三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）是五加科人参属多年生名贵草本中药材，是我国的特有种，其根、茎和花等部位具有显著的活血化淤、消肿止痛功效，主要用于冠心病、心绞痛等心脑血管系统疾病的治疗^{[1, 2]}，并在中医药研究中占有重要的位置。文山州已有400多年的栽培历史^{[3, 4, 5]}，是公认的三七“道地产区”，位于云南省东南部，东经103°35′~106°12′，北纬22°40′~24°48′之间，具有低纬、高海拔的气候，年平均气温12.0～23.1 ℃（≥10 ℃），积温4500～7500 ℃；土壤以红壤、棕红壤类型为主，pH5～6呈弱酸性，养分含量不高，土壤有效磷含量极少。三七种植要求土壤疏松、排水良好，喜冬暖夏凉的环境，畏严寒酷热；喜潮湿但怕积水，土壤含水量要求保持22%~40%，现多栽培于海拔800～1000 m的山脚斜坡或土丘缓坡上。这里气候、土壤条件有利于三七的生长、皂苷含量及其他有效成分的积累，因此形成了文山三七产量高、品质好的特点。

云南省被誉为“有色金属王国”，已发现各类矿产150多种，其中25种矿产储量位居全国前三名，54种矿产储量居前十位。随着各类矿业的大规模开采，土壤母质中的金属元素得到释放，加上农业耕种中大量施用化肥农药，改变了土壤pH、有机质含量降低及不合理的耕作方式，使土壤存在普遍的砷污染^{[6, 7, 8, 9]}。调查中三七种植地66.7%的土壤砷超过国家土壤健康质量标准，60%的土壤镉超标，33.3%的铬超标^[10]。三七主根、须根、茎、叶、花（或果实）砷超标率分别为24%、81%、14%、57%和44%，其中须根、主根和剪口的砷含量较高^{[11, 12]}。闫秀兰等^[12]对三七中砷的累积特征和健康风险进行了评价，认为云南文山三七种植区砷污染及其导致的药物砷超标现状已不容忽视。

磷和砷同属第V族元素，在自然界中往往是共生，形成相似的磷酸盐（PO₄^3-）和砷酸盐（AsO₄^3-）。两者在土壤中存在竞争吸附关系^[13]，在植物中主要表现为拮抗和协同效应^[14]。砷超富集植物蜈蚣草在高磷或高砷条件下会表现出协同作用，即磷肥的添加提高了蜈蚣草对砷的吸收^{[15, 16]}。三七不属于重金属富集植物^[10]，其适宜生长的土壤中有效磷的背景值含量较低，磷素的施用在三七生长过程中是否可以抑制砷的毒害效应尚不清楚。因此，本研究通过外源磷素的施入试验，利用同步辐射X射线荧光分析（μ-SRXRF）技术进行植物样品中的砷元素微区分布扫描，以差速离心法分离三七各部位亚细胞组分中的砷并进行分析测定，深入研究外源磷素对三七吸附砷的微区和亚细胞组分分布特征，为降低三七的砷含量和提高三七品质提供理论基础和参考依据。

选取试验基地生长环境良好，株高18～20 cm、茎粗0.5～0.8 cm、叶片宽约1.5 cm长约3 cm，且植株健壮的一年生三七进行水培试验。设置高砷（As50 mg·L^-1）和高砷添加外源磷素（As50 mg·L^-1+P100 mg·L^-1）两组试验处理，添加的五价砷化合物为Na₂HAsO₄·12H₂O。水培试验采用“完全营养液”配方^[17]，并结合三七生长特性进行了适当调整，配置营养液的试剂均为分析纯，各处理3次重复。放置于遮阴避光、透光率8%~12%、温湿度适宜、通风条件较好的环境中，为保证三七根系在营养液中正常呼吸，每3 d更新营养液1次。在加砷处理前5 d进行预培养，在第3 d更新营养液一次，第5 d更换为试验处理营养液，试验进行3 d后取样。

选取新鲜三七幼苗的主根、茎（地上3~5 cm处）和叶片中部，选用进口包埋剂OCT（Optimum cutting temperature compound）包埋后，在LEICA CM1950冷冻切片机-20 ℃下制片^[18]，切片厚度为10 μm。将冷冻切片黏附于迈拉膜固定在样品框上，-80 ℃冷冻干燥后用于μ-SRXRF扫描。μ-SRXRF分析在北京正负电子对撞机同步辐射实验室（BSRF）4W1B应用微束光束线站进行。试验条件：储存环电子能量为2.5 GeV，束流强度为150～200 mA，调节水平和垂直两个狭缝，使入射光斑大小为20 μm×20 μm，探测器为Si（Li）固体探测器及能谱仪系列。样品与入射光线成45°，扫描步长为200 μm，每个扫描点的时长为60 s^[19]。

培养5 d后，分别剪取生长良好植株的根、茎和叶组织各2.00 g用于亚细胞组分分级实验。参照Weigel等^[20]及Pathore等^[21]建立的亚细胞分级方法，将预冷的匀浆液在玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液组成：0.25 mmol·L^-1蔗糖、50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH7.8）和1 mmol·L^-1赤藓糖醇，匀浆液pH7.8。匀浆和分离过程温度均控制在4 ℃，具体步骤如下：将15~20 mL的匀浆液及组织放入50 mL离心管，组织匀浆液在高速冷冻离心机中于225×g离心10 min，下部沉淀中底层碎片为细胞壁（F1）组分；上清液在18 450×g离心90 min，底层碎片为细胞质（Cytoplasmic organelles）（F2）组分，主要指各种细胞器的膜结构；上层清液为细胞液（Cytoplasmic supernatant）（F3）组分，包括细胞质及液泡内大分子有机物及无机离子^[22]。将亚细胞组分F1、F2和F3转入陶瓷坩埚中，70 ℃烘干至恒重，加入10 mL HNO3和0.5 mL HClO4，摇匀过夜，在电热板上缓慢加热消煮至清亮，用超纯水定容至50 mL。样品中的As用电感耦合等离子体质谱仪（ELAN DRC-e）测定，植物样品分析所用试剂均为优级纯，并采用国家标准参比物质（植物：GBW-07403）进行分析质量控制，分析误差均在允许范围内。

同步辐射X荧光射线微束激发三七样品的能量数据，使用X射线能量分析软件PyMCA进行荧光数据处理，结果通过OriginPro8.0软件绘制砷元素分布图。植株各部位亚细胞组分中砷的含量通过SPSS17.0软件进行相关分析。

三七根部、茎部和叶片横切面上元素的荧光吸收光谱分析结果见图 1。图中绿色至红色依次表示检测到元素的荧光强度由弱到强，说明检测区域砷元素相对含量由低到高。图 1左侧A、C、E对应的是高砷浓度As 50 mg·L^-1的三七叶片、茎部和根部砷元素荧光强度分布图，右侧B、D、F对应的是高砷添加外源磷素As 50 mg·L^-1+P 100 mg·L^-1的三七叶片、茎部和根部的砷元素荧光强度分布图。

图 1 不同处理三七各部位横切片中砷元素荧光分布图 Figure 1 X-ray fluorescence microscopy（XRF） maps of arsenic concentrations in transverse sections of different parts of P. notoginseng under different treatments

图选项

从高砷处理的砷元素荧光分布图可以看到，砷元素在叶片中检测强度非常弱，峰值为6.78，说明砷元素的含量很少；在茎部出现砷元素的荧光强度增高，峰值达27.8；根部也同样出现检测荧光强度较高的区域，且分布均匀，但峰值为13.66（约为茎部峰值的1/2），说明三七茎部和根部的砷元素含量都高于叶片，且茎部的砷含量最高。从高砷添加外源磷素处理的砷元素荧光分布图可以看出，叶片砷元素的荧光检测强度非常弱，平均强度仅为4.5，略低于高砷处理；茎部的砷元素检出峰值为5.8，平均强度为5；根部的荧光检测强度略高于茎部，最高达7.25。对比可知，添加外源磷素后显著减弱了茎部和根部砷元素的荧光强度，其中茎部表现最为显著；高砷处理的叶片中砷元素荧光强度仅略高于添加外源磷素试验处理。

荧光强度的高低可以反映出相应检测区域的砷元素含量的高低^{[23, 24]}。添加外源磷素可以有效降低三七根部、茎部和叶片中砷元素的含量，降低幅度分别为47%、80%和33%。

高砷处理和高砷添加外源磷素的试验处理中，三七不同部位的亚细胞组分砷累积量各不相同。从表 1可以看出，高砷处理三七各部位砷的累积量均显著高于高砷添加外源磷素处理，其中根部砷的累积量表现最高，茎部次之，叶片砷累积量最低；试验中亚细胞组分砷的总累积量均表现为根＞茎＞叶。在两组试验处理下，除高砷处理的叶片各组分砷累积量表现为细胞液＞细胞器＞细胞壁外，其余砷累积量均表现为细胞液＞细胞壁＞细胞器；三七叶片中细胞壁和细胞器两组分间的砷累积量无差异，但低于细胞液组分。分析表明三七各部位中不同亚细胞组分对砷的赋存能力不同，细胞液是三七吸收累积砷的主要亚细胞组分，其含砷量约为细胞壁和细胞器的总和。对比两组试验发现，三七生长介质中添加外源磷素后，可以显著降低各部位亚细胞组分的砷累积量：根部细胞壁、细胞器和细胞液的降幅分别为29%、49%和43%；茎部细胞壁、细胞器和细胞液的降幅分别为34%、28%和43%；叶片细胞壁、细胞器和细胞液的降幅分别为32%、52%和42%。

表 1 三七各部位亚细胞组分中砷的浓度 Table 1 Arsenic concentrations in subcellular fractions of P. notoginseng

表选项

图 2表示高砷处理和高砷添加外源磷素处理下，三七各部位亚细胞组分砷累积量占整株砷总累积量的百分比。可以看出三七各部位的砷累积量自上而下变化幅度非常大。两组试验处理的叶片亚细胞组分中砷累积量占植株总砷累积量的10%以下，茎部和根部亚细胞组分砷累积量占植株总砷累积量的百分比相差不大，但根部略高。高砷处理下根部、茎部和叶片的细胞液组分中砷累积量占植株总砷累积量分别为25%、24%和4%；高砷添加外源磷素处理下根部、茎部和叶片的细胞液组分中砷累积量占植株总砷累积量分别为23%、23%和4%。添加外源磷素对亚细胞组分砷累积量占植株总砷累积量的比例影响不大。细胞液的砷累积量约是相同处理下对应部位细胞壁和细胞器两个组分砷累积量之和，是三七吸收累积砷的关键组分。对比高砷和高砷添加外源磷素两组试验处理发现，添加外源磷素对三七各部位亚细胞组分的砷累积比例影响较小，说明三七的亚细胞组分对砷的吸收累积比例不会随着生长介质中磷元素浓度的改变而改变。

图 2 不同处理亚细胞组分的砷含量占植株总砷量的百分比（%） Figure 2 Percentages of As accumulation in various subcellular fractions over total As in P. notoginseng under different treatments

图选项

植物根部吸收的砷90%以上都会向上运输^{[25, 26]}，介质中的砷通过三七根部表皮组织进入体内并通过维管束组织转运^[27]；对土壤-三七系统重金属污染调查中，三七各部位砷累积特征表现为根条＞剪口＞块根＞叶＞茎^[10]。本研究结果显示，三七叶片中砷元素的荧光检测强度最弱，且添加外源磷素可以降低叶片中砷的含量，但降低不显著。添加外源磷素条件下，茎部砷元素的荧光强度可从27.8降至5.8，降幅达80%；根部的荧光强度从13.66降至7.25，降幅达47%；叶片中的降低幅度最低，仅为33%。三七的根部和茎部是砷的主要富集部位，添加外源磷素可以有效降低三七根部、茎部和叶片中砷的含量，其中茎部的降幅最大，叶片中砷的含量分布略有下降，但不显著。

三七主根部亚细胞组分的研究中，砷累积量为细胞液＞细胞壁＞细胞质^[27]。细胞液是三七体内的主要贮存部位，是细胞新陈代谢的主要场所^[28]，也是植物细胞代谢副产品及废物囤积的场所^[29]。细胞壁具有一定固持砷的能力，在高砷处理下，根部中21%以上的砷被固定在细胞壁上。这应该与组成细胞壁的大量羟基、羧基、醛基、氨基和磷酸基等亲金属离子的配位基团可与金属离子配位而贮存部分金属有关，从而减少金属离子的跨膜运输，降低细胞原生质体的金属浓度，从而维持细胞的正常生理代谢^{[30, 31]}。前人在对超富集植物的解毒机理研究时发现^{[32, 33]}，金属元素主要分布在细胞液液泡中，具有明显的区隔化作用。陈同斌等^[22]认为，超富集植物吸收砷时细胞壁会优先与砷结合，将砷固定在细胞壁上，限制其向内部转运，但细胞壁对砷的贮存能力有限，因此当体内砷浓度过高时，绝大部分砷都会向上转移，通过区隔化作用将砷大量聚集到（蜈蚣草）羽叶的细胞液中。本研究也得出，细胞液中砷的累积量最高，细胞壁次之，细胞器最少，但不同于超富集植物细胞液累积率可达60%以上^[22]，三七各部位的细胞液砷累积率最高仅为24%。因此，三七的细胞液组分具有一定的区隔化作用，但不能有效地减少砷对植物细胞新陈代谢的影响和毒害。添加外源磷素对三七各部位的亚细胞组分砷累积量占植株总砷累积量的比例影响不大，说明三七不同部位各亚细胞组分吸附固持砷的能力是有限的，不会随生长介质的变化而变化。

三七的根部和茎部是砷的主要富集部位，添加外源磷素可以有效降低三七根部、茎部和叶片的砷含量，降幅分别为47%、80%和33%。三七各部位亚细胞组分中，细胞液砷累积量最高，细胞壁次之，细胞器最少；三七茎部和根部细胞液组分砷累积量占植株总砷累积量的比例最高为24%，具有一定的区隔化作用，但不能有效地减少砷对植物细胞新陈代谢的影响和毒害。添加外源磷素对三七各部位的亚细胞组分砷累积量占植株总砷累积量的比例影响不大。

致谢：本研究工作得到北京正负电子对撞机国家实验室BSRF的4W1B应用微束光束线站的支持。