2012年我国番茄（Lycopersicum esculentum Mill.）栽培面积达到100万hm2^[1]，是最重要的棚室蔬菜之一。设施番茄经济效益高、农民增收效果明显、单位面积产值远超过大田粮食和露地蔬菜作物。连作是目前我国设施番茄栽培的主要方式，长期连续种植同一种蔬菜作物，将导致连作土壤中有害微生物逐渐富集，土传病害频繁发生。目前，研究者将连作障碍归因于土壤微生物群落的变化^[2]。土壤微生物在土壤养分循环及土壤-作物生长体系中均发挥重要作用，土壤微生物总量、活性和有益微生物数量是评价土壤活性高低的重要指标^[3]。在健康的土壤生态系统中，有益微生物的种类和数量远大于有害微生物，而同一种作物长期连作导致土壤微生物和植物之间相互选择，使得某些特定微生物富集，病原菌数量增加，而有益细菌种类和数量减少^[4]。长期连作的土壤微生物特性主要表现为多样性下降；细菌数量下降、真菌数量上升；病原微生物数量上升、有益微生物数量下降等^[5]。

植物促生菌即PGPR是指自由生活在土壤、根际、根表以及叶际，在一定条件下有利于植物生长的细菌^[6]。相对于价格昂贵、高生产值、高环境风险的化学肥料来说，PGPR作为潜在的土壤微生物资源，对于发展可持续型及环境友好型农业有非常重要的意义。土壤假单胞菌（Pseudomonas spp.）及芽孢杆菌（Bacillus spp.）含众多植物促生菌（PGPR），是重要的土壤细菌。多种假单胞菌及芽孢杆菌接种到作物中可以促进作物生长^[7]、减少作物病虫害^[8]。而长期连作导致土壤假单胞菌多样性耗竭^[9]，芽孢杆菌数量减少^[5]。茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的番茄青枯病是设施番茄中最常见的土传细菌病害，国内外众多研究表明，设施番茄连作障碍与致病型茄科劳尔氏菌有关，芽孢杆菌及假单胞菌类PGPR对劳尔氏菌有很好的抑制效果^[10]。

目前针对芽孢杆菌及假单胞菌的研究可归结于两个方面：一方面验证某一或某些菌株的PGPR特性，以期得到能够在多种作物或土壤中发挥作用的菌种资源；另一方面则是研究PGPR类芽孢杆菌及假单胞菌在不同作物或土壤类型中发挥作用的机理。本研究则首次尝试将芽孢杆菌及假单胞菌当作一类土壤微生物，研究其在土壤微生物群落中发挥的作用及其与连作障碍的关系。因此，本研究选择山东寿光及禹城地区集约化蔬菜产区的不同连作年限设施番茄土壤（1~21年），对其中芽孢杆菌及假单胞菌的数量以及土壤微生物群落、土壤碳氮进行分析，探讨土壤中芽孢杆菌及假单胞菌随着连作年限的变化与土壤连作障碍之间的关系，以期为解决我国蔬菜连作障碍问题提供理论依据。

本研究以我国最大的蔬菜生产基地——山东省寿光市蔬菜生产基地以及位于山东省北部的禹城蔬菜生产区不同连作年限番茄大棚土壤为研究对象。寿光（118°32′~119°10′E，36°41′~37°19′N）有我国最大的设施蔬菜生产基地，其耕地面积的65%用于设施蔬菜生产^[15]。寿光处于中纬度带，属暖温带季风大陆性气候，年平均气温12.7 ℃，历年平均降水量593.8 mm。土壤类型、无霜期及其他信息见Ruan等^[8]。禹城地处山东西北部（116°22′~116°45′E，36°41′~37°12′N），同属暖温带季风大陆性气候，年均温度为13.1 ℃，年均降水量593.2 mm，其他信息包括土壤类型、无霜期等见Chen等^[11]。

样品采集于2012年11月，选择栽培措施和管理方法相近、不同连作年限的设施番茄大棚54个，在采样的同时调查施肥量及产量，如表 1所示。每个大棚取0~20 cm根层土壤，采用“之”字型取样，每棚取7钻，充分混匀，取新鲜土壤测定微生物生物量C、N。然后将土样分为两份，其中一份过0.5 mm孔径的筛子并放入4 ℃冰箱保存，供常规土壤理化指标测定，包括土壤pH、有机质、全氮、有效磷及速效钾等；另一份存于超低温冰箱中（温度-80 ℃），供测定土壤中细菌、芽孢杆菌、假单胞菌的数量和土壤微生物群落结构等微生物指标。

表 1 土壤样本量及相应氮磷钾施肥量调查 Table 1 Annual nitrogen，phosphorus，and potassium fertilizer inputs in soils of greenhouse tomato under continuous operation for a wide range of years in Shouguang（SG） and Yucheng（YC） Counties

表选项

土壤pH测定使用1∶2.5的土水比；土壤有机质（SOM）使用重铬酸钾氧化法^[12]；土壤全氮（TN）使用凯氏定氮法；土壤有效磷（AP）和速效钾（AK）分别用Olsen磷法和火焰分光光度计法（FP6410，上海仪电分析仪器有限分司）测定，参考中国农业出版社出版的《土壤农化分析》^[13]方法进行。

采用氯仿熏蒸浸提方法测定微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）^[14]。称取相当于20.0 g干土重的新鲜土壤放入培养皿中，将其置于真空干燥器中（底部含有少量NaOH和去乙醇氯仿），抽真空后保持氯仿沸腾 3~5 min，然后将干燥器转移到黑暗条件下于25 ℃熏蒸24 h，将熏蒸好的土壤全部转移到250 mL三角瓶中，加入约100 mL 0.5 mol·L^-1 K₂SO₄提取液（土水比为 1∶5），振荡 30 min 后过滤。溶液中的有机碳（TOC）和总氮用自动TOC分析仪（Vario TOC，Elementar lnc.）测定。同时，未熏蒸空白和试剂空白也用以上同样的方法处理，每份土壤重复3次。MBC和MBN采用Tian等^[15]的方法计算。

土壤DNA提取使用MOBIO土壤DNA提取试剂盒进行（MOBIO Laboratories，lnc. CA，USA）。提取出的DNA用微量紫外分光光度计（UV-2550，日本岛津）进行浓度及纯度检测。检测后的DNA存放于-20 ℃冰箱中以备qPCR（荧光定量PCR）及PCR-DGGE（变性浓度梯度凝胶电泳）分析使用。

本研究用qPCR方法定量土壤中的细菌、芽孢杆菌及假单胞菌。标准株分别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌，其中枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌来自中国微生物菌种保存中心（CGMCC）。将标准株接种于NA培养基（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏0.5 g，牛肉浸膏3 g，加水至1 L，调pH至7.0）上，于35 ℃培养箱中培养24 h进行活化。

用于定量土壤总细菌、芽孢杆菌及假单胞菌的特异性引物如表 2所示。引物的专一性对定量结果起决定性作用，因此试验前需验证所选择的引物专一性。方法如下：应用枯草芽孢杆菌的DNA及芽孢杆菌属的定量引物（Bac F及Bac R）进行PCR扩增反应，得到的PCR产物为500 bp，而以水为对照或以荧光假单胞菌的DNA与芽孢杆菌属的定量引物反应，在500 bp处无扩增产物，证明芽孢杆菌的引物是专一性的。用同样的方法测定土壤细菌及假单胞菌的引物也为专一性引物，可以在qPCR反应中用于定量土壤中的细菌和假单胞菌。

表 2 实时荧光定量土壤总细菌、芽孢杆菌及假单胞菌的引物 Table 2 Primers for total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp.

表选项

土壤细菌、芽孢杆菌、假单胞菌采用Invitrogen 公司的实时荧光PCR试剂盒SYBR Green qRT-PCR kit with ROX在ABI7500^TM进行实时荧光定量PCR检测。将经过浓度和纯度检测的阳性质粒依次稀释，1.0×100~1.0×10^-7，每个梯度3次重复，最后选取扩增效率高的5~6个梯度用于标准曲线的绘制。阴性对照以无菌超纯水代替。每个样品重复3次。各反应的退火温度及扩增产物片段见表 2。

选择寿光地区栽培模式、管理方法相近的不同连作年限番茄土壤进行PCR-DGGE分析。PCR扩增引物是16S rDNA的V3区通用引物，分别是338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和534R 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG G （ATTACCGCGGCT GCTGG）-3′^[19]。PCR反应条件：94 ℃ 10 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1.5 min（每个循环降低0.1 ℃），72 ℃延伸1.5 min此过程进行30个循环；最终72 ℃延伸10 min。

DGGE电泳条件：采用的胶浓度为8%，变性范围为30%~60%，电泳条件为150 V、 420 min。在含0.5 μg·mL^-1 EB的1×TAE缓冲液中染色15 min，取出后用凝胶成像系统（Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA）进行拍照。测序时将回收的产物片段重新扩增，引物及循环反应条件与PCR反应的引物序列及反应条件相同，产物用PCR产物纯化试剂盒纯化（天根生物科技有限公司，中国）。测序过程由宝杰罗生物科技有限公司（北京）完成。

本研究根据文献资料中连作障碍发生的时间进行归纳（下文表 5），将不同连作年限的土壤按照连作番茄的年限划分为4个范围：≤3年（CCY3，新建大棚），4~5年（CCY5，开始出现连作障碍的时间），6~10年（CCY10，连作障碍集中发生的时间），>10年（CCY10+，老龄棚，包括连作11~21年的土壤）。土壤理化性质、肥料用量以及产量均以平均值±标准差（sd）的形式表示。不同处理间的差异显著性检验采用单因素ANOVA，LSD检验，P＜0.05为差异显著。在指数模型、线性模型、二次方程式模型、对数模型及多项式模型等趋势线模型中，通过比较R²以及P值选择最为合适的趋势线模型。不同变量之间的相关性通过Spearman（2-tailed）分析得出。

所有数据分析均通过SPSS12.0完成，在数据处理过程中剔除部分异常值（例如MBN测定值为负数的2个样品）。为了研究土壤中细菌、芽孢杆菌及假单胞菌数量的变化规律，qPCR测定土壤DNA样品时，将检测不到数值或个别严重偏离整体平均值的样品剔除。

不同连作年限番茄土壤的pH、有机质、全氮、碳氮比、有效磷及速效钾如表 3所示。土壤pH随连作年限呈下降趋势，但差异并不显著。土壤有机质随连作年限呈上升趋势，CCY5与CCY3相比，有机质的变化差异并不显著，而CCY10、CCY10+与CCY3及CCY5相比显著增加了土壤有机质的含量，分别比CCY3增加了16%、36%。CCY10+土壤中全氮显著高于其他连作年限，比CCY3 增加22%。CCY10+土壤中C/N相比CCY3增加了10%。土壤有效磷及速效钾在不同连作年限土壤中的变化无显著性差异。

表 3 不同连作年限设施番茄土壤理化性质 Table 3 Chemical properties of soils in tomato continuous cropping in greenhouses for a wide range of years

表选项

不同土壤化学性质与连作年限间（1~21年）的相关关系分析表明，土壤有机质及C/N与土壤连作年限呈显著相关（P＜0.01），但其他土壤养分含量与土壤连作年限之间无显著相关关系。

不同连作年限土壤样品的微生物生物量碳、氮的变化如图 1所示。微生物生物量碳氮随不同连作年限表现出相似的变化规律，在连作初期即0~3年内，微生物生物量碳、氮均较低，在连作4~10年期间均处于快速增长的阶段，而连作10年以上则增长趋于平缓。土壤MBN值介于20.9~93.8 mg·kg^-1之间（平均值为57.3 mg·kg^-1），MBC值介于87.9~263.1 mg·kg^-1之间（平均值为178.7 mg·kg^-1）。土壤微生物生物量碳、氮与连作年限之间符合对数模型：MBN与连作年限R²=0.30，n=52（其中2个样品的测定值为负数，判断为异常值，已舍去），P＜0.001；MBC 与连作年限R²=0.20，n=54，P＜0.001。CCY10+土壤中MBN含量比CCY3土壤增加21.6 mg·kg^-1（50.2%），MBC含量比CCY3土壤增加37.2 mg·kg^-1（22.8%）。

图 1 不同连作年限土壤微生物生物量碳、氮含量 Figure 1 Soil microbial biomass-C and N over years of tomato continuous cropping in greenhouse

图选项

由标准菌株及本研究所选择的定量引物得到标准曲线循环数（C_t）与各反应体系测定的基因拷贝数（Copy number）均有很好的线性关系（土壤细菌、芽孢杆菌及假单胞菌的R²分别是0.996、0.992及0.999），标准曲线如图 2所示。土壤细菌总量随着番茄连作年限的增加而下降（图 3），符合对数模型（R²＝0.18，n=42，P=0.02），细菌数量从CCY3土壤中的6.9×106个下降为CCY10+土壤中的4.9×10⁶个（下降29.3%）。连作年限小于6年时，芽孢杆菌、假单胞菌数量随着连作年限不断增加；连作年限大于10年时，随着连作年限的增加而减少；总体呈现先增加后降低的趋势（图 3）。整体变化趋势符合多项式模型：芽孢杆菌为R²=0.12，n=44，P=0.08；假单胞菌为R²=0.20，n=42，P=0.07。

图 2 定量土壤细菌、芽孢杆菌和假单胞菌的标准曲线 Figure 2 Standard curves for total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp.

图选项

图 3 土壤细菌、芽孢杆菌和假单胞菌的数量随种植年限的变化趋势 Figure 3 Soil total bacteria，Bacillus spp. and Pseudomonas spp. copy number changed with years of tomato continuous cropping

图选项

不同连作年限番茄土壤化学性质与微生物性质之间的相关性如表 4所示。土壤有机质与全氮、C/N之间表现为极显著正相关（P＜0.01），与P₂O₅及土壤假单胞菌数量呈显著正相关（P＜0.05），与土壤pH呈极显著负相关（P＜0.01）。TN与土壤pH呈极显著负相关（P＜0.01），但与土壤P₂O₅、K₂O及芽孢杆菌数量呈极显著正相关（P＜0.01）。土壤细菌数量与C/N 及芽孢杆菌数量呈极显著正相关（P＜0.01）；芽孢杆菌数量与假单胞菌数量呈极显著正相关（P＜0.01）。

表 4 不同连作年限番茄土壤性质之间的相关性分析 Table 4 Spearman correlation coefficients between chemical properties and microbial properties of soils with different continuous cropping years

表选项

不同连作年限番茄土壤的微生物群落结构如图 4所示。连作4年的土壤获得条带数最多（20条），连作11年土壤条带数最少（12条）。不同连作年限土壤的DGGE图谱中存在特异性条带，如：条带Ⅰ（假单胞菌）和条带Ⅱ（海洋沉积细菌）仅存在于连作4年的土壤中；条带Ⅲ（芽孢杆菌）仅存在于连作7年的土壤中；条带Ⅳ（不可培养的微杆菌）仅存在于连作13年的土壤中。除以上所述的一些特异性菌群外，还有一些菌群并非单一存在于某一特定土壤，但是其在不同土壤中条带亮度有所不同，如条带Ⅴ（Nealsonii芽孢杆菌）和条带Ⅵ（假单胞菌）虽然同时存在于各个连作年限的土壤中，但是在连作4年和5年的土壤中其条带亮度大于其他连作年限土壤，说明在连作4年和5年的土壤中，芽孢杆菌和假单胞菌的种群数量大于其他连作年限土壤。

图谱上方的阿拉伯数字分别代表土壤的连作年限；条带Ⅰ是Pseudomonas sp.（KF202811.1，98%）；条带Ⅱ是Marine sediment bacterium（JF750119.1，98%）；条带Ⅲ是Bacillus sp.（KF312884.1，99%）；条带Ⅳ是不可培养的Microbacterium sp.（JQ071659.1，98%）；条带Ⅴ是Bacillusnealsonii（KF535131.1，100%）；条带Ⅵ是Pseudomonas sp.（KC834328.1，99%） 图 4 不同连作年限设施番茄土壤DGGE图谱 Figure 4 DGGE patterns under different continuous tomato cropping years

图选项

表 5列出了几种常见作物连作年限与土壤微生物性质及作物产量的关系。土壤微生物方面的障碍主要表现为微生物多样性下降、微生物生物量减少、功能群落减少、有益微生物减少、土传病害增加等。土壤出现连作障碍的时间多数集中于4~10年之间。作物方面的连作障碍主要表现为产量下降，时间集中于连作4~7年。

表 5 几种常见作物连作年限对土壤性质及产量的影响 Table 5 Soil properties and yield responses to continuous cropping years for several commonly continuously-cultured crops

表选项

长期连续种植设施番茄对土壤化学性质有显著影响。Guo等^[38]指出在集约化农业生产中，尤其是长期连作设施蔬菜生产中，大量投入N肥（表 1）及氮肥利用效率低下会导致土壤发生酸化。在本研究中，土壤pH随连作年限的增加呈下降趋势，由CCY3土壤中的8.02下降为CCY10+土壤中的7.88。设施番茄最适宜生长的pH为7.0左右，从本研究来看，由于土壤本身为盐碱性土壤，长期连作虽然导致土壤酸化，但pH的下降使得土壤酸碱性更适宜番茄生长。

长期连作设施番茄导致土壤SOM及TN增加（表 3）。为了培肥土壤、确保高产，农户每年都会将一定量的有机肥（如牛粪、鸡粪等）投入设施番茄土壤中，这部分有机肥成为增加土壤有机质及总氮的主要来源。任涛^[39]总结14个相关研究结果表明，SOC在连作前10年范围内表现为增加趋势，连作10年后表现为下降趋势。Yang等^[40]总结100多个相关研究结果表明，土壤N库与土壤C库为线性相关关系，且SOC的增加会导致TN的增加。同样的，在本研究中，SOM与TN也呈线性相关关系（TN=13.798SOM+1.454，R²= 0.697 4，n=54）。土壤TN与土壤pH呈显著负相关，也与其他研究结果一致^[8]，表明N肥的过量使用导致土壤pH值下降^[38]。也有SOC及TN随着连作年限变化呈现相反变化趋势的研究结果，Naranjo等^[41]研究表明SOC及TN随着甘蔗连作年限（5~30年）的增加而降低，但SOC及TN的降低并未导致甘蔗产量下降，而是增加67%。将本研究中选取的连作番茄土壤肥料投入量与该甘蔗试验的肥料投入量相比，发现设施番茄的肥料投入量远大于甘蔗肥料的投入量，因此SOM及TN的变化趋势不同是合理的。

土壤微生物生物量与土壤团聚体、土壤养分循环以及土壤有机质都有重要关系，因此它是表征土壤生态系统功能的重要指标^[42]，也是评价土壤质量的必要指标之一。研究表明，对土壤MBC及MBN影响最主要的因素是有机肥的调控而非其他养分或环境因子^{[42, 43]}。本研究结果表明，MBC与MBN随着连作年限的增加而增加，符合对数增长模型（图 1）。土壤有机碳含量是影响土壤微生物生物量的关键因素^[43]，土壤有机碳含量越高，则土壤微生物生物量越高。本研究中土壤有机质随着连作年限的增长而增加，MBC与MBN也表现为随连作年限的增长而增加。

在本研究中，虽然土壤MBC及MBN随着连作年限而增加，但连作设施番茄土壤MBC 及MBN的平均值远低于草地土壤的微生物生物量（781±253 mg·kg^-1，Trasar-Cepeda等^[44]），也低于普通农田土壤微生物生物量（351±21 mg·kg^-1，Cynthia等^[42]）。农田扰动是造成这一现象的原因之一，例如不断地施用化肥、灌溉等，影响了土壤微生物生物量的恢复，使得土壤微生物群落处于持续的扰动-恢复状态。除此以外，近期也有相关研究表明化学肥料的投入对土壤微生物生物量有抑制作用。设施番茄生产过程中，农户习惯性投入过量的肥料可能对土壤微生物群落产生不利的影响（表 1）。

通过对已发表的连作年限相关的文献进行总结，得出连作障碍通常出现在连作5~10年间（表 5），包括产生土壤盐渍化、土壤微生物多样性下降，土壤真菌及病菌数量增加、作物产量下降等。本研究选择寿光地区栽培措施、管理方法相似、连作年限不同的设施番茄土壤，采用qPCR 及DGGE 两种方法研究土壤中两种重要土壤细菌——芽孢杆菌和假单胞菌及微生物群落随连作年限的变化规律。结果表明，土壤芽孢杆菌、假单胞菌及土壤微生物优势种群均在连作6~10年间表现出下降趋势（图 3和图 4），与生产中连作障碍出现的时间基本吻合。

未受干扰的自然土壤中，有益微生物和有害微生物通常处于平衡状态，有利于作物生长；相反，现代集约化农业栽培体系中，连续单一种植后，土壤微生物的平衡状态被打破，有益微生物减少，有害微生物增加，不利于作物生长。就目前已有的研究来看，大多数已发现的PGPR细菌属于芽孢杆菌属和假单胞菌属^[45]，这两个菌属中的多种菌株都具有抑制土传病害和促进作物生长的功能^[7]，例如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。但并非所有的芽孢杆菌及假单胞菌都是PGPR细菌，因此并没有明确的证据表明土壤芽孢杆菌及假单胞菌的含量可以用来作为土壤微生物指标，指示土壤性质。但本研究发现土壤芽孢杆菌及假单胞菌连作6~10年开始下降，与连作障碍发生的时间基本一致。因此，我们可以推断，土壤中芽孢杆菌和假单胞菌作为包含大量植物促生菌的优势细菌种群，它们的存在对维持良好的土壤微生态环境有一定的作用。

土壤细菌数量随连作年限的增加表现为逐渐下降趋势（图 3）。近期有很多研究表明，土壤肥力、有机物质、植被类型、土壤pH等都对土壤细菌丰度及群落结构有重要影响^{[44, 46]}，Wu等^[47]采用qPCR的方法研究水稻长期施肥试验中土壤细菌的变化，结果表明在养分含量较高的土壤中细菌数量较高。Wessén等^[48]也得出相似的研究结果，即长期施用硝酸钙及硫酸铵的土壤具有较高的细菌数量。因此，施用化肥有助于增加土壤细菌含量。在本研究中，采集样品的两个区域农户的施肥方式和数量相似，均为频繁施用过量化学肥料（表 1），我们推断施肥不是导致土壤细菌数量下降的直接原因。Shen等^[46]的研究表明，土壤细菌的16S rRNA基因拷贝数与土壤pH呈显著正相关。根据这一结果，本研究中因施肥导致的 pH随连作年限不断下降可能是导致土壤细菌数量下降的直接原因。

DGGE图谱（图 4）表明土壤细菌优势菌群在连作4~5年后开始下降，也与文献中连作障碍出现的时间一致。对DGGE图谱的测序结果表明，连作4年和5年土壤中的条带Ⅰ和Ⅵ为假单胞菌，连作7年和4年土壤中的条带Ⅲ和Ⅴ为芽孢杆菌。根据这些条带的亮度来看，DGGE对两种细菌的定性研究结果与qPCR的研究结果一致。此外，DGGE对设施番茄土壤微生物群落结构的变化分析也与近期连作黄瓜的研究结果一致。土壤微生物群落变化带来微生物群落功能变化，进而影响作物生长^[46]。

土壤细菌随着连作年限的增加而逐渐减少，可能与土壤pH降低有关；当连作年限少于6~10年时，芽孢杆菌和假单胞菌的数量表现为增加趋势，连作6~10年后逐渐减少；DGGE图谱及测序结果定性地反映了作为土壤优势菌群的芽孢杆菌和假单胞菌在连作4~5年后种群密度降低，均与连作障碍发生的时间基本吻合。因此，作为土壤中的优势细菌及PGPR的重要组成，芽孢杆菌及假单胞菌的数量变化可能与导致连作障碍的土壤微生物群落变化有关。在未来的研究中，应用多种研究手段在不同作物体系中分析芽孢杆菌及假单胞菌与连作障碍的关系，将对研究连作障碍的机理及调控有重要意义。