近年来，我国畜禽养殖业迅速发展，集约化养殖过程中，为促进畜禽生长和预防疾病，含Cu、Zn等重金属的饲料添加剂大量使用，导致这些重金属在畜禽粪便中残留浓度较高^{[1, 2, 3, 4, 5]}。据统计，北京、江苏等7省、市猪粪中的Cu、Zn含量普遍较高，最高浓度分别达到了1591、8710 mg•kg^-1[6]。发酵床养猪作为新兴生态养殖模式，其对环境影响尤其是重金属积累和残留影响受到普遍关注^{[7, 8, 9]}。李买军等^[7]研究表明，与传统养殖方式相比，发酵床养殖对周边土壤重金属污染较小。重金属的生物有效性不仅与其总量有关，更与其活性形态密切相关^[10]。重金属在土壤中的不同形态分布，直接影响重金属在土壤中的迁移、转化以及对生物的毒性。当猪粪中的重金属作为“外源”污染物进入土壤后，其迁移能力及生物可利用性不仅与其在粪便中的化学形态密切相关，还与土壤及粪便的理化性状密切相关。索超^[11]和熊雄等^[12]的研究均表明，猪粪堆肥过程中形成的腐殖质等稳定的有机质，可以吸附污泥中的重金属，是降低重金属污染风险的经济有效的途径。

目前畜禽粪便中重金属的含量以及施用畜禽粪便后对菜园土壤中重金属积累的影响已有一些研究报道^{[13, 14, 15]}，对腐殖质与重金属的作用机理已经有较全面的研究，但不同预处理猪粪施用对土壤中胡敏酸(HA)含量和重金属活性变化以及HA对重金属分配特性影响的研究鲜见。HA结合态重金属含量在该重金属总量中的分配比例可以客观地说明固相腐植酸对重金属的活性效果^[16]，而针对高床生态养猪的发酵床废弃垫料进入土壤后对重金属分配与积累的影响及其农用环境安全性评价仍少有研究。鉴于此，本文通过室内模拟试验，比较研究了施用3种不同预处理的高铜、高锌猪粪过程中菜园土壤中HA含量以及重金属在腐植酸中的分配特性，以期了解施用畜禽粪便后土壤中重金属在土壤中的活性状态、迁移能力、生物有效性，并利用猪粪长时间堆肥过程中形成的复杂有机质与微生物的相互作用及其形成的腐殖质等稳定的有机质来吸附、固定重金属，降低重金属的生物有效性，为有效降低猪粪便及发酵床废弃物中重金属污染风险提供科学依据，因而对于制定合理的猪粪预处理及其还田模式、维护区域农田环境安全具有重要意义。

供试土样取自华南农业大学生态农场 0~20 cm 的菜园土层，土壤母质为河流冲积物。3种不同预处理猪粪分别是新鲜猪粪、堆肥、干式发酵床废弃垫料，均取自同一大型养猪场。土壤和各处理猪粪经风干后过2 mm 筛并混匀，分别用塑料袋密封备用。供试土壤和猪粪的基本理化性质见表 1。

表 1 供试土壤和不同预处理猪粪的基本理化性状 Table 1 Basic properties of soil and swine manures

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称取土壤350 g装于500 mL的玻璃瓶中，分别将3种不同预处理猪粪与土壤充分混匀，保持水分含量为田间最大持水量的70%，用Parafilm封口膜封口，在25 ℃下进行培养。试验共设4个处理：按90.36 t•hm^-2施肥水平(40.0 g•kg^-1土)分别施用风干新鲜猪粪(FM1)、风干堆肥猪粪(FM2)、风干干式发酵床猪粪(FM3)以及不施任何肥料的对照组(CK)。各处理重复4次。试验共培养30 d，分别在第0、10、20、30 d分4次取土样，风干磨碎过100目筛，保存备用。

土壤pH测定用电位法(水土比 2.5：1)；土壤胡敏酸采用土壤-腐殖质组分的测定-重铬酸钾氧化法(F-HZ-DZ-TR-0048)；土壤重金属总量消煮采用浓硝酸+高氯酸+氢氟酸消煮法^[17]；土壤中Cu、Zn水溶态和HA结合态分级和提取根据腐植酸存在形态和在不同pH下的溶解性，采用H₂O和0.1 mol•L^-1 Na₄P₂O₇+0.1 mol•L^-1 NaOH溶液作为提取剂^[16]，并参考He等^[18]和Hsu等^[19]的连续提取法，滤液中重金属含量采用原子吸收分光光度法测定(KIIM6型原子吸收分光光度计)。每个处理设3个重复，取平均值作为最终结果。为保证试验准确性，同时加入标准样品测定，加标回收率为92%~102%。具体提取步骤^{[17, 18, 19]}如下：

(1)水溶态：准确称取过0.25 mm筛的土壤样品 2.000 0 g于50 mL聚乙烯离心管中，加入30 mL蒸馏水，25 ℃水浴振荡24 h，离心20 min(4000 r•min^-1)，取上清液，残留物用适量蒸馏水洗涤，再次等速离心10 min，合并2次上清液定容至25 mL，待测。

(2)HA 结合态：向上一级残留固体中加入20 mL 0.1 mol•L^-1 Na₄P₂O₇+0.1 mol•L^-1 NaOH溶液，操作步骤同水溶态，得到重金属的HA结合态。

土壤pH是影响土壤中重金属迁移转化的重要因素。图 1是不同预处理猪粪对土壤pH值的影响。施用3种不同预处理猪粪后，土壤pH均显著增加，其中FM1和FM2处理下pH上升相对较高。随着时间的推移，pH均先升高后降低。

不同字母代表Duncan's多重比较差异性显著(P < 0.05)。下同 Bars with different letters show Duncan's significant differences at P < 0.05. The same as below 图 1 施用不同预处理猪粪对土壤pH动态变化的影响 Figure 1 Dynamic effects of different pretreated swine manures on soil pH

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土壤中HA也是影响土壤中重金属迁移转化的重要因素。图 2是不同预处理猪粪对土壤中HA含量的影响。施用3种不同预处理猪粪后，土壤中HA含量均显著增加，且不同预处理猪粪间差异显著(P < 0.05)，其中FM1处理下HA含量增加最多，FM2次之。随着时间的推移，HA的含量均显著下降。施用3种不同预处理猪粪后菜园土壤的pH显著升高，主要是因为3种不同预处理猪粪均含有丰富的有机质，且显著高于土壤。随着时间的推移，有机质逐渐降解，导致土壤HA相应降低。

图 2 不同预处理猪粪对土壤HA含量的影响 Figure 2 Dynamic effects of different pretreated swine manures on HA in soil

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图 3是施用不同预处理猪粪后菜园土壤中Cu、Zn的含量。施用3种不同预处理猪粪后，土壤Cu、Zn均显著增加，不同预处理猪粪间差异不显著(P>0.05)。FM1、FM2、FM3处理下，土壤中Cu的含量分别增加了30.26%、20.74%、33.61%，Zn的含量分别增加了11.31%、16.81%，22.57%，其中，FM3处理下土壤中Cu、Zn含量增加最为显著。由此可见，施用含过量Cu、Zn的不同预处理猪粪后，土壤中Cu、Zn的含量会显著增加。

图 3 施用不同预处理猪粪后菜园土壤中Cu、Zn的含量 Figure 3 Soil Cu and Zn concentrations in treatments with different pretreated swine manures

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图 4是猪粪施入菜园土壤后土壤中两种不同形态Cu浓度的变化。不同预处理猪粪的施入显著增加了菜园土壤中两种不同形态Cu的浓度，其中，FM1处理下土壤中水溶态和HA结合态Cu的浓度均最高。CK处理下，两种不同形态Cu的浓度随时间变化差异性不显著(P>0.05)。不同预处理猪粪处理下，土壤水溶态Cu的浓度变化均呈先降低后趋于稳定的趋势，但不同预处理猪粪间差异显著(P < 0.05)，试验第30 d，FM1、FM2、FM3处理下水溶态Cu的浓度相对于试验第1 d分别减少了33.09%、8.38%、27.56%。HA结合态Cu的浓度随着时间的推移显著升高，且不同预处理猪粪间差异显著(P < 0.05)，试验第30 d，FM1、FM2、FM3处理下HA结合态Cu的浓度相对第1 d分别增加了2.62%、21.38%、7.74%。

图 4 不同预处理猪粪施入菜园土壤后土壤中水溶态Cu和HA结合态Cu浓度的动态变化 Figure 4 Changes of water soluble Cu and HA-Cu over time in swine manure-amended vegetable soil

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图 5是猪粪施入菜园土壤后土壤中两种不同形态Zn浓度的变化。不同预处理猪粪的施入第1 d，各处理水溶态Zn的浓度差异显著(P < 0.05)，其中FM3处理下土壤中水溶态Zn的浓度增加了45.54%，而FM1、FM2分别减少了10.22%、67.53%。由图 5a可见，3种不同预处理猪粪处理下，水溶态Zn的浓度在试验过程中均随时间的变化而逐渐降低，而CK处理下水溶态Zn的浓度先下降后上升，且不同处理间差异显著(P < 0.05)。第30 d，CK、FM1、FM2、FM3处理下水溶态Zn的浓度相对于第1 d分别减少了8.29%、70.46%、88.92%、52.58%。由图 5b可见，不同预处理猪粪施入第1 d，相对于CK，FM1、FM2、FM3处理土壤中HA结合态Zn分别增加了24.50%、39.88%、12.68%，其中FM2对HA结合态Zn浓度的增加最为显著。HA结合态Zn的浓度变化呈先显著增加后逐渐下降趋势。第30 d，CK、FM1、FM2、FM3处理下 HA结合态Zn的浓度相对于第1 d分别增加了39.39%、52.99%、44.46%、46.02%。

图 5 不同预处理猪粪施入菜园土壤后土壤中水溶态Zn和HA结合态Zn浓度的动态变化 Figure 5 Changes of water soluble Zn and HA-Zn over time in swine manure-amended vegetable soil

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HA 结合态重金属在重金属总量中所占比例可以表明固相腐植酸对重金属活性的影响效果^[17]。图 6是不同预处理猪粪施用后HA结合态Cu的分配比例变化。CK和FM3处理下，HA-Cu含量占Cu总量的比例随时间变化差异不大(P>0.05)，而FM1和FM2处理下，HA-Cu含量占Cu总量的比例随着时间的推移显著性增加，第30 d与第1 d相比，其比例分别增加了12.67%、21.23%，说明FM2对Cu的活性影响最大，FM1次之，FM3最差。

图 6 不同预处理猪粪施用后HA结合态Cu分配比例变化 Figure 6 Changes in HA-Cu percentages over time in swine manure-amended vegetable soil

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图 7显示不同处理下HA-Zn占Zn总量的比例变化均呈先降低后升高的趋势，且不同处理间差异显著(P < 0.05)。第30 d与第10 d相比，CK、FM1、FM2、FM3处理下HA-Zn含量占该种重金属总量的比例分别增加了1.30%、9.68%、21.90%、9.74%，其中FM2处理下，HA-Zn占Zn总量的比例变化较显著(P < 0.05)，说明FM2对Zn的活性影响最大。试验第30 d时，HA-Zn含量占该种重金属总量的比例均低于第1 d，而HA-Cu含量占该种重金属总量的比例均高于第1 d，表明Cu易与HA结合，HA对Cu的固定能力强于Zn。

图 7 不同预处理猪粪施用后HA结合态Zn分配比例变化 Figure 7 Changes in HA-Zn percentages over time in swine manure-amended vegetable soil

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本试验所用的几种不同预处理猪粪中，风干新鲜猪粪和干式发酵床废弃垫料中Cu、Zn含量相对较高，堆肥中Cu、Zn含量相对较低，但三者Cu、Zn含量均超标。施用后，土壤中Cu、Zn积累量相对较高，长期使用对植物生长和农产品质量可能存在风险性。堆肥过程中，有机质不断被降解，重金属含量相对浓缩，导致堆肥腐熟样品中具有较高的重金属含量^[20]。发酵床垫料中的重金属主要来源于猪粪尿，随着垫料使用时间的增加，垫料内重金属不断积累^[9]。李买军等^[7]研究表明，在养殖过程中发酵床垫料中 Cu、Zn、Cr、Pb随时间的推移有明显的累积，且在0~20 cm和20~40 cm垫料层的累积较为明显，由于发酵床养殖方式将绝大部分的污染物累积在垫料层，与传统养殖方式相比，该方式对环境影响较小。当土壤重金属含量较高时，可以根据土壤重金属的形态转化规律采取一定措施，如在土壤中施用石灰提高pH和施用有机质以增加土壤有机质含量等，使重金属向相对较稳定的形态转化，降低重金属的生物有效性，从而减轻对植物的毒害。

本试验中，施用3种不同预处理猪粪初期菜园土壤pH显著升高，主要是因为3种不同预处理猪粪呈碱性，pH比土壤高得多，且含有丰富的腐殖质，其中新鲜猪粪和堆肥的pH、有机质含量相对较高。在整个试验过程中，不同处理下，pH的变化均呈先升高后降低的趋势，HA含量均呈下降趋势。在施肥初期，土壤中有机酸分解，氨氮产生，使得pH 开始上升。随着时间的变化，有机质逐渐降解，腐殖质含量不断降低，HA含量也逐渐降低。此外随着时间的推移，在有机质降解过程中有机质官能团会分离出H+^{[21, 22]}，从而导致土壤pH逐渐下降。

pH是改变重金属吸附-解吸-沉淀-溶解平衡的主要因素，通常，重金属的吸附和沉淀作用随pH上升而愈加明显，有机质一方面通过增加土壤pH值来降低土壤中重金属的有效性，另一方面通过与腐殖质的络合作用来降低重金属有效性^{[23, 24, 25, 26]}。不同预处理猪粪中含有丰富的有机质，施用后会使菜园土壤中HA含量增加和pH升高，从而增加了HA结合态重金属的含量。在开始阶段，土壤中pH升高、有机质含量增加，有利于交换态的Cu、Zn向结合态等较稳定的形态转化，当伴随着有机质的分解pH下降时，则可能导致结合态的重金属溶解，使得金属离子被释放出来，从而增加其活性和迁移性^[27]。重金属的固定和溶解是相互可逆的两个过程，最终方向决定于两个过程的强弱对比，而这又可能和土壤的理化性质以及猪粪的差异有关。

本试验中，CK处理下两种不同形态Cu、Zn的浓度变幅基本不大，表明土壤处于一种相对稳定的状态。3种不同预处理猪粪处理下，土壤水溶态Cu、Zn浓度均呈下降趋势，说明随着时间的推移，水溶态的Cu、Zn会向其他比较稳定的形态转化。HA结合态Zn的浓度短期内显著上升，可能是由水溶态Zn转化而来，随后又开始下降，则可能由于HA和Zn亲合力不强，随着时间的进一步延长，HA结合态Zn经络合、沉淀等作用转化为更稳定的铁锰氧化物结合态(铁锰氧化物结合态是重金属被土壤中氧化铁锰或粘粒矿物的专性交换位置吸附或共沉淀而成)，其稳定性较强。HA结合态Cu的浓度随时间的变化显著增加，一方面由水溶态Cu转化而来，另一方面与HA对Cu具有较强的亲合力有关。不同腐殖质组分中，主要是羧基、酚羟基起络合作用，且在酸性条件下，羧基的络合起主要作用，而在碱性条件下则是羧基和酚羟基共同作用。在络合物的稳定性方面，HA强于腐植酸，腐殖质-金属络合物稳定性为Cu>Zn，而Zn主要与腐植酸结合^{[28, 29, 30]}。此外，腐殖质对金属的络合强度受 pH、腐植酸的性质等因素影响，分子量也可能是影响因素之一。本试验研究结果表明堆肥对土壤中Cu、Zn的活性作用最好，且HA与Cu亲和力大于Zn，Zn比Cu具有更强的潜在迁移性。

试验过程中，不同预处理猪粪处理下，土壤pH变化呈先上升后下降的趋势，胡敏酸含量逐渐下降，其中风干堆肥处理下pH上升最显著，风干新鲜猪粪处理下土壤胡敏酸含量增加最显著。此外，干式发酵床废弃垫料的施用对土壤中Cu、Zn积累量影响较显著。

不同预处理猪粪处理下，土壤水溶态Cu浓度均呈先下降后变化不显著的趋势，胡敏酸结合态Cu浓度随着时间的变化显著升高；水溶态Zn浓度均随时间的变化逐渐下降，胡敏酸结合态Zn的浓度变化呈先增加后下降的趋势；胡敏酸结合态Cu、Zn含量占对应重金属总量的比例随着时间的推移均有所增加。风干堆肥处理对Cu、Zn的活性下降影响最大，胡敏酸对Cu的固定能力强于Zn。