全球对生物炭（Biochar）科学研究的重视源于对亚马逊地区原始农业所形成的特殊黑土“Terra Preta”的研究^[1]，这类黑土由于富含黑碳而保持了较高的土壤肥力。近年来，随着土壤重金属污染的日趋严重，利用生物炭降低重金属污染方面的研究成为热点。国内外科学家们围绕生物炭添加入土壤后，可以改善土壤理化性质及生物群落，主要在土壤容重^[2]、孔隙度^[3]、pH值^[4]和阳离子交换量^[5]，土壤养分^[6]，土壤中污染物的稳定性^[7]及其迁移行为^[8]，土壤中微生物群落^[9]等方面开展了大量的工作。研究表明，生物炭可以通过表面静电吸附、阳离子交换、吸附-沉淀等作用机制^{[10, 11]}对土壤重金属进行吸附，从而降低土壤重金属活性。目前生产生物炭的原料主要有秸秆^[12]、畜禽粪便^[13]、谷物废弃物^[14]等，不同原料制成的生物炭对重金属的作用效果也不尽相同^[15]。研究报道，水稻秸秆生物炭可使酸溶态的Cu（Ⅱ）和Pb（Ⅱ）分别降低19.7%和18.8%，而使酸溶态的Cd（Ⅱ）降低了5.6%^[16]。鸡粪或木质生物炭可降低Cd和Pb的生物有效性，但增加了土壤Cu和Zn的生物有效性^[17]。花生壳生物炭对红壤Cu污染是否具有修复效果目前还未见报道。

油菜是江西冬季农业大力推广的种植作物，是江西省最重要的油料作物，据江西省统计年鉴数据，2013年江西省油菜种植面积达54.8万hm^2[18]。已有研究表明江西省由于采矿或工业区污水灌溉导致局部较大面积的农田土壤铜污染^[19]，同时大量生猪粪便作为有机肥施用到农田中造成短时间土壤铜元素的累积，江西报道的耕地铜元素超标量达国家Ⅱ级土壤标准10倍以上，最高达548.30 mg·kg^{-1 [20]}。土壤铜含量过高会抑制油菜生长^[21]，利用生物炭是否可以降低土壤铜对油菜的负面影响？重金属污染对作物的影响首先体现在保护性酶活性方面，在一定的重金属浓度范围内，植物的抗氧化酶活性出现激活效应，即随着重金属胁迫浓度的升高而提高，但超出一定阈值后，抗氧化酶活性则迅速下降^[22]。本文以油菜为研究对象，施用花生壳为基质的生物炭来探讨铜污染胁迫下油菜苗期的生理生化特征，以期为南方铜污染红壤地冬季油菜种植提供一定的参考依据。

供试植物：油菜（Brassica campestris L.）品种为LX1，来自江西农业大学农学院。

供试土壤：土壤采自江西农业大学农业科技园红壤试验地表层（0~20 cm）红壤，土壤使用前先于室内自然风干，剔除植物根系后，过2 mm筛后备用。试验土壤基本理化性状为：pH 3.96，有机碳含量18.18 g·kg^-1，全氮1.74 g·kg^-1，碱解氮121.33 mg·kg^-1，全磷0.69 g·kg^-1，有效磷31.68 mg·kg^-1，全钾5.02 g·kg^-1，速效钾163.67 mg·kg^-1，全铜为33.52 mg·kg^-1，有效态铜为2.31 mg·kg^-1（DTPA提取，原子吸收分光光度计测定）。根据国家Ⅱ级土壤标准（Cu 50 mg·kg^-1），供试土壤均未受到铜污染。

供试生物炭：生物炭购自河南商丘三利新能源有限公司，原料是花生壳，经350~500 ℃热裂解炭化而成，室内测定其基本理化性质为：pH 9.16，有机碳含量323.76 g·kg^-1，全氮10.52 g·kg^-1，全磷44.73 g·kg^-1，全钾15.51 g·kg^-1。

按照试验设计，添加2%（98%供试土壤+2%生物炭）和5%（95%供试土壤+5%生物炭）比例生物炭与土壤充分混合均匀后的理化性质如表 1所示。

表 1 供试材料理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of soil-biocher mixture used

表选项

试验于2014年11月8日—2015年1月7日进行。采用双因素随机区组设计，设置三个生物炭比例，分别为C0（0%）、C2（2%）、C5（5%），根据食用农产品产地环境质量评价标准（HJ/T 332—2006），食用作物产地铜浓度限值为200 mg·kg^-1，本试验设置外源添加300 mg·kg^-1作为铜污染处理（Cu300），不添加外源铜为对照处理（Cu0），铜浓度均以总铜含量计，共6个处理（表 2）。铜污染处理组利用分析纯硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）配制成溶液后浇入供试土壤中，充分搅拌混匀，平衡两周后使用。盆栽用长60 cm、宽40 cm、高30 cm的泡沫箱为容器，底部钻孔以透水，每盆装土10 kg。每处理重复3次，共18盆。于2014年11月8日播种，每盆播30粒种子，于2014年12月8日第一次取样并间苗，每盆定植6株。于2015年1月7日进行第二次取样。取样后以离子水将油菜叶片洗净，去除叶脉后立即测定其中叶绿素含量、抗氧化酶活性、丙二醛和可溶性蛋白含量。

表 2 盆栽试验设计 Table 2 Design for pot experiment

表选项

超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）采用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性采用紫外吸收法测定，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定，叶绿素含量利用丙酮-乙醇（V1:V2=80%:20%）混合液提取，分光光度法测定^[23]。

用Excel 2010进行数据整理，用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，利用Origin9.0绘图。

从表 3可以看出，无论有无铜污染胁迫，30 d和60 d的油菜叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均随着生物炭的添加呈上升趋势，且无铜污染处理下3个处理叶绿素a、b和总叶绿素含量均显著高于铜污染处理下3个处理。播种后30 d，无铜污染条件下，添加5%生物炭处理油菜叶绿素b和总叶绿素含量较其余两个处理分别显著提高了68.8%和35.0%，22.7%和14.1%，而叶绿素a含量则无显著变化。铜污染条件下，添加5%生物炭处理油菜叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均较其余两处理有所提高，但差异均不显著。播种后60 d，无铜污染处理下，添加5%生物炭较其余两个处理均显著提高了油菜叶片叶绿素a、b和总叶绿素含量，增幅分别为19.8%、16.9%和82.8%，55.9%、41.3%和31.4%。铜污染处理下，3个生物炭处理的叶绿素a和叶绿素b含量均无显著差异，而从总叶绿素含量来看，添加5%生物炭处理较0%生物炭处理总叶绿素含量显著提高了41.0%。

表 3 油菜叶片叶绿素含量 Table 3 Chlorophyll content in leaves of rape seedling

表选项

从图 1可以看出，两次取样铜污染处理油菜叶片中超氧化物歧化酶均高于无铜污染处理，且30 d时铜污染处理下各生物炭处理超氧化物歧化酶活性均显著高于无铜污染处理。播种后30 d，无铜污染处理下，添加2%和5%生物炭处理分别较0%生物炭处理油菜叶片超氧化物歧化酶活性显著降低了10.2%和10.4%；铜污染处理下，添加2%和5%生物炭处理分别较0%生物炭处理显著降低了6.8%和7.2%。播种60 d后，无铜污染处理下各生物炭处理超氧化物歧化酶活性随着生物炭添加量的增多而呈上升趋势，但处理间差异不显著。铜污染处理下，则随着生物炭添加量的增多而超氧化物歧化酶活性呈显著下降，添加2%和5%生物炭处理较0%生物炭处理超氧化物歧化酶活性分别显著降低了10.6%和11.4%。

图中不同小写字母表示同一时期不同处理下差异显著（P < 0.05），下同Different small letters indicate a significant difference（P < 0.05）between various treatments within a period. The same below图 1 油菜叶片超氧化物歧化酶活性 Figure 1 Activity of SOD in leaves of rape seedlings

图选项

从图 2可以看出，两次取样中，铜污染处理油菜叶片的过氧化物酶活性均高于无铜污染处理，但播种后30 d时，铜污染处理下各处理过氧化物酶活性均较无铜污染处理显著提高。播种后60 d时，铜污染处理下0%生物炭和添加2%生物炭较相对应的无铜污染油菜叶片过氧化物酶活性显著提高。无铜污染处理下，随着生物炭添加量的增加，叶片过氧化物酶活性呈现下降趋势，但两次取样各处理间差异均不显著。铜污染处理下，播种后30 d时，随着生物炭添加量的增加，叶片过氧化物酶活性呈上升趋势，但处理间差异不显著；播种后60 d时，油菜叶片过氧化物酶活性随着生物炭添加量的增加而显著下降，添加5%生物炭处理较其余两处理过氧化物酶活性显著降低了49.0%和29.5%，而添加2%生物炭亦较0%生物炭处理下的过氧化物酶活性显著降低了23.3%。

图 2 油菜叶片过氧化物酶活性 Figure 2 Activity of POD in leaves of rape seedlings

图选项

从图 3可以看出，两次取样中，铜污染处理油菜叶片中过氧化物酶均高于无铜污染处理，其中油菜叶片过氧化氢酶活性在铜污染处理下的0%和2%生物炭处理均显著高于相对应的无铜污染处理。无铜污染处理下，随着生物炭添加量的增加，叶片过氧化氢酶活性均呈现上升趋势。播种后30 d时，添加2%和5%生物炭处理较0%生物炭叶片过氧化氢酶活性显著提高了20.7%和32.5%。播种后60 d时，仅添加5%生物炭处理较0%生物炭处理叶片过氧化氢酶活性显著提高了39.9%。铜污染处理下，随着生物炭添加量的增加，叶片过氧化物酶活性均呈现下降趋势，其中播种后30 d时，添加5%生物炭处理叶片过氧化氢酶活性较0%生物炭处理显著降低了13.3%。播种后60 d时，添加5%生物炭处理较0%和2%生物炭处理叶片过氧化氢酶活性分别显著降低了27.6%和20.0%。

图 3 油菜叶片过氧化氢酶活性 Figure 3 Activity of CAT in leaves of rape seedlings

图选项

从图 4可以看出，播种后30 d时，铜污染处理叶片丙二醛含量均高于无铜污染处理；无铜污染处理下，播种后30 d时，随着生物炭添加量的增多，叶片丙二醛含量呈下降趋势，但各处理间无显著差异。播种后60 d时，5%生物炭较2%生物炭处理叶片丙二醛含量显著降低了34.55%。铜污染处理下，随着生物炭添加量增加，叶片丙二醛含量均呈下降趋势。其中播种后30 d时，添加2%和5%生物炭较0%生物炭处理的丙二醛含量显著降低了23.6%和31.5%。播种后60 d时，各处理间丙二醛含量均无显著差异。

图 4 油菜叶片丙二醛含量 Figure 4 Content of MDA in leaves of rape seedlings

图选项

从图 5可以看出，两次取样中，铜污染处理下叶片可溶性蛋白含量均显著高于无铜污染处理。无污染处理下，播种后30 d时，各处理间叶片可溶性蛋白含量均无显著差异。播种后60 d时，2%和5%生物炭处理较0%生物炭处理叶片可溶性蛋白含量显著降低了10.9%和11.5%。铜污染处理下，随着生物炭添加量的增加，叶片可溶性蛋白含量均呈下降趋势。其中播种后30 d时，添加2%和5%生物炭较0%生物炭处理丙二醛含量显著降低了11.7%和51.8%。播种后60 d时，5%生物炭较0%生物炭处理叶片可溶性蛋白含量显著降低了17.8%。

图 5 油菜叶片可溶性蛋白含量 Figure 5 Soluble protein content in leaves of rape seedlings

图选项

铜是作物必需元素，但超量会对作物吸收矿质离子，抗氧化酶和生物膜透性产生影响，尤其是对相关蛋白质的合成、叶绿素等具有较大影响。从本研究的结果（表 3）可以看出，叶绿素含量随着生物炭添加量的增加，无论是否受到铜污染，油菜叶绿素a、b和总叶绿素含量均呈上升趋势。在无铜污染条件下，叶绿素随着生物炭添加量的增加呈现上升趋势，且叶绿素b和总叶绿素含量均在添加5%生物炭时显著提高。这可能是供试生物炭由花生壳炭化形成，其中含有大量营养元素，添加到土壤后，能够为油菜生长提供更多的氮、磷、钾等大量营养元素^[24]及钙、镁等微量元素，促进了油菜的生长，提高了油菜的叶绿素含量，其中镁元素是合成叶绿素的重要组分^[25]，促进了叶绿素b的合成。同时由于不同生物炭配比造成了土壤营养的差异，从而导致了油菜叶绿素含量随着生物炭添加量增多而呈递增的趋势。同时由于生物炭的碱性强，加入土壤后能中和土壤酸性，从而提高土壤pH值（表 1），使得铜离子发生钝化^[15]，同时生物炭表面所带的电荷及官能团^[26]对土壤中的铜离子具有较强的吸附能力，而使土壤中的铜产生钝化^[11]，且随着添加量的增多效果增强，因而降低铜离子对油菜造成的影响。

作物在受到重金属胁迫时，其自身为应对环境因子的胁迫，生理生化特征均会产生一定的应对机制，其中以抗氧化酶系统的变化特征最为显著。相同生物炭添加量下，无铜污染胁迫下油菜叶片的抗氧化酶活性均低于同一时期的铜污染胁迫，可能是由于受到铜胁迫时，细胞内的自由基含量增多，使得油菜发生质膜损伤，为了缓解质膜损伤，细胞内的抗氧化酶活性增强，用以分解产生的自由基等氧化物质。由此说明油菜可能通过提高自身抗氧化酶活性来适应铜胁迫^[27]。

在本研究中，土壤铜污染胁迫时，油菜叶片超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和可溶性蛋白含量均随着生物炭添加量的增多而呈下降趋势，且不同的取样时间均保持相似的趋势。可能是由于生物炭添加后提高了土壤pH，大幅增加了土壤中氮磷钾等营养元素含量。前人研究发现土壤pH值是影响植物对重金属离子吸收的最主要因素^[28]，随着pH值上升，重金属氢氧化物、硫化物、磷酸盐和碳酸盐的沉淀反应所起的作用逐渐增大，使得土壤有机质和土壤胶体对重金属的吸附增强，从而使得土壤中铜被钝化^[29]，降低了其生物有效性^[30]。由于铜元素的生物有效性降低，油菜从根系吸收的铜离子可能相应地减少，从而可减缓铜离子对油菜叶片质膜的损伤，减少叶片中超氧自由基的含量。由于植物的超氧化酶系统的反馈作用，使得超氧化物歧化酶活性降低，进而减少过氧化氢的产生，进一步导致了过氧化氢酶活性降低^[31]。随着生物炭添加量的增多，叶片中质膜损伤减缓，因而质膜损伤产物丙二醛含量呈下降趋势。由于进入油菜叶片中的铜离子可能减少，且添加生物炭后大幅增加了土壤中的营养元素含量，为油菜生长提供了较为充足的营养供给，而前人研究表明增施氮肥能缓解重金属对植物的毒害作用^[32]，因此铜离子诱导其产生铜结合蛋白的数量可能减少，故铜污染土壤中可溶性蛋白含量随着生物炭的增加，亦呈下降趋势（图 5）。

（1）铜胁迫降低了油菜叶片的叶绿素a、b及总叶绿素含量，添加生物炭有利于提高油菜叶片叶绿素a、b及总叶绿素含量。

（2）铜胁迫提高了油菜叶片抗氧化酶活性、丙二醛及可溶性蛋白含量，添加生物炭降低了油菜叶片超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、丙二醛和可溶性蛋白含量，从而有利于保护铜胁迫下油菜的正常生长。