和溶解氧浓度的75%。游泳运动代谢率的计算公式：

式中：MO₂为标准体重的运动代谢率，mg O₂·h^-1·kg^-1；S_f为实验鱼游泳时溶氧值随时间变化斜率的绝对值（表观耗氧量）；S₀是无实验鱼存在的溶氧值随时间变化斜率的绝对值（细菌耗氧量）；60为时间常数，min·h-¹；V是实验水体系统总体积，L；m为鱼体重，kg。

代谢范围为最大耗氧代谢率与最小耗氧率的差值。

鱼体组织Cu²⁺含量测定：将草鱼幼鱼用丁香酚溶液麻醉后，解剖分离出鳃、肝脏、肌肉组织并于-40 ℃保存。将各组织样本（以相同处理下12尾鱼组织为一个样本，分3组，对照组6尾鱼）称取2 g（湿重）并置于50 mL聚四氟乙烯消解罐中，加入4 mL HNO₃（65%）过夜，然后加入2 mL HClO₄（70%），电热板上150 ℃加热，蒸发至近干，冷却后加适量0.1% HNO₃，转移到50 mL容量瓶，0.1%HNO₃定容。采用SPECTRA-240FS-石墨炉火焰型原子吸收分光光度计（Varian，美国）测定组织铜含量。利用标准物质法校准（DORM-2 National Research Council，Canada），回收率97.9%~108.3%。组织中重金属含量用mg·kg^-1（湿重，平均值±标准误）表示。

实验数据利用SPSS 20.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA，Duncan post hoc test）并检验差异显著性。统计数据表示为平均值±标准误（Mean±S.E），显著性水平为P<0.05。

采用静水急性毒性试验法测定铜对草鱼幼鱼的毒性，统计铜污染暴露24、48、72、96 h后草鱼幼鱼死亡率，直线内插法计算获得LC₅₀分别为0.12、0.094、0.093、0.078 mg·L^-1，根据96 h LC₅₀×0.1计算安全浓度为0.008 mg·L^-1。急性铜暴露下草鱼幼鱼鳃（F=2.04；P=0.16）、肝脏（F=1.99；P=0.17）和肌肉（F=1.99；P=0.17）组织中铜累积量各处理间差异不显著。铜暴露后幼鱼组织中Cu²⁺的累积量如图 1所示。

图 1 铜暴露后草鱼幼鱼鳃、肝脏、肌肉组织铜累积量 Figure 1 Gill，liver and muscle copper contents in juvenile grass carp after exposed to different copper concentrations

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铜暴露对草鱼幼鱼临界游泳速度的影响显著（F=36.21，P＜0.001），如图 2所示。随着铜浓度增加，草鱼幼鱼相对临界游泳速度逐渐下降，当铜浓度为0.075~0.10 mg·L^-1时，草鱼幼鱼相对临界游泳速度显著降低（P<0.05）。对照组相对临界游泳速度为（6.83±0.24） BL·s-1，0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L^-1暴露组分别为（5.58±0.19）、（5.34±0.18）、（4.53±0.11）、（4.23±0.05） BL·s-1，为对照组的81.61%、78.19%、66.24%和61.90%。

图 2 铜暴露对草鱼幼鱼相对临界游泳速度的影响 Figure 2 Effect of copper exposure on Ucrit in juvenile grass carp

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图 3a显示，随着游泳速度的增大（1~4 BL·s^-1），草鱼耗氧代谢率呈增加趋势。游泳速度与草鱼幼鱼代谢率可以用指数关系MO²=a+b×U^c表示（a、b、c为相关参数），其结果见表 2。随着暴露浓度增加，速度参数c值增加，不同浓度铜暴露使c分别比对照组增加了37.78%、33.33%、56.67%和61.11%。图 3b显示，铜暴露对草鱼幼鱼有氧代谢范围影响显著（F=7.19，P=0.005），随着暴露浓度增加，有氧代谢范围增大，浓度为0.10 mg·L-1时有氧代谢范围比对照组增加了37.48%。

图 3 铜暴露对草鱼幼鱼代谢率（a）及活动代谢（b）范围的影响 Figure 3 Effect of copper exposure on metabolic rate（a）and metabolic rate range（b）of juvenile grass carp

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表 2 不同铜暴露处理下草鱼幼鱼游泳速度与代谢率关系 Table 2 Relationship between swimming speed and oxygen metabolic rate under different concentrations of copper exposed

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在评价重金属污染安全时，污染物毒性以及污染物对鱼类行为影响的量化很重要，但是由于不同区系生物受生活环境等因素的影响，如不同物种对铜的耐受性和敏感度存在很大的差异^[10]。如铜对广东鲂幼鱼（Megalobrama terminalis）安全浓度为0.01 mg·L^{-1 [11]}，而对中华鲟（Acipenser sinensis Gray）幼鱼的安全浓度为0.002 mg·L^{-1 [12]}，远低于中国渔业水质标准（铜的最高容许质量浓度为0.01 mg·L^-1）。本研究中Cu²⁺对草鱼幼鱼安全浓度为0.008 mg·L^-1，根据有毒物质对鱼类的毒性标准^[13]，可判断Cu²⁺对草鱼幼鱼具有高毒性。鳃是鱼类呼吸滤食的主要器官，直接暴露在重金属环境中，因而对重金属的积累较大；肝脏是金属硫蛋白合成的主要场所，肝脏等组织中重金属积累明显；相对其他组织器官而言，肌肉代谢较慢，而且没有直接暴露于重金属。因此，鱼类对重金属的累积量为肝脏>鳃>肌肉^{[14, 15]}。铜暴露导致鳃和肝脏组织铜硫蛋白络合物（Cu-MT）的含量明显增加，加速了Cu²⁺在鱼体内的代谢进程，多余的Cu²⁺结合蛋白进入血液循环，并排泄到体外^[16]。因此急性铜暴露后，鱼体肝脏、鳃和肌肉组织重金属累积量无显著差异。

鱼类呼吸系统的变化能迅速反映出机体自身机能的变化，它们对外环境变化敏感，是反映机体机能状态的重要指标。代谢率和代谢范围的测定能在一定程度上反映鱼类有氧运动的能力，对鱼类行为测定具有重要的意义^{[17, 18]}。随着暴露浓度增加，草鱼幼鱼呼吸代谢作用增强，有氧代谢范围显著增加（F=7.19，P<0.01）。Cu²⁺等重金属产生毒性效应的途径之一是诱导活性氧的产生^[19]。在正常生理状态下，鱼类抗氧化系统能够清除机体代谢所产生的活性氧；在其暴露于一定浓度污染物时，会诱导活性氧产生，导致相关抗氧化酶活性发生变化，对机体产生损伤^[20]。低浓度Cu²⁺能够诱导鳃组织补偿（细胞增生、黏液分泌）反应^[21]，阻碍Cu²⁺的进入，降低鳃损害程度^[22]，而且铜暴露会刺激鳃膜以及口腔上皮，导致鱼大量更频繁地移动，使耗氧率增加^[23]。本研究与其相似，低浓度铜暴露诱导产生补偿性反应，草鱼幼鱼呼吸代谢作用增强。耗氧率和游泳速度呈幂函数关系MO₂=a+b×U^c，其中反映游泳效率的速度常数c值越大游泳效率越低^[9]。实验中c值变化趋势随着暴露浓度的增加而上升，即铜暴露导致游泳效率下降。

研究表明，外源化学物质诱导所产生的解毒作用引起鱼类代谢水平升高，能量大量消耗导致活动能力降低^{[24, 25]}。重金属铜暴露使草鱼幼鱼能量的过量消耗，导致游泳能力的降低，不同浓度Cu²⁺暴露后U_crit分别较对照组下降了18.4%、21.8%、33.8%和38.1%。另外，研究表明重金属暴露可能导致神经细胞内钙超负荷^[26]，甚至造成中枢神经系统结构损伤^[27]，影响神经细胞功能活动，阻碍了神经-肌肉突出的神经传导^[28]，影响肌肉收缩。因此，Cu²⁺暴露导致草鱼幼鱼临界游泳速度降低，也可能是神经系统损伤引起的。环境胁迫产生的应激行为反应机理十分复杂，涉及神经系统、内分泌系统及免疫系统的一系列活动，而且环境因素和重金属之间的相互作用对不同年龄鱼类运动和代谢行为影响的研究，在实际应用中具有更重要的生产实践意义，有待进一步的研究。

（1）Cu²⁺对草鱼幼鱼具有较高毒性，安全浓度为0.008 mg·L-1，草鱼幼鱼对Cu²⁺反应灵敏。急性铜暴露草鱼肝脏、鳃和肌肉组织铜累积量无显著差异。

（2）低浓度Cu²⁺暴露诱导刺激鳃膜以及口腔上皮产生应激性反应，导致草鱼幼鱼大量更频繁地运动，呼吸代谢作用增强，能量过量消耗，游泳效率下降，游泳能力降低。